TÉCNICAS DE CONSERVAÇÃO DE FUNGOS FILAMENTOSOS PRODUTORES DE CELULASES

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1 TÉCNICAS DE CONSERVAÇÃO DE FUNGOS FILAMENTOSOS PRODUTORES DE CELULASES N. T. FEITOSA 1, F. A. SANTOS 1, P. M. V. de SENA 1, A. L. C. CARDOSO 1, D. J. N. de MELO 1 e S. F. M. SANTOS 1 1 Universidade Federal da Paraíba, Centro de Tecnologia, Departamento de Engenharia Química para contato: natanetavars@hotmail.com RESUMO A garantia de sobrevivência de culturas bem como a conservação de suas características morfológicas, fisiológicas e genéticas é primordial na adequação de métodos de preservação, porém não existe uma fórmula ideal ou universal para essa conservação. Desta forma a escolha de um método de manutenção deve ser baseada nas características do material biológico em estudo, assim como nas vantagens e desvantagens de cada técnica disponível. O presente trabalho teve como objetivo avaliar métodos de conservação de fungos isolados do solo da indústria sucroalcooleira, selecionados como produtores de celulases. As metodologias avaliadas foram: repique periódico, manutenção em óleo mineral, areia estéril e água destilada estéril. Os fungos utilizados foram: FSDE 6, FSDE 7, FSDE 15, FSDE 16, FSP 1, FSP 10 e FTF 2.Os resultados obtidos demonstraram que todos os métodos, com exceção da conservação em areia utilizando a suspensão de esporos, e o repique feito em tubos de ensaio, são eficientes. 1. INTRODUÇÃO Os fungos filamentosos secretam eficazes enzimas no meio ambiente. As enzimas são macromoléculas proteicas responsáveis pela aceleração das reações químicas que mantem e regulam os processos vitais. Elas podem ser de origem animal, vegetal e microbiano (Fernandes, 2009). Celulases são enzimas que constituem um complexo capaz de atuar sobre materiais celulósicos, promovendo sua hidrólise. Estas enzimas são biocatalisadores altamente específicos que atuam em sinergia para a liberação de açúcares, dos quais glicose é o que desperta maior interesse industrial, devido á possibilidade de sua conversão em etanol (Castro e Pereira Jr., 2010). Na natureza, existe uma grande variedade de microrganismos que produzem celulases, mas apenas alguns são capazes de degradar a celulose natural (Ruegger, 2004). A importância da manutenção e principalmente preservação de microrganismos caracteriza-se como reflexo da necessidade de utilização de organismos ou espécimes a qualquer momento, quer para fins experimentais, didáticos, industriais ou estudos comparativos (Sola et al.,2012). A finalidade da preservação é manter as culturas em estado

2 viável, sem mudanças morfológicas, fisiológicas ou genéticas, assim como manter sua completa viabilidade e estabilidade (Moriwaki et al., 2009). Diversos métodos vêm sendo empregados para preservação de fungos, porém, em virtude da biodiversidade destes microrganismos, não existe uma técnica padrão que seja capaz de preservá-los de forma adequada e generalizada (Girão et al.; 2004). A escolha do método de manutenção mais adequado deve ser baseada pelas características do agente em estudo, assim como pelas vantagens e desvantagens de cada técnica disponível (Sola et al., 2012). O presente trabalho teve como objetivo avaliar técnicas de conservação de fungos filamentosos produtores de celulases. Foram avaliadas as metodologias de: repiques periódicos em meio BDA, conservação em óleo mineral, água destilada estéril e areia estéril. 2. METODOLOGIA 2.1. Micro-organismos Foram utilizados os fungos: FSDE 6, FSDE 7, FSDE 15, FSDE 16, FTF 2, FSP 1, e FSP 10, cedidos pelo Prof. Dr. Demetrius Antônio Machado de Araújo do Centro de Biotecnologia-UFPB, tendo sido isolados do solo de descanso do plantio de cana-de-açúcar, da torta de filtro e do solo plantado com cana-de-açúcar de uma usina, localizada no município de Santa Rita, no estado da Paraíba, pela aluna do Programa de Pós Graduação em Biotecnologia, (Renorbio), Laís Campos Teixeira de Carvalho Obtenção dos Esporos Os fungos em estudo foram cultivados em placas de Petri com meio Agar Batata Dextrose (BDA), composto por Infusão de Batatas (200g/L), Dextrose (20g/L) e Agar (15g/L), conforme método dos repiques periódicos. Após a obtenção dos esporos, as técnicas de conservação foram executadas, e a partir destas, fez-se um novo cultivo em estado sólido para verificação da viabilidade. Vale ressaltar que todos os métodos foram realizados em capela de fluxo laminar com presença de chama, após assepsia com álcool 70% e Luz UV (20 minutos) Métodos de Conservação Repique periódico em meio BDA: O repique periódico consiste na inoculação do microrganismo em meio apropriado, incubação em ambiente propício à multiplicação e armazenamento em baixas temperaturas (Sola et al., 2012). O meio utilizado foi o Agar Batata Dextrose (39g/L), sendo o mesmo dissolvido em água destilada, fervido em micro-ondas e esterilizado em autoclave durante 20 minutos a 121 C. Em seguida, adicionou-se10 ml do meio às placas de Petri, com 7 cm de diâmetro, e aos tubos de ensaio, com 15 cm de altura e 1,5 cm de diâmetro. Os tubos foram mantidos inclinados. Após resfriamento e solidificação do meio, com o auxilio da alça de platina,

3 fragmentos dos fungos foram adicionados ao meio. Por fim, as placas e os tubos foram levados para estufa a 37 C, durante 7 dias, e em seguida armazenados em refrigerador. Óleo mineral: Este método consiste na adição de uma camada de óleo mineral esterilizado sobre uma cultura, a fim de limitar a quantidade de oxigênio disponível (Sola et al., 2012). Em relação à escolha do óleo mineral, levou-se em consideração, as características citadas por SOLA et al. (2012). Dessa forma, o óleo utilizado foi a vaselina, que é um dos óleos mais indicados para a conservação de microrganismo em curto prazo, a vaselina foi esterilizada em estufa a 170 C por duas horas. Esse método previne a desidratação do fungo e diminui a sua atividade catabólica e seu crescimento, porém o risco de contaminações e o aparecimento de microrganismos mutantes adaptados ao meio não podem ser excluídos (Lalaymi, 2014). Após a adição de 5 ml do meio BDA aos vidros de penicilina de 10 ml, os mesmos foram esterilizados em autoclave durante 20 minutos a 121 C. Em seguida, os recipientes foram mantidos inclinados, até o resfriamento. Os esporos foram transferidos das placas para os vidros com auxílio de uma alça de platina. Os recipientes foram vedados com algodão e incubados a temperatura ambiente durante 6 dias, para crescimento dos fungos. Posteriormente, sobre o fungo crescido, a camada de óleo foi inserida até cobrir toda superfície do meio. Os vidros foram lacrados e armazenados em refrigerador. Água destilada estéril: A preservação em água destilada, também conhecida como método de Castellani, consiste em armazenar pequenos discos do fungo com meio em frascos de vidro contendo água destilada esterilizada (Passador et al., 2012). Foram adicionados 6 ml de água destilada aos vidros de penicilina de 10 ml, e em seguida os mesmos foram levados para autoclave a 121 C durante 20 minutos. Pequenos discos do fungo com meio foram acrescentados aos recipientes, sendo esses lacrados e armazenados em refrigerador. Solo ou areia estéril: Segundo Moriwaki et al. (2009), este método consiste em adicionar suspensão de células em solo submetido à esterilização. A areia utilizada foi retirada da praia de Cabo Branco, localizada em João Pessoa, no estado da Paraíba. Em um erlenmeyer, o solo foi esterilizado durante 30 minutos a 121 C por quatro vezes consecutivas, com intervalos de 48 horas. Em seguida, a areia foi adicionada aos tubos de ensaio, sendo novamente esterilizada. Inicialmente, preparou-se a suspensão dos esporos, adicionando água destilada, previamente esterilizada, aos cultivos. Com o auxilio da alça de platina, fez-se a mescla entre a água e os esporos. Após a formação da suspenção, acrescentou-se 0,5 ml da mesma em cada tubo previamente preparado. Posteriormente, adicionou-se uma pequena porção de areia estéril em outros cultivos. Em seguida, a mistura (areia/esporos) foi inserida em novos tubos. Todos os recipientes foram mantidos a temperatura ambiente.

4 3. RESULTADOS E DISCUSSÕES 3.1. Repique Periódico em Meio BDA O repique feito em placas de Petri apresentou resultados satisfatórios para todos os fungos e, como citado no trabalho de PASSADOR et al. (2010), os mesmos foram realizados em intervalos de aproximadamente três meses, com a finalidade de que não ocorra o consumo total do substrato e o acúmulo exagerado de substâncias que se comportam como agentes mutagênicos. A Figura 1 apresenta os fungos analisados crescidos em placas de Petri com meio BDA. Figura 1 Fungos crescidos em meio BDA (Placas de Petri). Conforme mostra a Figura 2, o repique feito em tubos de ensaio não alcançou resultados satisfatórios, dessa forma, os mesmos foram descartados. Figura 2 Repique periódico em meio BDA (Tubos de ensaio) Óleo Mineral Esta técnica se divide em duas etapas. A primeira se baseia na metodologia do repique periódico em tubos de ensaio, mas ao invés dos tubos, foram utilizados vidros de penicilinas.

5 Após a adição dos fragmentos ao meio, os recipientes não foram imediatamente lacrados, mas sim fechados com algodão, com a finalidade de evitar que ocorra insuficiência de oxigênio, o que comprometeria o crescimento dos fungos. Os recipientes foram mantidos a temperatura ambiente para o crescimento dos fungos, e antes que os mesmos fossem levados para o refrigerador, a camada de óleo foi adicionada, sendo essa, a segunda parte da metodologia, podendo ser realizada somente depois que se obtém um satisfatório crescimento dos fungos. O acréscimo do óleo mineral, para ambos os fungos, foi realizado 6 dias após a adição dos esporos ao meio. Figura 3 Conservação em óleo mineral (crescimento dos fungos). Figura 4 Conservação em óleo mineral (adição do óleo) Água Destilada Estéril Também conhecida como o método de Catellani, esta técnica é bastante simples, prática e de baixo custo. Como citado no trabalho de PASSADOR et al. (2010), este procedimento pode ser aplicado para a conservação de uma variedade de gêneros e espécies de fungos, necessitando apenas de água destilada e de um pequeno espaço físico para o armazenamento dos frascos Areia Estéril Figura 5 Conservação em água destilada estéril. Para a execução da metodologia, a areia foi devidamente esterilizada em autoclave e a suspensão dos esporos foi preparada. Após a formação da mesma, adicionou-se1ml em cada

6 tubo preparado anteriormente. O resultado não foi o esperado, pois a areia ficou bastante úmida, com isso, os tubos foram descartados e uma nova tentativa foi executada, na qual foi adicionada 0,5 ml da suspensão aos tubos. Não houve mudança significativa no resultado final. Diante dos resultados não satisfatórios utilizando a metodologia citada anteriormente, fez-se necessário a modificação da mesma. A suspensão foi substituída pela mistura entre a areia e os esporos. Ao final de ambos os processos, os tubos foram mantidos a temperatura ambiente. Figura 6 Conservação em areia estéril (suspensão de esporos). Figura 7 Conservação em areia estéril (areia + esporos). Após manter os esporos conservados em óleo mineral, água destilada estéril e areia estéril, fez-se um novo cultivo em placas de Petri com meio BDA. Dessa forma, analisando o crescimento dos fungos, cada técnica pode ser avaliada. O tempo de conservação dos esporos em água destilada estéril, até ser feito um novo cultivo, foi de exatamente um mês, já para os métodos de óleo mineral e areia estéril, o tempo foi um pouco menor, totalizando três semanas. As placas de Petri com os novos cultivos foram mantidas a temperatura ambiente durante 5 dias e em seguida armazenados em refrigerador. Há diversos métodos que são aplicados na conservação de microrganismos. Para a escolha da técnica, é fundamental a analise da mesma, levando em consideração as vantagens e desvantagens. O principal requisito é a eficiência, porém, o custo e o tempo de cada metodologia podem influenciar bastante na escolha. No estudo realizado, foram avaliadas algumas técnicas de conservação em determinados fungos. Todas elas, com exceção da conservação em areia estéril utilizando a suspensão de esporos e o repique em meio BDA feito em tubos de ensaio, se mostraram eficazes, como pode ser verificado nas figuras abaixo. Entre as metodologias que comprovaram sua

7 eficiência, pode-se concluir que, a conservação em água destilada é a mais viável, devido à praticidade e baixo custo. Figura 8 Novo cultivo em estado sólido após conservação em água destilada estéril. Figura 9 Novo cultivo em estado sólido após conservação em óleo mineral. Figura 10 Novo cultivo em estado sólido após conservação em areia estéril, utilizando a suspensão de esporos. Figura 11 Novo cultivo em estado sólido após conservação em areia estéril, utilizando a mescla entre areia e esporos.

8 É evidente que o desempenho obtido em cada método não pode ser generalizado, pois há uma grande variedade de microrganismos, o que impossibilita a obtenção de uma técnica padrão para a preservação dos mesmos. Isto mostra a necessidade do desenvolvimento de métodos de conservação de fungos produtores de celulases. 4. CONCLUSÃO O repique periódico em placa de Petri apresentou resultados satisfatórios para todos os fungos em estudo, enquanto que o repique em tubo de ensaio foi ineficiente. A conservação em areia estéril feita com a mescla entre areia e esporos se mostrou eficaz, porém, quando utilizado a suspensão de esporos, os resultados não foram satisfatórios. As conservações feitas em óleo mineral e água estéril foram eficientes. A conservação em água estéril é rápida e de baixo custo. 5. REFERÊNCIAS CASTRO, A. M.; PEREIRA JR, N. Produção, propriedades e aplicação de celulases na hidrólise de resíduos agroindustriais. Quím. Nova, v.33, n.1, p , FERNANDES, A.P.; Avaliação do potencial enzimático de fungos filamentosos isolados de diferentes fontes. Dissertação, Universidade Federal de Lavras. Lavras, MG, GIRÃO, M. D. et al. Viabilidade de cepas de Malassezia pachydermatis mantidas em diferentes métodos de conservação. Rev. da Soc. Brasil. de Med. Trop., Rio de Janeiro, v.37, n.3, p , maio-junho, Disponível em: < Acesso em 23 nov LALAYMIA, I.; CRANENBROUCK, S.; DECLERCK, S. Maintenance and preservation of ectomycorrhizal and arbuscular mycorrhizal fungi. Mycorrhiza, MORIWAKI, C.; MAZZER, C.; PAZZETTO, R.; MATIOLI, G. Avaliação de métodos para manutenção e preservação de bactéria esporulada produtora da enzima CGTase. Acta Scientiarum. Health Sciences, v. 31, n. 2, p , PASSADOR, M. M.; PIRES, G. C. C.; FINATTI, D.; APARECIDO, C. C.; FIGUEIREDO, M. B. Manutenção da viabilidade e patogenicidade de culturas mantidas na micoteca Mário Barreto Figueiredo. Biológico, São Paulo v. 72, n. 1, p , RUEGGER, M. J. S.; TAUK-TORNISIELO, S. M. Atividade da celulase de fungos isolados do solo da Estação Ecológica de Juréia-Itatins, São Paulo, Brasil. Brasil. Bot., v. 27, n. 2, p , SOLA, M. C.; OLIVEIRA, A. P.; FEISTEL, J. C.; REZENDE, C. S. M. Manutenção de microrganismos: Conservação e Viabilidade. Enciclopédia Biosfera, v.8, n. 14, p. 1398, 2012.