CAROLINA SOUSA COCHITO

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1 FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA Programa de Pós-Graduação de Clínica e Reprodução Animal CAROLINA SOUSA COCHITO INFLUÊNCIA DOS PROTOCOLOS HORMONAIS DE RECEPTORAS E DO ESTÁGIO DE DESENVOLVIMENTO DE EMBRIÕES PIV DA RAÇA GIR (Bos taurus indicus) SOBRE AS TAXAS DE GESTAÇÃO NITERÓI 2013

2 1 CAROLINA SOUSA COCHITO INFLUÊNCIA DOS PROTOCOLOS HORMONAIS DE RECEPTORAS E DO ESTÁGIO DE DESENVOLVIMENTO DE EMBRIÕES PIV DA RAÇA GIR (Bos taurus indicus) SOBRE AS TAXAS DE GESTAÇÃO Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Clínica e Reprodução Animal da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para a obtenção do Grau de Mestre. Área de Concentração: Clínica e Reprodução Veterinária Orientador: Prof. Dr. Luiz Altamiro Garcia Nogueira Coorientador: Prof. Dr. André Luis Rios Rodrigues Niterói 2013

3 2 CAROLINA SOUSA COCHITO INFLUÊNCIA DOS PROTOCOLOS HORMONAIS DE RECEPTORAS E DO ESTÁGIO DE DESENVOLVIMENTO DE EMBRIÕES PIV DA RAÇA GIR (Bos taurus indicus) SOBRE AS TAXAS DE GESTAÇÃO Aprovada em 28/06/2013 Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Clínica e Reprodução Animal da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para a obtenção do Grau de Mestre. Área de Concentração: Clínica e Reprodução Veterinária BANCA EXAMINADORA Prof. Dr. Luiz Altamiro Garcia Nogueira Orientador Faculdade de Veterinária UFF Prof. Dr. André Luiz Rios Rodrigues - Coorientador Faculdade de Veterinária UFF Dra. Clara Slade Oliveira Embrapa Gado de Leite Prof. Dr. Rodolpho de Almeida Torres Filho Faculdade de Veterinária - UFF NITERÓI 2013

4 3 DEDICATÓRIA À minha família, pelo apoio e incentivo permanente. Em especial ao meu pai, José Maria, que não conseguiu ver a finalização deste trabalho, e que mesmo nossa vida tendo sido tão desencontrada, nossos últimos dias valeram por uma vida inteira. Dedico a ele toda tensão, toda lágrima e todo mérito. Ao meu companheiro, amigo, namorido e esposo, Roberto Frank, que me acompanha por muitas primaveras e me apoia em todas as jornadas, inclusive nesta. Ao meu irmão e minha cunhada, que estavam longe e de repente apareceram na minha vida no momento mais delicado, com muito apoio e carinho. Ao meu filhinho canino Eros, que desde a época da faculdade, sempre me deu muito amor e carinho incondicional, tornando a minha vida mais feliz com a sua presença. Sem ele não saberia quão grande pode ser o amor. Aos professores que me deram suporte na finalização desse trabalho. Ao professor e orientador Luiz Altamiro, pelo convite ao mestrado e apoio na realização deste. Em especial ao professor André Rios, todo suporte didático, todo apoio moral e emocional. Toda sua tranquilidade e confiança me fizeram continuar. À minha chefa, amiga, e queridíssima Claudia Ribeiro, que além da força e apoio esteve ao meu lado acreditando na concretização dessa jornada. Às minhas companheiras de trabalho, Patrícia Lago e Clara Lins, por todo suporte e apoio dispensados. A todos os meus amigos e amigas e familiares, que compreenderam minha ausência, minha falta, minha indisponibilidade e minhas choradeiras. Em especial todas aquelas que estiveram bem próximas nesses últimos e difíceis meses, Vanessa Viscardi, Roberta Freitas, Liliane Coelho e Valeska.

5 4 AGRADECIMENTOS A Deus pela minha vida e por tudo que tenho. Aos meus pais pela educação, carinho, incentivo e apoio em todas as minhas jornadas. À minha mãe, por aturar meus momentos de mau humor, choro, desespero e cansaço. Pela motivação sempre presente. Pelo colo e carinho sempre dedicado. Agradeço ao meu marido Roberto Frank pela ajuda, apoio, suporte e por todos os afazeres domésticos que ele realizou enquanto eu estava estudando. Ao Prof. Luiz Altamiro, meu orientador, por acreditar em mim, por me orientar, pela paciência, incentivo e ensinamentos. Ao Prof. André Rios, pela ajuda indescritível, pela amizade e toda compreensão a mim dedicada. Seu jeito calmo e sereno de conversar me ajudou muito. Ao Prof. Rodolpho, pelo exemplo profissional e suporte estatístico. Agradeço por ter conhecido você e sua esposa Carla, pessoas que tenho um carinho enorme. Ao colega Júlio Moura, companheiro de graduação, pela amizade, pelo suporte técnico, pela confiança dispensada e por abrir as portas do seu local de trabalho, a Fazenda Monte Verde, fornecendo dados do todo um trabalho de sucesso real. Por todo acesso que você me proporcionou. Muito obrigada. À profª Ana Ferreira, pelo apoio e incentivo no momento mais difícil desta jornada. À família e Fazenda Santa Edwiges, por todo acesso, todo apoio e toda torcida pelo meu sucesso. Obrigada por poder encontrar as portas sempre abertas e por terem sido minha casa e família por alguns anos. À Clínica Primordia, que confiou na minha experiência veterinária para ajudar a formar famílias maiores e felizes. A todos profissionais, especialmente Dr. Isaac Yadid, Dr. Marcio Coslovsky e a embriologista Cláudia Ribeiro, muito obrigada.

6 5 Aos meus colegas de mestrado, Júlia Timponi, Gabi, Ana Paula Loureiro, Michele Saloto, Danilo Balbi, que estiveram sempre me apoiando. Por todo tempo que passamos juntos, pelos chopps e risadas que tornaram essa etapa de nossas vidas bem mais alegre e divertida. E finalmente ao meu pai... Por ter me mostrado que a vida é tão breve e que cada momento deve ser vivido hoje, sem deixar para amanhã. Por ter amado e cuidado do meu Eros em todos os momentos que não pude. A todos aqueles que de alguma maneira estiveram presentes na minha vida nesses últimos dois anos e que, direta ou indiretamente, me ajudaram a completar mais esta jornada, o meu MUITO OBRIGADA!

7 6 O perdão é um catalisador que cria a ambiência necessária para uma nova partida, para um reinício. Martin Luther King

8 7 RESUMO A grande demanda por alimentos tem impulsionado o desenvolvimento de biotecnologias que aumentem a disponibilidade de animais melhorados no mercado. Dentre essas, a produção in vitro de embriões tem sido usada como ferramenta para o melhoramento genético na bovinocultura de leite e de corte de maneira rápida e eficaz. Porém, vários são os fatores que podem afetar as taxas de concepção de receptoras em programas de TE. Neste estudo, objetivou-se avaliar em 519 transferências de embriões da raça Gir produzidos in vitro, alguns aspectos reprodutivos relacionados às receptoras e aos embriões que poderiam influenciar na taxa de concepção de receptoras mestiças aos 30 e 60 dias de gestação. As inovulações foram realizadas em receptoras com cio observado após PGF 2 α (n=236) e não observado após protocolo de TETF (n=283). Uma dose de prostaglandina foi aplicada em dia aleatório do ciclo estral e o cio foi observado nos seis dias consecutivos. O protocolo de TETF baseou-se no uso de progestágeno, estrógeno e ecg: no Dia 0, inserção de um dispositivo intravaginal de liberação de progesterona e 2 mg de benzoato de estradiol; no D8, retirada do dispositivo, administração de 400 UI de ecg e 2 ml de PGF 2 α e no D9, 1 mg de benzoato de estradiol. O D10 foi considerado o dia do cio e a TE foi realizada no dia 17 naqueles animais que apresentaram CL palpável no momento da transferência. As taxas de gestação aos 30 dias foram de: 36,7% para fêmeas sincronizadas para TETF e de 44% para aquelas com cio observado; CL grau 1 = 42,2%, grau 2 = 37% e grau 3 = 37%. Quanto aos aspectos sincronia receptora/embrião as taxas de gestação para sincronia de +1 dia, 47,3% e +2 dias, 54,3% foram diferentes (P<0,05) em relação aos demais dias de sincronia (-2, 37,5%; -1, 28,9%; 0, 35,5% e +3, 33,3%. As taxas de gestação de acordo com o desenvolvimento embrionário foram superiores (P<0,05) para os embriões em estágio de blastocisto expandido e eclodido, 54,% e 43% respectivamente, comparadas aos blastocistos iniciais 28% e os blastocistos 34%. Cios observados ou protocolos de TETF apresentam taxas de concepção semelhantes na FIV. A qualidade do CL não é um fator limitante para as taxas de concepção na FIV. As taxas de concepção aos 30 e 60 dias foram influenciadas pela sincronia +1 e +2 entre a receptora e o embrião, em relação aos dias -1, -2, 0 e +3 de sincronia. Palavras-chaves: bovino, corpo lúteo, sincronia receptora/embrião, transferência de embrião em tempo fixo, estágio embrionário.

9 8 ABSTRACT The great demand for food has driven the development of biotechnologies to increase the availability of improved animal on the market. The in vitro production of embryos has been used as a quick and effective tool for genetic improvement in dairy and beef cattle. However, there are several factors that can affect conception rates of recipients in embryo transfer programs. This study aimed to evaluate 519 embryo transfer of Gir in vitro produced, some reproductive aspects related to recipients and embryos that could influence the conception rate of crossed recipients at 30 and 60 days of gestation. The inovulations were performed in recipients after PGF 2 α administration and heat observation after fixed-time embryo transfer (FTET) protocol (n = 283). A dose of prostaglandin was applied in random day of the estrous cycle and estrus was observed for six consecutive days. FTET protocol was based on the use of progesterone, estrogen and ecg: on Day 0, insertion of an intravaginal releasing device of progesterone and 2 mg estradiol benzoate; at D8, removal of the device, administration of 400 IU ecg and 2 ml of PGF 2 α and D9, 1 mg of estradiol benzoate. The D10 was considered the day of estrus and ET was performed on day 17 in those animals showing palpable CL at the time of transfer. Pregnancy rates at 30 days were 36.7% for females synchronized to FTET and 44% for those with observed estrus, CL grade 1 = 42.2%, grade 2 = 37% and grade 3 = 37%. The pregnancy rates for synchrony of recipient/embryo were synchronizing day +1, 47.3% and day +2, 54.3% and both were different (P <0.05) compared to other days of synchrony -2, 37.5%, -1, 28.9%, 0, +3 and 35.5%, 33.3%. Pregnancy rates according to the embryo development were higher (P <0.05) for the embryos expanded blastocyst stage and hatched, 54% and 43% respectively, compared to early blastocysts 28% and blastocysts 34%. Heat observed or FTET protocols have similar conception rates in IVF. The quality of the CL is not a limiting factor for conception rates in IVF. Conception rates at 30 and 60 days were influenced by synchrony between +1 and +2 recipient and the embryo, from the days -1, -2, 0 and +3 of synchrony. Key words: cattle, corpos luteum, synchrony of recipient/embryo, fixed-time embryo transfer, embryo development.

10 9 SUMÁRIO LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS 14 1 INTRODUÇÃO 17 2 OBJETIVOS OBJETIVOS ESPECÍFICOS 19 3 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA PROTOCOLOS DE SINCRONIZAÇÃO DE CIO OBSERVADO E NÃO OBSERVADO QUALIDADE DO CORPO LÚTEO SINCRONIA RECEPTORA/EMBRIÃO ESTÁGIO DE DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO 30 4 MATERIAL E MÉTODO DELINEAMENTO EXPERIMENTAL LOCAL, CLIMA, PASTAGENS E CONTROLE SANITÁRIO DO REBANHO Doadoras de embriões Receptoras de embrião PROTOCOLOS DE SINCRONIZAÇÃO DE CIO OBSERVADO E 35 NÃO OBSERVADO 4.4 CLASSIFICAÇÃO DO ESTÁGIO DE DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO CLASSIFICAÇÃO DO CORPO LÚTEO E DETERMINAÇÃO DA SINCRONIA RECEPTORA/EMBRIÃO ANÁLISE ESTATÍSTICA 38 5 RESULTADOS e DISCUSSÃO 39

11 SINCRONIZAÇÃO DE CIO OBSERVADO E NÃO OBSERVADO QUALIDADE DO CORPO LÚTEO SINCRONIA RECEPTORA/EMBRIÃO ESTÁGIO DO DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO 47 6 CONCLUSÕES 51 7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 52

12 11 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Protocolo de transferência de embrião em tempo fixo (TETF) em receptoras bovinas com quatro manejos: (1) D0 inserção do dispositivo intravaginal de liberação progesterona e 2 mg de BE IM; (2) D8 retirada do dispositivo intravaginal de liberação progesterona, aplicação de 400 UI de ecg e 2 ml de PGF 2 α; (3) D9 1 mg de BE e (4) D17 transferência de embriões em tempo fixo.

13 12 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Número (N) e taxa de receptoras mestiças gestantes (TG) aos 30 (D30) e 60 dias (D60) de acordo com o tipo de cio, observado ou não (TETF). Tabela 2. Número (N) e percentual de receptoras mestiças transferidas de acordo com a qualidade do corpo lúteo no momento da transferência. Tabela 3. Taxa de gestação (TG) e número de receptoras mestiças prenhas (N) aos 30 (D30) e 60 dias (D60) de acordo com a qualidade do corpo lúteo no momento da transferência. Tabela 4. Percentual de gestação (%) e número de receptoras mestiças (N) de acordo com o tipo de CL e das mesmas de acordo com o tipo de cio, observado (natural/pgf 2 α) ou não (TETF). Tabela 5. Distribuição do número de receptoras mestiças prenhas (N) e taxa de gestação (TG) aos 30 (D30) e 60 (D60) dias, de acordo com número de dias após o cio (sincronia receptora/embrião). Tabela 6. Número (N) e percentual de embriões transferidos de acordo com o estágio de desenvolvimento embrionário. Tabela 7. Tabela de taxa de gestação (TG) aos 30 dias (D30) e aos 60 (D60) e número de embriões inovulados, de acordo com o estágio de desenvolvimento embrionário de embriões transferidos em receptoras mestiças. Tabela 8. Número de gestações (G) aos 30 dias em receptoras mestiças de acordo com o número de embriões transferidos (N) para cada estágio de desenvolvimento embrionário e as médias (M) dos percentuais de gestação de acordo com a sincronia e o estágio embrionário.

14 13 LISTA DE QUADROS Quadro 1. Calendário semanal com o esquema da sincronização das receptoras para a ocorrência de duas transferências durante um mês.

15 14 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS BE BVD CIDR CL Cm 2 CO 2 D0 ecg ECP E2 FIV FSH H IATF IBR IETS IGF IATF IM Km LH MG MG Ml Benzoato de estradiol Diarréia viral bovina CIDR - Controlled internal drug release Liberação controlada de drogas Corpo lúteo Centímetro quadrado Dióxido de carbono Dia zero Gonadotrofina criônica equina Cipionato de estradiol 17β estradiol Fertilização in vitro Hormônio folículo estimulante Hora Inseminação artificial em tempo fixo Rinotraqueíte Infecciosa Bovina Sociedade Internacional de Transferência de embriões Fator de crescimento semelhante a insulina Inseminação artificial em tempo fixo Intramuscular Kilômetro Hormônio luteinizante Minas Gerais Miligrama Mililitro

16 15 Ng OPU PGF PIVE P4 TE TETF UI Nanograma Ovum Pick Up Prostaglandina F Produção in vitro de embriões Progesterona Transferência de embrião Transferência de embrião em tempo fixo Unidades internacionais

17 16 1. INTRODUÇÃO Existe uma forte tendência para o aumento da participação de países em desenvolvimento para atender à crescente demanda do mercado mundial de lácteos. Dessa forma, considerando-se os valores atuais da produtividade brasileira, e ainda, a área de pastagem do país, que corresponde a cerca de 240 milhões de hectares, entende-se que são amplas as perspectivas quanto ao crescimento da produção leiteira no país (horizontal e vertical), possibilitando-se assim, significativa participação brasileira no comércio mundial de leite e derivados. E é nesse contexto que se afirma que o caminho do crescimento da pecuária leiteira no país deverá ser sustentado em sistemas de produção que privilegiem pastagens de boa qualidade e animais que se mostrem economicamente eficientes, nesse tipo de regime (MARCATTI NETO et al., 2004). Em 2011 o Brasil produziu mais de embriões bovinos, sendo 90,7% produzidos in vitro, dos quais foram transferidos a fresco. Observamos um aumento de 15,7% em relação ao total de embriões produzidos no ano de A fertilização in vitro (FIV), além de otimizar a produção de embriões por doadora, tem efeitos positivos na escala de uso, na redução de custos e na criação de novas possibilidades de aplicação da transferência de embrião na produção animal. As raças de leite foram responsáveis por 23,7% de todos os embriões produzidos em 2011, o que representa um crescimento de 27% na produção in vitro de embriões (PIVE) das raças leiteiras. Grande parte deste aumento deve-se ao número de comunicações às associações de criadores da raça Girolando, um reflexo da estruturação da associação de criadores desta raça. A FIV era associada apenas aos rebanhos elite e foi gradualmente sendo adotada pelos chamados rebanhos multiplicadores, inicialmente para produção de tourinhos de corte e recentemente para produção de novilhas para reposição em rebanhos leiteiros (VIANA, 2012).

18 17 A inseminação artificial (AI), inseminação artificial em tempo fixo (IATF), a transferência de embrião (TE), a PIVE e a FIV são biotecnologias que permitem a maximização da utilização individual com mérito genético superior promovendo assim o melhoramento animal, apresentam avanços consideráveis e têm sido extensivamente incorporadas na reprodução animal. A eficiência da PIVE ainda é baixa, com apenas 30-40% de oócitos se desenvolvendo até blastocistos, porque o ambiente in vitro não consegue mimetizar satisfatoriamente o ambiente in vivo, resultando assim em embriões com alterações morfológicas e gênicas (CAMARGO et al., 2006). Além da baixa taxa de conversão de oócitos em blastocistos, existem diversos fatores que podem influenciar e reduzir a taxa de gestação de receptoras em programas de produção de embriões in vitro e transferência. O sucesso dos programas de TE, depende de inúmeros fatores associados com o embrião e especialmente a receptora (HASLER et al., 2001; SPELL et al., 2001) ou a interação entre estes (JONES e LAMB, 2008). A disponibilidade de receptoras aptas no dia da TE, vai depender do manejo, da nutrição e do controle do ciclo estral para garantir a presença de pelo menos um CL funcional no momento da inovulação. Os maiores custos econômicos de um programa de TE são encontrados na aquisição e manutenção de receptoras. As fêmeas que emprenham na primeira TE são mais lucrativas do que aquelas que necessitam de duas ou mais e obviamente mais interessantes economicamente (LOONEY et al., 2006). A detecção de estro tem sido um fator limitante para o sucesso dos programas de TE em virtude de muitos fatores, dentre eles: tempo de observação reduzido, má interpretação dos sinais do cio, uso equivocado dos distintos dispositivos de ajuda na detecção e, menor duração deste quando as receptoras são cruzadas Bos indicus indicus (BÓ et al., 2003). Desta maneira, os programas de TETF (transferência de embrião em tempo fixo) minimizam os efeitos do estresse térmico na observação de cio, como os cios silenciosos devido a inatividade física e a manifestação noturna (FERRO et al., 2010), e aumentam a utilização de receptoras por incrementarem as taxas de aproveitamento (RODRIGUES et al., 2009). Desta forma, o incremento das taxas de aproveitamento e de concepção das receptoras é fundamental para maximizar a taxa de prenhez e, com isso, elevar o retorno zootécnico e econômico da TE. Determinando, além do maior número de

19 18 bezerros/ano, redução dos gastos com fêmeas não prenhes no rebanho (MARQUES et al., 2004). A caracterização do CL fornece informações importantes sobre o estado reprodutivo da fêmea bovina e possibilita a adequação de procedimentos de manipulação ou sincronização do ciclo estral (VIANA et al., 1999). A seleção das receptoras no dia da inovulação geralmente é realizada levando-se em consideração ao tamanho do CL à palpação transretal. Durante o ciclo estral, os níveis de progesterona (P4), refletem o crescimento, a manutenção e a regressão luteal e sua avaliação permite a associação das características morfológicas com o estado funcional (SPANO e SILVA, 1992). O CL é a principal fonte de produção de P4 que na fêmea bovina gestante é essencial para o desenvolvimento embrionário e a manutenção da prenhez por pelo menos duzentos dias de gestação (NISWENDER et al., 2000).

20 19 2 OBJETIVOS O presente estudo teve como objetivo avaliar em base de dados as taxas de gestação aos 30 e 60 dias em receptoras mestiças após 519 inovulações de embriões PIV da raça Gir. 2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Efeito do protocolo de sincronização com cio observado ou não observado; Efeito da qualidade do corpo lúteo; Efeito da sincronia receptora/embrião; Efeito do estágio de desenvolvimento embrionário.

21 20 3 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 3.1 PROTOCOLOS DE SINCRONIZAÇÃO DE CIO OBSERVADO E NÃO OBSERVADO A expressão e a detecção do comportamento de cio são cruciais para que a inseminação possa ocorrer no momento apropriado em relação à ovulação. Juntamente com a expressão de cios fracos e uma incapacidade de sua detecção o que dificulta a inseminação no momento certo, vários eventos fisiológicos podem afetar a manifestação do cio. Vacas holandesas de alta produção leiteira ( 39,5kg de leite por dia) tem um cio de curta duração (6,2h x 10,9h), tempo total de repouso menor (21,7s x 28,2s) e uma menor concentração sérica de estradiol (6,8pg ml -1 x 8,6pg ml -1 ) quando comparadas com vacas de baixa produção leiteira (< 39,5kg por dia) (LOPEZ et al., 2004). A baixa concentração de estradiol e, portanto a baixa intensidade e curta duração do estro, tem como causas as altas taxas de depuração metabólica do estradiol (SANGSRITAVONG et al., 2002) e a baixa concentração de LH (hormônio luteinizante) e IGF (fator de crescimento semelhante a insulina) provenientes do balanço energético negativo (DISKIN et al., 2003) e das condições estressantes do manejo (claudicação, mastite e calor), (DOBSON et al., 2007). Com o objetivo de superar a necessidade de observação de cio, o uso de protocolos para a sincronização do cio para a inseminação artificial em tempo fixo e/ou transferência de embriões em tempo fixo, tem sido incorporado em alguns sistemas de produção bovina (MACMILLAN, 2010; PURSLEY et al., 2012). Estudos mostram que é possível manipular com precisão a dinâmica folicular e luteal, abolindo a necessidade da observação de cio para a inseminação artificial e para a transferência de embrião (BÓ et al., 2002). A sincronização da ovulação é uma importante ferramenta principalmente quando se trabalha com IATF

22 21 (inseminação artificial em tempo fixo) ou TETF. Assim a aplicação de hormônios que possam promover um mecanismo de feedback positivo para o LH no momento final do crescimento folicular tem papel fundamental por tornar preciso o momento e o mecanismo da ovulação (PARDO, 2008). A prostaglandina F2α tem sido o tratamento mais empregado para a sincronização do estro em bovinos (ODDE, 1990). Estudos anteriores mostraram que a maturidade do CL no momento da aplicação de PGF 2 α influenciou a resposta luteolítica e que a PGF 2 α não induziu efetivamente a luteólise durante os primeiros cinco a seis dias após o estro (MOMONT e SEGUIN, 1984). Além disso, em vacas que sofreram luteólise, o estro foi detectado ao longo de seis dias (MACMILLAN e HENDERSON, 1984). Estudos mostraram que o intervalo entre o tratamento com PGF 2 α e a manifestação do estro é determinado pelo estágio de desenvolvimento do folículo dominante no momento do tratamento (KASTELIC e GUINTHER, 1991). Se a PGF 2 α for administrada quando o folículo dominante estiver na fase final de crescimento ou no início da fase estática, a ovulação ocorrerá em três a quatro dias. Por outro lado, se o tratamento com PGF 2 α for realizado no momento em que o folículo dominante estiver no meio ou no final da fase estática, a ovulação do folículo dominante da próxima onda de crescimento folicular ocorrerá após cinco a sete dias (KASTELIC e GUINTHER, 1991). Esse intervalo é reflexo do tempo necessário para que o folículo dominante da nova onda cresça e se desenvolva até o estágio préovulatório, com isso, fica evidente a necessidade do controle folicular e luteínico para a obtenção de altas taxas de prenhez em programas de IA e TE em tempo fixo, sem a necessidade de detecção do estro (BÓ et al., 2004). Geralmente, os tratamentos usados para a sincronização de receptoras consistem na administração de uma ou duas doses de PGF 2 α com intervalos de 11 a 14 dias (BROADBENT et al.,1991). Entretanto, considerando - se a ineficiência na detecção do cio e a variabilidade no intervalo de tempo do tratamento para o cio e a ovulação, somente cinquenta por cento (aproximadamente) receberão embriões sete dias depois do cio (BÓ et al., 2002). Essa situação pode apresentar maiores comprometimentos se as receptoras utilizadas forem Bos taurus indicus ou cruza Bos taurus taurus criadas a pasto (BÓ et al., 2004). Embora o uso da PGF 2 α seja efetivo e um tratamento de baixo custo, o sucesso depende exclusivamente da detecção do cio.

23 22 Quando se trabalha com embriões produzidos in vitro, a demanda de um grande número de receptoras é ainda maior porque a maioria dos embriões é transferida a fresco. Na tentativa de melhorar a sincronização de cio e aumentar o número de receptoras disponíveis para receber embriões frescos produzidos in vitro, foram desenvolvidos protocolos baseados no uso de progesterona exógena, benzoato de estradiol e gonadotrofina coriônica equina, e estes têm sido utilizados com sucesso em programas de TE em larga escala (SIQUEIRA et al., 2009). O estradiol e a progesterona são os hormônios mais utilizados nos tratamentos de sincronização da emergência da onda folicular e ovulação nas receptoras de leite e corte na América do Sul (BARUSELLI et al., 2010). O protocolo consiste na inserção do dispositivo de liberação lenta de progesterona e administração de 2mg de benzoato de estradiol (BE) no dia zero (para sincronização da emergência da onda folicular) e ainda uma dose PGF 2 α. Esta pode ser aplicada no dia zero, no dia cinco ou na retirada do dispositivo de progesterona (para garantir a luteólise). O dispositivo de progesterona normalmente é retirado no dia 8 e a ovulação é induzida pela administração de 0,5 ou 1mg de cipionato de estradiol (ECP) na hora da retirada do dispositivo de progesterona ou é feita a administração de 1mg de BE 24 horas depois da remoção do dispositivo (BARUSELLI et al., 2010). A observação do cio não é necessária, sendo o dia 10 é considerado o dia deste, e a TETF é realizada no dia 17 (RODRIGUES et al., 2010). Os resultados obtidos na taxa de prenhez por transferências são similares àqueles onde a transferência foi realizada sete dias após a observação de cio (BÓ et al., 2002). Em protocolos que utilizam ECP para induzir a ovulação, esta é administrada no dia 8, juntamente com a remoção do implante progesterona. A execução do protocolo com BE requer um manejo dos animais por quatro dias diferentes, enquanto que com substituição de BE por ECP permite a eliminação de um dia de manipulação, e assim a redução do tempo de trabalho. Sales et al. (2012) avaliaram o efeito de ambos os medicamentos para a indução da ovulação em receptoras Bos indicus em lactação submetidas a IATF. Concluíram que, apesar da maior sincronização de pico de LH nos animais que receberam BE, a sincronização da ovulação foi similar entre os grupos e com nenhum efeito sobre fertilidade dos animais expostos a um ou outro protocolo. Senedino et al. (2012) demostraram que o uso de 1 mg de BE associado com P4 em protocolos de IATF, foi efetivo na indução da atresia folicular e na sincronia da emergência de nova onda folicular.

24 23 O BE e o ECP apresentam diferentes propriedades farmacocinéticas, e ambos são considerados eficientes na indução da ovulação no gado Bos taurus indicus e Bos taurus taurus (MARINHO et al., 2012). Por ter uma meia-vida mais curta, o BE promove a emergência rápida de LH com maior amplitude e de menor duração que o ECP, resultando em emergência do LH com maior sincronia. Devido a sua baixa solubilidade, o BE é liberado mais lentamente e promove uma maior duração dos picos de LH (VYNCKIER et al., 1990). O ecg (gonadotrofina coriônica equina) é uma gonadotrofina glicoproteica de peso molecular de dáltons produzida pela placenta de equinos durante a gestação. Entre o 5 e o 35 dia de gestação na égua, as células do trofoblasto formam um tecido avascularizado chamado de cinta coriônica que circunda o concepto. No dia 35 essas células passam a invadir o endométrio e em 48 horas formam-se estruturas de 0,5 a 1,0 cm chamadas de cálices endometriais (LUNN et al., 1996). As células da cinta coriônica passam a secretar o ecg aproximadamente do 33 ao 120 da gestação (MCDOWELL et al., 1993). Quando administrado em outras espécies, o ecg liga-se aos receptores de FSH (hormônio folículo estimulante) e LH, sendo a única gonadotrofina capaz de se ligar aos dois receptores (MURPHY e MARTINUK, 1991). Este hormônio ainda é capaz de se ligar aos receptores de LH no CL, promovendo um aumento da produção de P4 (BARUSELLI et al., 2004). Devido à ação FSH, o ecg foi extensivamente usado em programas de superovulação de doadoras de embriões. Dessa forma o seu uso em programas de sincronização da ovulação para IATF e TETF tem sido cada vez maior no intuito de aumentar a eficiência desses programas (REIS, 2004). A estratégia mais comum usada para aumentar as taxas de gestação em receptoras de corte mantidas a pasto na América do Sul é a adição de 400 UI de ecg no quinto ou oitavo dia do tratamento no protocolo progesterona/estradiol. Sobretudo, em torno de 75 85% de receptoras com o protocolo de TETF, recebem embriões no momento da transferência (comparadas com 50% ou menos das que são sincronizadas com a PGF 2 α), apresentam alta concentração de progesterona no momento da transferência e a taxa de concepção normalmente supera os 50% (BARUSELLI et al., 2011). A administração de ecg no quinto dia do protocolo de sincronização aumenta a taxa de gestação e a proporção de receptoras selecionadas para a TE (BÓ et al., 2002; NASSER et al., 2004). Esse tratamento promove um aumento no

25 24 tamanho do CL e induz a uma ou múltiplas ovulações adicionais, determinando altas concentrações de progesterona na fase luteal subsequente. Nasser et al. (2004), estudaram o efeito da administração de 400 UI de ecg no quinto e no oitavo dia na sincronização para TETF com dispositivo de P4 por via IM e BE com ou sem 50 mg de P4 por via IM (intramuscular). Estes autores demostraram que o tratamento com ecg no dia 5 resultou em um aumento na taxa de gestação (D5 = 47%, 71/151 x D8 = 40,7%, 61/150), no número de CL e nas concentrações plasmáticas de progesterona em 304 receptoras Bos taurus indicus x Bos taurus taurus. O ecg aumenta a taxa de ovulação e o aproveitamento das receptoras e também aumento das concentrações de P4. Uma possível explicação para esse melhor desempenho, seria que a elevada taxa de progesterona fisiológica produzida pelo CL em adição à P4 liberada pelo dispositivo intravaginal, acabaram por afetar a pulsatilidade de LH e o crescimento folicular (BARUSELLI et al., 2010). Existem vários estudos investigando a associação entre a concentração plasmática de progesterona e as taxas de gestação em bovinos (TATCHER et al., 2001). Altas concentrações plasmáticas de P4 têm sido relacionadas com aumento do desenvolvimento embrionário e a capacidade do concepto em secretar interferontau e assim facilitar o reconhecimento materno da gestação (RODRIGUES et al., 2010) e aumentar as taxas de concepção (BARUSELLI et al., 2001). Outros estudos não têm demonstrado que o uso do ecg possa afetar o aumento das destas concentrações e as taxas de concepção (NOGUEIRA et al., 2002). Remillard et al. (2005) compararam cinco protocolos usados em receptoras cruzadas da raça Chinese Yellow, para a transferência de embriões da raça holandesa produzidos in vitro e congelados. Nos dois experimentos realizados não foram encontradas diferenças significativas nas taxas de gestação das receptoras com cio natural (15,4%, n=52), sincronização com o uso de PGF 2 α e observação de cio (20%, n=50); TETF com dispositivo de P4 e BE (19,2%, n=99); TETF com dispositivo de P4, BE e ecg no quinto dia (28,1%, n=96) de tratamento, e TETF com dispositivo de P4 e BE e ecg no oitavo dia (21,3%, n=75) As taxas de gestação encontradas são sobre todas as receptoras usadas no experimento e não somente as que receberam embriões. Em uma análise retrospectiva com 949 receptoras paridas da raça Beefmaster, a sincronização com dispositivo de progesterona, estrógeno e 400 UI de ecg no protocolo de TETF aumentou o número de receptoras que receberam embrião no momento da TE, com maiores taxas de gestação (51,4%,

26 25 259/509) em relação aos animais que não receberam ecg (47,3% 123/260) (LOONEY et al., 2011). Rodrigues et al. (2010) em um experimento com vacas holandesas de alta produção leiteira e repetidoras de cio, compararam o efeito da sincronização da ovulação com protocolos de TETF com administração de uma dose de PGF 2 α seguida da observação de cio. Neste trabalho eles verificaram que a taxa de gestação por receptora transferida foi maior para o grupo PGF 2 α cio observado (53,2%, 42/79), quando comparadas com as nas fêmeas que foram sincronizadas para TETF (42,9%, 67/156). Além disso, não observaram aumento das concentrações plasmáticas de progesterona nas fêmeas que foram tratadas com ecg (TETF). Bényei et al. (2006) avaliaram o efeito de diferentes protocolos de sincronização para TE de 1466 embriões de raça leiteira Holstein-Friesian em receptoras cruzadas B. taurus indicus x B. taurus taurus. Neste trabalho foram comparados diferentes protocolos de sincronização testados: uma dose de PGF 2 α, TETF com CIDR (Controlled internal drug release) e E2 (17β- estradiol) ou TETF com CRESTAR e E2 e não foram encontradas diferenças entre eles. As taxas de gestação nas receptoras sincronizadas com uma dose de PGF (41%, 236/575) foram similares àquelas das receptoras tratadas com P4 e E2 (CIDR - 50%, 69/138 e CRESTAR 45,1%, 102/226). 3.2 QUALIDADE DO CORPO LÚTEO A seleção de receptoras de alta qualidade é um procedimento desafiador, principalmente em países como o Brasil, onde há um número excessivo de embriões em relação ao número de receptoras aptas. Uma boa condição nutricional e um bom estado de saúde são fatores importantes para garantir o sucesso dos programas de PIVE. O uso de novilhas como receptoras, normalmente é indicada como a melhor opção para alcançar maiores taxas de gestação. Existe um conceito informal de que as melhores receptoras seriam as novilhas cruzadas, geralmente animais da raça Nelore, cruzadas com uma raça européia que tenha com alguma habilidade leiteira, como por exemplo, as raças Simental e Braunvieh. No entanto, devido a um fornecimento limitado e elevada procura, este tipo de receptora tornou-se cara e escassa (MARINHO et al., 2012).

27 26 Com um bom manejo nutricional e sanitário estabelecido no rebanho, o uso de vacas como receptoras pode apresentar certas vantagens em comparação com o uso de novilhas. Em geral, a taxa de aproveitamento de receptoras aptas por total de tratadas é maior porque esse grupo de animais geralmente apresenta uma melhor resposta ao protocolo hormonal, uma vez que as novilhas frequentemente necessitam de uma pré-sincronização. Outro aspecto interessante é que as vacas são mais expostas agentes patogênicos, assim, estas podem ter uma maior resistência à doenças e melhor qualidade do colostro. Finalmente, a frequência de distocias tende a ser maior em novilhas do que em vacas (MARINHO et al., 2012). A importância de qualidade da receptora está além da sua habilidade em manter a gestação. Estudos de epigenética mostraram que uma dieta de qualidade e o comportamento materno podem interferir na expressão gênica dos fetos. Mesmo a sequência gênica ser estabelecida desde a primeira divisão celular, esta pode ser alterada por mutações ocasionadas por fatores ambientais. O estado nutricional da receptora pode interferir na reserva folicular ovariana do feto comprometendo a performance reprodutiva da futura doadora de embriões (IRELAND et al, 2011). Vários estudos têm apontado uma correlação positiva entre a concentração sérica de P4, desenvolvimento embrionário, capacidade do concepto em secretar interferon-tau (MANN et al., 1999) e a taxa de gestação em bovinos (BARUSELLI et al., 2001; BINELLI et al., 2001; TATCHER et al., 2001; BÓ et al., 2002; NASSER et al., 2004). Está bem estabelecido que CL grandes secretam maiores quantidades de P4 e isto pode ter um efeito positivo no reconhecimento materno da gestação e consequentemente nas taxas de gestação em programas de TE. Entretanto, tanto o tamanho do CL quanto a concentração de P4 no começo do ciclo estral, têm apresentado um efeito variável nas taxas de concepção (BARUSELLI et al., 2012). Baruselli et al., (2000) encontraram uma correlação positiva entre a área do CL e a concentração plasmática de P4 em receptoras de embrião B. taurus indicus x B. taurus taurus sincronizadas. Neste mesmo estudo, a concentração média de P4 aumentou à medida que o tamanho do CL também aumentou de < 1,5 cm 2 para > 2,0 cm 2. Estes dados estão de acordo com resultados de um estudo anterior que sugere que a avaliação ultrassonográfica na área do CL pode ser usada para como preditivo da concentração plasmática de P4 e da função luteal (KASTELIC et al., 1990).

28 27 Thibier e Nibart (1992) enfatizaram a importância da boa qualidade do corpo lúteo das receptoras para que o mesmo possa produzir progesterona necessária até que haja a completa placentação embrionária, pois a progesterona é a responsável pela manutenção da prenhez. A luteinização e a formação dos corpos lúteos devemse à onda pré-ovulatória do hormônio luteinizante, o que gera mudanças bioquímicas e morfológicas, bem como a reorganização geral da luteinização das células foliculares dentro do corpo lúteo (TIMOTHY et al., 1994). Em bovinos, o aumento da fertilidade tem sido associado à altas concentrações de progesterona após a cobertura (GRUMER e CARROL, 1991.; BRITT et al., 1996). Além disso, tem sido observado em alguns trabalhos com bovinos que o aumento do número de corpos lúteos tem relação direta com o aumento do teor de progesterona (HANSEL E CONVEY, 1983; DEGL INNOCENTI et al., 1984; MAPLETOFT, 1985) e que a concentração de progesterona tem relação com o índice de prenhez (GREGORY et al., 1986; GRYGAR et al., 1997). As relações entre o tamanho do CL, concentração de progesterona e taxa de gestação em receptoras ainda não estão claras e é objeto de vários estudos. Há uma controvérsia sobre se há ou não influência de altas (> 6,0 ng/ml) ou baixas (< 2,0 ng/ml) concentrações de progesterona nas taxas de gestação (NORTHEY et al., 1985). Alguns estudos relatam que a avaliação da receptora pode ser determinada pela presença do CL confirmando a ocorrência do cio, independentemente do tamanho do CL ou das concentrações de progesterona, uma vez que ótimas taxas de gestação foram relatadas em animais com altas concentrações séricas de progesterona (> 16,0 ng/ml) ou concentrações muito baixas (< 1,0 ng/ml). Aparentemente ainda é difícil determinar se a concentração circulante de progesterona é ou não preditor da taxa de gestação (SPELL et al., 2001). Siqueira et al. (2009), em um estudo com 259 receptoras B. taurus indicus x B. taurus taurus, sincronizadas com protocolo TETF baseado no uso de dispositivo de P4, BE e ecg, transferindo embriões in vivo ou in vitro, avaliaram as características físicas e funcionais do CL sobre as taxas de gestação. Não foram observadas diferenças entre as taxas de gestação, a concentração plasmática de P4, o tamanho do CL ou sua ecotextura. Entretanto, o tipo de embrião, in vivo ou in vitro, foi a característica que mais afetou a taxa de gestação. Estudando o efeito do método da sincronização, Bényei et al., (2006) não encontraram diferenças quando compararam a taxa de gestação de receptoras sincronizadas ou com cio natural,

29 28 mas encontraram diferenças entre os protocolos utilizados para a sincronização. Neste mesmo trabalho, a qualidade do CL foi classificada em 5 (excelente), 4 (boa) ou 3 (pobre). As taxas de gestação foram 41,9% (499/1189), 37,3% (97/260) e 35,2% (6/17) respectivamente, não apresentando significância entre estas. Leal et al. (2009) não encontraram diferenças nas taxas de gestação em relação ao tamanho do CL à palpação (pequeno 70%, 7/10; médio 38,9%, 7/18 e grande 60%, 15/25). Os CL considerados grandes produziram uma maior quantidade de P4 em relação aos pequenos e médios, porém isto não afetou as porcentagens de prenhez. Em um estudo de regressão logística, Colombo et al. (2010) encontraram diferenças estatísticas nas taxas de gestação em receptoras com diferentes corpos lúteos. Em 1590 receptoras as taxas de gestação encontradas foram de 42,68% para receptoras mestiças com CL grande, de 35,94% para receptoras com CL de médio e de 37,40% para receptoras de CL pequeno. De acordo com Looney et al. (2006) não foram observadas diferenças nas taxas de gestação com CL acima de 10 mm de diâmetro e em muitos estudos anteriores não indicam correlação entre o tamanho do CL e a taxa de gestação (REMSEN e ROUSSEL, 1982; COLEMAN et al., 1987; HASLER et al., 1987; BÓ et al., 2001). Em uma análise retrospectiva com 8034 receptoras B. indicus indicus x B. indicus taurus sincronizadas com protocolos de TETF baseado no uso de progestágeno e estrógeno e que receberam embriões produzidos in vitro, Nasser et al., (2009) observaram uma correlação positiva entre o diâmetro do CL e as taxas de gestação. As taxas de gestação encontradas neste estudo foram de 39,1%, 43,4%, 46,2% e 48,5% para os CL de 16, 18, 20 e 22 mm de diâmetro. 3.3 SINCRONIA RECEPTORA/EMBRIÃO Durante o período pré-implantação a comunicação embrio-materna é crucial para o estabelecimento da gestação (WOLF et al., 2003), sendo assim, a sincronia embrião e o endométrio uterino é essencial (MACHATY et al., 2012). A P4 desempenha um papel fundamental na gestação que se inicia, agindo sobre o epitélio endometrial para promover a secreção de fatores indispensáveis para o desenvolvimento embrionário (BARNES, 2000). A sincronização entre o embrião e o endométrio é regulada pela elevação pós-ovulatória da P4. É provável que, tanto o

30 29 momento da elevação da P4 quanto a sua concentração na fase lútea, sejam importantes para manutenção da gestação (GOFF, 2002). A assincronia pode resultar na falha da implantação levando à morte embrionária precoce além de outras complicações como interferir no crescimento e desenvolvimento embrionário e fetal (BARNES, 2000). O ambiente uterino pode, além de reduzir a capacidade de desenvolvimento embrionário, afetar a sinalização entre o embrião e o endométrio, uma vez que, o embrião secreta interferon-tau que induz a mudanças funcionais no endométrio que são necessárias para a implantação (KLEIN et al., 2006). Com isso, avaliar se a sincronia entre receptora (endométrio) e embrião afetam as taxas de gestação tem sido alvo de muitos estudos. As taxas de gestação podem variar de acordo com a sincronia entre a receptora e embrião, embora elas sejam maiores quando o estro coincide com o dia da fertilização e parece não haver uma redução da mesma quando há uma assincronia de 24 horas (SPELL et al., 2001). Colombo et al. (2010) estudaram a taxa de gestação em novilhas sem raça definida (receptoras) com sincronia -2, -1, 0, +1 e + 2 considerando a sincronia 0 quando a receptora manifesta cio no mesmo dia em que foi realizada a fertilização in vitro e não encontraram diferenças para as respectivas médias de prenhez - 25,00%; 28,57%; 29,79%; 40,00% e 34,10%. Comparando as taxas de gestação em receptoras de embriões in vivo, Spell et al. (2001) encontraram uma maior taxa de gestação em receptoras com sincronia de +12h e 24+ quando comparadas com as de sincroniza -24h. Em contrapartida, Andrade et al. (2012) estudando o efeito da sincronia -1, 0 e +1 em receptoras, detectaram diferença quando compararam os percentuais; 44,4% (36/1509); 58,0% (69/1509) e 37,3% (1401/1509) respectivamente. Florentino et al. (2012) estudaram as taxas de gestação em transferências de embriões (Nelore, Guzerá, Gir e Tabapuã) em vacas e novilhas cruzadas e concluíram que as melhores taxas de gestação foram obtidas com uma sincronia de seis dias (D-1 37,2%,176/788), sete dias (D0 36,5%, 456/788) e oito dias (D+1 31,8%, 150/788), comparadas em receptoras com nove (D+2-27,3%, 3/11) e cinco (D-2-9.7%, 3/31) dias do dia da fertilização in vitro.

31 ESTÁGIO DE DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO Considerando ainda que, todas as variáveis analisadas possam influenciar na gestação, sabe-se que as maiores perdas embrionárias ocorrem durante a segunda semana de gestação nos bovinos. Estudando a morte embrionária entre os dias 7 e 16 da gestação, foram observaram duas principais influências na perda embrionária precoce. A materna que pode fornecer um ambiente uterino de baixa qualidade, e a embrionária, onde uma baixa qualidade pode inviabilizar sua sobrevivência. Nas perdas gestacionais por causas maternas as taxas foram diferentes (considerando apenas abaixo de 10% o nível de significância estatística) em 6% para novilhas e 16% para vacas paridas e não lactantes. As fêmeas utilizadas haviam sido sincronizadas com o mesmo protocolo e o cio foi observado sete dias antes da transferência de um blastocisto com sete dias, portanto é improvável que essa falha seja atribuída à assincronia entre receptora/embrião. As baixas taxas de gestação também podem ser influenciadas por falhas técnicas, alterações endócrinas, defeitos anatômicos e por causas infecciosas (BERG et al., 2010). No chamado período embrionário, existem alguns processos do desenvolvimento: clivagem, compactação, blastulação, expansão, eclosão e alongamento. A finalização completa dessa sequência de eventos é importante para o estabelecimento da gestação. O estágio embrionário é importante por dois aspectos, o primeiro destes é o reconhecimento materno da gestação, um passo crucial para que ocorra a gestação. O segundo é que, este é um período crítico e importante para a perspectiva da manipulação embrionária (PEIPPO et al., 2011). Entende-se por reconhecimento materno da gestação a interação endócrina, bioquímica e molecular entre o concepto e o tecido uterino, com a consequente manutenção do corpo lúteo, garantindo concentrações ótimas de progesterona na circulação sanguínea para manutenção da gestação (HANSEN, 1991). Os bovinos necessitam da permanência do corpo lúteo até aproximadamente o 200º dia de gestação, para que os elevados níveis de progesterona permitam sustentar a gestação através de mecanismos que inibem a luteólise (HAFEZ E HAFEZ, 2004). O bloqueio da luteólise depende da capacidade do concepto em enviar sinais antiluteolíticos e do endométrio materno em responder a estes sinais, bloqueando assim a produção de PGF2α. Esta comunicação materno-embrionária nem sempre é bem

32 31 sucedida, resultando na ocorrência da luteólise e na consequente perda embrionária (BINELLI et al., 2001; SPENCER, 2004). Muitos autores estudaram o efeito do estágio de desenvolvimento embrionário nas taxas de gestação em receptoras bovinas. Spell et al. (2001) não encontraram diferença significativa nas taxas de gestação de embriões in vivo nos estágios de mórula (50% - 1/2), mórula compacta (73,4% - 207/282), blastocisto inicial (73,1% 106/145) e blastocisto (63,2% - 12/19). Estudando os efeitos dos diferentes estágios embrionários, Rodrigues et al. (2009) também não obtiveram diferenças quando analisaram perdas gestacionais em receptoras holandesas com alta produção apresentando síndrome da repetição de cio comparando mórulas (20% - 295/428), blastocisto inicial (18,9% - 59/256), blastocisto (23% - 59/256) e blastocisto expandido (14% - 8/57). Um recente estudo cujo objetivo foi avaliar diversos fatores que poderiam afetar as taxas de gestação após transferência direta de embriões PIV descongelados utilizou como receptoras vacas cruzadas Bos taurus indicus, multíparas não lactantes e com boa condição corporal. Neste estudo, Bó et al. (2012a) encontraram uma diferença nas taxas de gestação e estas foram maiores quando os embriões eram mórula (55,4% - 259/468) e blastocisto inicial (59,4% - 275/463) do que blastocistos (52,0% - 179/344) e blastocistos expandidos (39,7% - 23/58). Burns et al. (2011) estudando a influência do estágio embrionário em 8000 transferências de embriões produzidos in vitro e in vivo, frescos e descongelados, encontraram influência quando os embriões eram frescos e produzidos in vivo. Nos embriões frescos e PIVE não foi observado efeito do estágio embrionário sobre a taxa de gestação. Um experimento realizado por Béynei et al. (2006) objetivaram avaliar o efeito de fatores internos e externos na transferência de embriões bovinos sobre as taxas de gestação. Neste trabalho, não encontraram diferenças nas taxas de gestação entre os embriões de diferentes estágios de desenvolvimento, mórula (40,4% - 230/568), blastocisto inicial (42,3% - 263/621), blastocisto (42,0% - 84/200) e blastocisto expandido (32,5% - 25/77). Avaliando a influência da receptora e do embrião sobre a viabilidade embrionária e o sexo, Mello (2003) analisou 432 transferências de embriões PIVE encontrou diferenças entre a taxa de gestação de blastocistos expandidos (40,1%) em relação aos demais estágios, mórula (3,4%), blastocisto inicial (24,5%) e blastocisto (32,0%).

33 32 A sincronia entre o embrião e a receptora, os protocolos de sincronização, a qualidade do embrião e muitos outros fatores que contribuem para o sucesso da transferência de embriões bovinos, são aspectos bastante estudados ao longo dos anos. No entanto, a experiência com a transferência de embriões tem demonstrado a importância de um bom manejo e da gestão das etapas para o sucesso da produção de animais geneticamente superiores. Com isso, para o sucesso na TE é necessária união de conhecimentos nas áreas da fisiologia reprodutiva, da pecuária básica e da ciência veterinária para produzir resultados consistentes e aceitáveis (STROUD e HASLER, 2006).

34 33 4 MATERIAL E MÉTODO 4.1 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL Foram analisadas taxas de prenhezes de uma base de dados formada a partir de 548 inovulações de embriões da raça Gir em receptoras mestiças e que ocorreram entre os meses de fevereiro e agosto de Todos os procedimentos foram executados pelas mesmas equipes de trabalho, e todas as inovulações feitas por um único veterinário na mesma Central de receptoras. Nesta base de dados havia informações sobre aspectos reprodutivos das receptoras e características dos embriões produzidos in vitro. Em relação às receptoras: a identificação das mesmas; a qualificação do CL em graus 1, 2 ou 3 e ainda presença de cavidade, a sua localização (ovário direito ou esquerdo), número de dias após o cio e o tratamento de sincronização de cio realizado (cio observado ou protocolo de TETF). Em relação aos embriões, o número de embriões transferidos (transferência única, dupla ou tripla) e o estágio de desenvolvimento embrionário (blastocisto inicial, blastocisto, blastocisto expandido e blastocisto eclodido), tipo de sêmen usado na fertilização (convencional ou sexado) e o sexo fetal. Os critérios de exclusão utilizados foram: mês com número de embriões transferido menor que 10 (duas inovulações no mês de agosto), receptoras com CL cavitário no momento da transferência (20 receptoras) e dupla ou tripla transferência (7 TE com pelo menos dois embriões). Com isso foram analisados dados de 519 inovulações.