EFEITO DA ASSOCIAÇÃO DE FLAVONOIDES SOBRE A VIABILIDADE DE LINHAGENS TUMORAIS E NÃO TUMORAL DE MAMA

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1 EFEITO DA ASSOCIAÇÃO DE FLAVONOIDES SOBRE A VIABILIDADE DE LINHAGENS TUMORAIS E NÃO TUMORAL DE MAMA P. Severo-Ramos 1, J.L. Silva², E. Fialho¹ 1- Universidade Federal do Rio de Janeiro - Instituto de Nutrição Josué de Castro - Departamento de Nutrição Básica e Experimental - CEP: Rio de Janeiro - RJ - Brasil - Telefone: (21) Fax: (21) sramospatricia2@gmail.com / fialho@nutricao.ufrj.br. 2- Universidade Federal do Rio de Janeiro - Instituto de Bioquímica Médica - CEP: Rio de Janeiro, RJ - Brasil - Telefone: (021) Fax: (021) jerson@bioqmed.ufrj.com. RESUMO Propriedades bioativas e farmacológicas de flavonoides têm sido relatadas, dentre elas com função anticâncer, mas seus mecanismos de ação não estão esclarecidos. Neste estudo, a atividade dos flavonoides em linhagens de células tumorais e não tumorais de mama foi investigada. Células foram cultivadas utilizando técnicas padrões e a viabilidade celular foi determinada por MTT. Para demonstrar a diminuição da viabilidade após tratamento com flavonoides, células foram tratadas com diferentes concentrações de crisina e/ou quercetina durante 24h. Após, as células foram tratadas com concentração fixa de crisina e diferentes concentrações de quercetina com/sem pré-incubação. Ambos compostos inibiram a proliferação celular de maneira dose dependente. A citotoxicidade foi maior quando os compostos foram associados, sendo mais expressiva com a pré-incubação de quercetina. Quando comparados, nossos resultados demonstram que ambos flavonoides inibiram crescimento celular de modo dose dependente e pré-incubação de quercetina melhorou efeito da crisina sobre as linhagens estudadas. ABSTRACT Bioactive and pharmacological properties of flavonoids has been reported, with an anticancer role amongst them, however, its mechanisms of action are not elucidated. In this study, flavonoids activity in tumoral and non tumoral breast cells lines was investigated. Cells were cultured using standards techniques and cellular viability was determined by MTT assay. To demonstrate the decreasing viability after flavonoids treatment, cells were treated with different concentrations of quercetin and/or chrysin for 24h. After, they were treated with a fixed concentration of chrysin and different concentrations of quercetin with/without preincubation. Both compounds inhibited cellular proliferation in a dose-dependent manner. Citotoxicity was higher when the compounds were associated, being more expressive with quercetin s preincubation. Taken together, our results demonstrate that both flavonoids inhibited the cells growth in dose-dependent manner and preincubation of quercetin improved chrysin s effect over the studied cells lines. PALAVRAS-CHAVE: Câncer de mama, flavonoides, crisina, quercetina, viabilidade. KEYWORDS: Breast cancer, flavonoids, chrysin, quercetin, viability. 1. INTRODUÇÃO O câncer é caracterizado basicamente por alterações genéticas, causando divisão anormal e reprodução desregulada das células, além do desenvolvimento da capacidade de disseminação para outros tecidos que não o seu de origem. Acredita-se que a carcinogênese seja um processo biológico, descrito em três fases contínuas: a iniciação, a promoção e a progressão, conforme citado por Stratton et al.(2011). De acordo com dados disponibilizados pela Organização Mundial de Saúde (2014), o câncer é uma das principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo, com aproximadamente 14

2 milhões de casos novos e 8,2 milhões de mortes relacionadas, sendo a neoplasia de mama o tipo que mais acomete mulheres, tanto em países em desenvolvimento quanto em países desenvolvidos. Segundo Béliveau e Gingras (2007) mais de 2/3 dos cânceres humanos poderiam ser prevenidos por meio de mudanças no estilo de vida. Entre os casos de câncer relacionados a fatores ambientais, a dieta inadequada contribui em cerca de 30%. Dessa forma, muitos componentes dietéticos podem aumentar o risco de desenvolvimento da doença. No entanto, estudo realizado por Boeing et al. (2012) apresentou inúmeras evidências que provam uma relação inversa entre o consumo regular de frutas, legumes e verduras e o risco do desenvolvimento de cânceres específicos, sendo sugerida a ingestão de, pelo menos, 5 porções de vegetais por dia. No entanto, é necessária uma avaliação dos mecanismos bioquímicos e fisiológicos dos nutrientes e/ou compostos bioativos presentes nos alimentos vegetais que estejam associados à redução do câncer para que, estes sejam testados em ensaios de intervenção em humanos. Dentre estes compostos presentes nas frutas e hortaliças, há a quercetina, o flavonol mais comumente encontrado nos alimentos, principalmente na cebola e na maçã, e a crisina, uma flavona, encontrada no mel e própolis, segundo Huber et al.(2008) e Medić-Šarić et al.(2011). Estudo realizado por Dorta et al.(2008) mostrou associação entre a quercetina e a prevenção de doenças crônicas não transmissíveis devido à suas atividades antioxidantes e anti-inflamatórias. Tsimplouli et al. (2012) verificaram a ação de flavonóis sobre diversas linhagens tumorais e, dentre os resultados observados, a quercetina, na concentração de 15 µm, apresentou um efeito antiproliferativo moderado sobre a linhagem MCF-7 e induziu apoptose e alteração no ciclo celular nas demais. Apesar do pouco conhecimento acerca do metabolismo da crisina, seus efeitos benéficos têm sido bastante estudados. Foi observado no trabalho de Pichichero et al.(2011), que a crisina induz a inibição do crescimento celular e apoptose em diversos tipos de câncer, como também se mostrou um efetivo agente quimiopreventivo em experimentos com câncer renal em ratos. Além dos estudos sobre compostos bioativos isolados presentes em alimentos no combate ao câncer, uma estratégia que tem sido investigada é a associação entre esses fitoquímicos. Como normalmente possuem mecanismos de ação diferentes, a hipótese é de que poderiam agir em diversos processos bioquímicos e moleculares, promovendo assim maior ou menor sinergia. 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1. Cultura de células As células serão cultivadas utilizando técnicas padrões adaptadas de Jin et al. (2009). MCF-7 e MDA-MB-231 (linhagens tumorais) e MCF-10ª (linhagem não tumoral) Ensaio de citotoxicidade - Redução de MTT (3-(4,5 dimethyl thiazole-2yl)-2,5 diphenyltetrazoliumbromide) A viabilidade celular será determinada por ensaio de redução de MTT, adaptado de Mossman (1983) Cálculo do índice de combinação (IC) Para a análise dos compostos usados em combinação será utilizada a equação do isobolograma clássico, onde: (D)1 e (D)2 são as doses de dois compostos utilizados em combinação e (Dx)1 e (Dx)2 são as doses de dois compostos utilizados isoladamente. IC = ((D)1/(Dx)1) + ((D)2/(Dx)2) Cálculo do índice de seletividade (IS) O IS corresponde à divisão entre o IC 50 de cada composto-teste na linhagem de células normais e o IC 50 de cada composto nas linhagens tumorais. (IS=IC 50 MCF-10A / IC 50 células neoplásicas). Conforme Zingue et al.(2016), um índice de seletividade > 1,0 indica que a substância utilizada foi mais ativa nas linhagens tumorais do que na linhagem não tumoral Análise estatística

3 O nível de significância das diferenças entre as médias foi avaliado pelo método de análise estatística teste t de Student, não pareado (p <0,05) ou por análise de variância (ANOVA) seguido do teste de Tukey (p < 0,05) através do software Graphpad Prism 5 (Graphpad Software, La Jolla, CA, USA). Erro padrão foi calculado pela média de 3 experimentos independentes. 2 RESULTADOS E DISCUSSÃO Figura 1: Efeito da quercetina e crisina na viabilidade das células MCF-7 e MDA-MB- 231 em 24 horas. No ensaio de redução de MTT foi possível demonstrar que ambos os flavonoides reduziram a viabilidade nas linhagens de maneira dose dependente. Na linhagem MCF-7, apesar de apresentar diminuição na viabilidade, não foi possível realizar o cálculo de IC 50, pois os valores obtidos foram muito elevados. As células incubadas com 100 μm de crisina diminuíram significativamente a viabilidade, apresentando um IC 50 de 232,5 μm. Na linhagem MDA-MB-231, quando tratada com quercetina, uma redução significativa da viabilidade foi observada a partir da concentração de 150 μm, com um IC 50 de 415,5 μm. No ensaio realizado com crisina, esta redução foi a partir da concentração de 100 μm, apresentando IC 50 de 170 μm. Figura 2: Efeito da associação de quercetina e crisina na viabilidade das células MCF-7 e MDA-MB-231 em 24 horas. Após analisados os efeitos dos compostos isolados, sua associação foi realizada utilizando uma concentração fixa de crisina, pois este composto apresentou efeito mais acentuado nos tratamentos, e uma curva de concentração crescente de quercetina. Foi utilizada a concentração de 100 µm, pois esta foi a menor concentração a apresentar diminuição significativa nas linhagens observadas sem atingir o IC 50 calculado para ambas. Foi possível demonstrar que a associação entre os compostos reduziu a viabilidade celular de maneira dose dependente, com valores de IC 50 de quercetina de 69,4 µm na linhagem MCF-7 e de 45 µm na linhagem MDA-MB-231. Figura 3: Efeito da pré-incubação de quercetina e crisina na viabilidade das células MCF-7 e MDA-MB-231 em 24 horas.

4 % Células viáveis Depois de verificados os efeitos do tratamento com a associação dos flavonoides foi realizada a associação com pré-incubação destes compostos no período de 1 hora, mantendo a concentração fixa de crisina e variada de quercetina. Foi possível demonstrar que a pré-incubação entre os compostos reduziu a viabilidade celular de maneira dose dependente, com um IC 50 na linhagem MCF-7 de 60,6 µm de quercetina quando esta foi pré-incubada e de 49,2 µm quando a crisina foi o flavonoide pré incubado. Na linhagem MDA-MB-231, o IC 50 foi de 43,1 µm quando pré-incubada com quercetina e de 82,8 µm quando pré-incubada com crisina. Figura 4: Efeito do tratamento com quercetina, crisina e suas associações na viabilidade da célula não tumoral MCF-10A em 24 horas. MCF-10A QRC CRIS QRC + CRIS QRC (1h antes) + CRIS CRIS (1h antes) + QRC Ctrl Concentração ( M) 100 Todos os tratamentos realizados nas linhagens tumorais foram repetidos na linhagem não tumoral de mama MCF-10A, com o objetivo de verificar em quais linhagens os tratamentos apresentariam maior citotoxicidade. Como é observado na tabela 1, com os valores de IC50 de todas as linhagens utilizadas, quando realizados os tratamentos com os compostos isolados, estes foram mais citotóxicos na linhagem não tumoral, entretanto, após associados, foi possível observar uma mudança nesse padrão, com os compostos se tornando mais citotóxicos para ambas as linhagens tumorais e apresentando menor efeito na linhagem não tumoral. Nos experimentos com pré-incubação, foi observado que a quercetina pré-incubada causou maior efeito citotóxico sobre as linhagens tumorais, o que pode ser observado com a diminuição de seu IC 50. Tabela 1: Valores de IC 50 nas linhagens MCF-7, MDA-MB-231 e MCF-10A. IC50 MCF-7 MDA-MB-231 MCF-10A QRC Não calculável 415,5 µm 111 µm CRIS 232,5 µm 170 µm 110,3 µm QRC + CRIS 69,4 µm 45 µm 96,5 µm QRC (1 hora antes) + CRIS 60,6 µm 43,1 µm 99 µm QRC + CRIS (1 hora antes) 49,2 µm 82,8 µm 62,7 µm Para definir se o efeito da associação dos flavonoides seria aditivo, sinérgico ou antagônico, foi realizado o cálculo do índice de combinação e, conforme se observa na tabela 2, nas linhagens

5 tumorais, estes tratamentos apresentaram ação sinérgica, ao passo que na linhagem não tumoral, esta associação foi antagônica. Tabela 2: Índice de combinação do tratamento com quercetina e crisina com e sem pré incubação. Índice de combinação MCF-7 MDA-MB-231 MCF-10A QRC + CRIS 0,450 (Sinergismo) 0,772 (Sinergismo moderado) 1,775 (Antagonismo) QRC (1 hora antes) + CRIS 0,447 (Sinergismo) 0,725 (Sinergismo moderado) 1,797 (Antagonismo) QRC + CRIS (1 hora 0,444 0,797 1,468 antes) (Sinergismo) (Sinergismo moderado) (Antagonismo) A fim de verificar se a associação entre os flavonóides foi mais ativa nas linhagens tumorais do que na linhagem não tumoral e se as pré-incubações potencializaram a seletividade das substâncias, foi realizado o cálculo do IS dos compostos nestas células e, conforme observado na tabela 3, todos os três tratamentos apresentaram maior seletividade pelas linhagens tumorais do que a linhagem não tumoral, exceto na linhagem MDA-MB-231 no tratamento com pré-incubação de crisina, onde o tratamento foi mais ativo na linhagem não tumoral. Tabela 3: Índice de seletividade do tratamento com quercetina e crisina com e sem pré-incubação. Índice de seletividade MCF-10A/MCF-7 MCF-10A/MDA-MB-231 QRC + CRIS 1,37 1,88 QRC (1 hora antes) + CRIS 1,5 1,88 QRC + CRIS (1 hora antes) 1,23 0,81 Na literatura tem sido descrito o efeito inibitório do tratamento com quercetina e crisina sobre diversos tipos de células tumorais. Diferentes mecanismos antiproliferativos têm sido sugeridos por Sak (2014) para explicar os efeitos observados, dentre os quais a redução na formação de metabólitos inflamatórios, aumento da expressão de genes supressores de tumor, diminuição na expressão de genes do ciclo celular e indução de apoptose, assim como a diminuição na expressão de oncogenes foram observados em células de câncer tratadas com quercetina, segundo Psahoulia et al.(2007). Uma das ações da quercetina sobre a inibição do crescimento e viabilidade de diferentes linhagens tumorais tem sido através do bloqueio do ciclo celular em diferentes fases, com o local desse bloqueio diferindo de acordo com o tipo celular e a origem do tumor, segundo Rusak et al. (2005). Entretanto, conforme referido por Lee et al. (2006) os efeitos observados por este composto relacionam-se com a condição da proteína p53 destas células, proteína supressora de tumores que atua como um dos reguladores do ciclo celular mas que, quando mutada, tem sua função prejudicada. 3 CONCLUSÕES Após analisados os resultados, foi possível concluir que tanto a quercetina quanto a crisina apresentam efeito citotóxico sobre as linhagens pesquisadas, entretanto, a associação destes compostos, principalmente com a pré-incubação de quercetina, aumentou a citotoxicidade e a seletividade deles para as linhagens tumorais. 4 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

6 Béliveau & Gingras (2007). O flagelo do câncer. Em: Os alimentos contra o câncer. Editora Vozes, Rio de Janeiro, v1, Boeing, H., Bechthold, A., Bub, A., Ellinger, S., Haller, D., Kroke, A.,... & Stehle, P. (2012). Critical review: vegetables and fruit in the prevention of chronic diseases. European Journal of Nutrition, 51(6), Dorta, D. J., Pigoso, A. A., Mingatto, F. E., Rodrigues, T., Pestana, C. R., Uyemura, S. A.,... & Curti, C. (2008). Antioxidant activity of flavonoids in isolated mitochondria. Phytotherapy Research, 22(9), Huber, L. S., & Rodriguez-Amaya, D. B. (2008). Flavonóis e flavonas: fontes brasileiras e fatores que influenciam a composição em alimentos. Alimentos e Nutrição Araraquara, 19(1), Jin, S., Zhang, Q. Y., Kang, X. M., Wang, J. X., & Zhao, W. H. (2009). Daidzein induces MCF-7 breast cancer cell apoptosis via the mitochondrial pathway. Annals of Oncology, Disponível em: Lee, T. J., Kim, O. H., Kim, Y. H., Lim, J. H., Kim, S., Park, J. W., & Kwon, T. K. (2006). Quercetin arrests G2/M phase and induces caspase-dependent cell death in U937 cells. Cancer Letters, 240(2), Medić-Šarić, M., Rastija, V., & Bojić, M. (2011). Recent advances in the application of high performance liquid chromatography in the analysis of polyphenols in wine and propolis. Journal of AOAC International, 94(1), Mossman, T. (1983). Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods, 65(1-2), Pichichero, E., Cicconi, R., Mattei, M., & Canini, A. (2011). Chrysin-induced apoptosis is mediated through p38 and Bax activation in B16-F1 and A375 melanoma cells. International Journal of Oncology, 38(2), 473. Psahoulia, F. H., Moumtzi, S., Roberts, M. L., Sasazuki, T., Shirasawa, S., & Pintzas, A. (2007). Quercetin mediates preferential degradation of oncogenic Ras and causes autophagy in Ha-RAStransformed human colon cells. Carcinogenesis, 28(5), Rusak, G., Gutzeit, H. O., & Müller, J. L. (2005). Structurally related flavonoids with antioxidative properties differentially affect cell cycle progression and apoptosis of human acute leukemia cells. Nutrition Research, 25(2), Sak, K. (2014). Site-specific anticancer effects of dietary flavonoid quercetin. Nutrition and Cancer, 66(2), Stratton, M. R. (2011). Exploring the genomes of cancer cells: progress and promise. Science, 331(6024), Tsimplouli, C., Demetzos, C., Hadzopoulou-Cladaras, M., Pantazis, P., & Dimas, K. (2012). In vitro activity of dietary flavonol congeners against human cancer cell lines. European Journal of Nutrition, 51(2), Zingue, S., Cisilotto, J., Tueche, A. B., Bishayee, A., Mefegue, F. A., Sandjo, L. P.,... & Awounfack, C. F. (2016). Crateva adansonii DC, an African ethnomedicinal plant, exerts cytotoxicity in vitro and prevents experimental mammary tumorigenesis in vivo. Journal of Ethnopharmacology, 190(2016),