DANIELA DINIZ VIANA DE BRITO

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1 DANIELA DINIZ VIANA DE BRITO ANÁLISE DA FREQUÊNCIA DE MUTAÇÕES E TIPIFICAÇÃO DE GENÓTIPOS CLINICAMENTE RELACIONADOS ÀS DISLIPIDEMIAS EM CRIANÇAS E JOVENS DO ESTADO DE MINAS GERAIS DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA GERAL INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DA UFMG BELO HORIZONTE 2009

2 DANIELA DINIZ VIANA DE BRITO ii ANÁLISE DA FREQUÊNCIA DE MUTAÇÕES E TIPIFICAÇÃO DE GENÓTIPOS CLINICAMENTE RELACIONADOS ÀS DISLIPIDEMIAS EM CRIANÇAS E JOVENS DO ESTADO DE MINAS GERAIS Dissertação apresentada ao curso de Pós- Graduação em Genética do Instituto de Ciências Biológicas da UFMG, como requisito para obtenção do grau de Mestre em Genética. Orientadora: Profª. Dra. Marinez de Oliveira Sousa Co-orientadora: Profª. Dra. Ana Paula Salles Moura Fernandes DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA GERAL INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DA UFMG BELO HORIZONTE 2009

3 iii AGRADECIMENTOS À minha família, em especial minha mãe, minha orientadora especial, que não me deixou fraquejar nem um segundo, e à minha tia Sônia, por possibilitar o nascimento deste trabalho; Às minhas orientadoras, Profª Marinez e Profª Ana Paula, pela orientação do projeto e pelo carinho, apoio e imensa paciência que sempre demonstraram comigo; Aos médicos e nutricionistas do Ambulatório São Vicente, em especial ao Dr. Paulo, Dra. Rosangêla, Dra. Mayumi, Dra. Rocksane e Dra. Adriana. Obrigada por me receberem de braços abertos e me darem todo o apoio na difícil tarefa da seleção dos pacientes; Á Carminha e Raquel do Centro Pedagógico da UFMG, e à Edeuvanis, diretora da Escola Estadual Alcindo Vieira pela boa vontade e enorme ajuda na captação de novos voluntários; Aos funcionários do Laboratório Central de Coleta do HC-UFMG, em especial ao José Oswaldo e à Zilda que, mesmo ocupados em sua pesada rotina de trabalho, sempre me ajudaram todas as vezes que eu precisei; Ao Adriano e à Karina, pela ajuda absolutamente indispensável de ambos em estatística e biologia molecular e pela enorme amizade; Ao Jarbas, pelo apoio profissional em todas as etapas do projeto, pela amizade e pelas loucuras de cada dia que não me deixavam perder o bom humor; À Profª Ângela e ao Danilo, da Veterinária, e à Luciana, da FAFAR, pela ajuda inestimável em todas as etapas da análise estatística; Aos meus amigos, offline ou online - o status e a distância geográfica não mudam o fato de que, sem sua amizade e carinho, nunca teria conseguido chegar ao fim deste projeto; À coordenação do Programa de Pós-Graduação em Genética do ICB, pela oportunidade que me deu de realizar um trabalho na área que eu amo; A todos os professores e funcionários da Farmácia que de alguma maneira contribuíram para este projeto, em especial às Professoras Graça e Luci e aos funcionários Fátima, Eunice e Márcio;

4 iv Aos alunos de IC, mestrandos e doutorandos do Laboratório de Biologia Molecular e a todas as outras pessoas que por lá estão ou já passaram, pelas boas risadas e o ótimo ambiente de trabalho; A todos os funcionários do HC, do Ambulatório São Vicente e do SAME que de alguma maneira me auxiliaram nesse projeto; A todos os voluntários do meu projeto, por agüentarem os jejuns e as agulhas e pela contribuição mais que indispensável para esta pesquisa.

5 v SUMÁRIO ÍNDICE DE TABELAS ÍNDICE DE FIGURAS LISTA DE ABREVIATURAS RESUMO ABSTRACT ix xi xii xv xvi 1 INTRODUÇÃO Lípides e doenças ateroscleróticas Lípides e lipoproteínas Metabolismo das lipoproteínas Dislipidemias Valores de referência para lípides e lipoproteínas para a população pediátrica Determinantes do perfil lipídico de crianças e jovens Prevenção da aterosclerose na infância e adolescência Condutas terapêuticas nas dislipidemias Genética e dislipidemias Gene codificador do receptor de LDL (LDLR) Gene da apolipoproteína E (APOE) Gene da apolipoproteína B (APOB) Gene da apolipoproteína A5 (APOA5) Genética e doença arterial coronariana DAC e polimorfismos da apolipoproteína E 39

6 vi 2 OBJETIVOS Objetivo geral Objetivos específicos 42 3 MATERIAL E MÉTODOS Casuística Critérios de inclusão e exclusão Critérios de inclusão Critérios de exclusão Amostras biológicas Delineamento experimental Determinação dos níveis plasmáticos de lípides e lipoproteínas Triglicérides Colesterol total Colesterol HDL Colesterol LDL Apolipoproteína A Apolipoproteína B Índice APOB/APOA Extração de DNA Determinação do perfil genético individual - APOE Reação de PCR Reação de digestão com enzima de restrição específica Determinação do perfil genético individual - APOB Reação de PCR Reação de digestão com enzima de restrição específica 52

7 vii 3.9 Determinação do perfil genético individual - APOA Reação de PCR Reação de digestão com enzima de restrição específica Análises estatísticas RESULTADOS Caracterização dos grupos normolipêmico e dislipidêmico Polimorfismos da APOE, APOB e APOA5 - identificação dos genótipos Apolipoproteína E: freqüências alélicas e genotípicas e associação de parâmetros lipídicos com os grupos E2, E3 e E Correlações entre os níveis de CT e TG nos grupos E2, E3 e E4 da APOE Apolipoproteína B: freqüências alélicas e genotípicas e associação de parâmetros lipídicos com os grupos B+ e B- 4.5 Apolipoproteína A5: freqüências alélicas e genotípicas e associação de parâmetros lipídicos com os grupos T e C Correlações entre as variáveis qualitativas e quantitativas estudadas Associação entre os polimorfismos da APOE e o polimorfismo -1131T>C da APOA Correlações de Pearson e Spearman DISCUSSÃO Caracterização dos grupos normolipêmico e dislipidêmico Dislipidemias e polimorfismos Polimorfismos do gene da APOE Polimorfismos do gene da APOB Polimorfismos do gene da APOA Apolipoproteínas APOA1 e APOB e determinação do índice APOB/APOA Correlações entre variáveis qualitativas e quantitativas 81 6 CONCLUSÕES 84

8 viii 7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 86 ANEXO ANEXO APÊNDICE 109

9 ix ÌNDICE DE TABELAS Tabela 1 - Valores de referência de lípides para a população pediátrica (2 a 19 anos) 24 Tabela 2 - Frequências relativas dos alelos do polimorfismo HhaI da APOE em diferentes populações Tabela 3 - Frequências alélicas e genotípicas do polimorfismo MspI da APOB em diferentes populações Tabela 4 - Frequências alélicas e genotípicas do polimorfismo -1131T>C da APOA5 em diferentes populações Tabela 5 - Protocolo da reação de PCR para amplificação de fragmento da APOE 49 Tabela 6 - Concentração dos reagentes para a reação de PCR para amplificação de fragmento do gene da APOE Tabela 7 - Protocolo da reação de digestão do fragmento de 263pb do gene da APOE Tabela 8 - Perfil de bandas no gel para a identificação dos alelos do gene da APOE 50 Tabela 9 - Protocolo da reação de PCR para amplificação de fragmento do gene da APOB Tabela 10 - Concentração dos reagentes para a reação de PCR para amplificação de fragmento do gene da APOB Tabela 11 - Protocolo da reação de digestão do fragmento de 465pb do gene da APOB Tabela 12 - Perfil de bandas no gel para a identificação dos diferentes perfis genéticos da mutação R3500Q e do polimorfismo MspI do gene da APOB Tabela 13 - Protocolo da reação de PCR para amplificação de fragmento do gene da APOA5 Tabela 14 - Concentração dos reagentes para a reação de PCR para amplificação de fragmento do gene da APOA5 Tabela 15 - Protocolo da reação de digestão do fragmento de 187pb do gene da APOA5 Tabela 16 - Perfil de bandas no gel para a identificação dos alelos do polimorfismo -1131T>C da APOA5 Tabela 17 - Características gerais e parâmetros lipídicos dos grupos normolipêmico e dislipidêmico

10 x Tabela 18 - Frequências alélicas dos polimorfismos da APOE em indivíduos normolipêmicos e dislipidêmicos Tabela 19 - Frequências genotípicas dos polimorfismos da APOE em indivíduos normolipêmicos e dislipidêmicos Tabela 20 - Características gerais e parâmetros lipídicos dos grupos E2, E3 e E4 da APOE Tabela 21 - Frequências alélicas do polimorfismo MspI da APOB em indivíduos normolipêmicos e dislipidêmicos Tabela 22 - Frequências genotípicas do polimorfismo MspI da APOB em indivíduos normolipêmicos e dislipidêmicos Tabela 23 - Características gerais e parâmetros lipídicos dos grupos B+ e B- da APOB Tabela 24 - Frequências alélicas do polimorfismo -1131T>C da APOA5 em indivíduos normolipêmicos e dislipidêmicos Tabela 25 - Frequências genotípicas do polimorfismo -1131T>C da APOA5 em indivíduos normolipêmicos e dislipidêmicos Tabela 26 - Características gerais e parâmetros lipídicos dos grupos T e C da APOA5 Tabela 27 - Associação entre os polimorfismos da APOE e o polimorfismo -1131T>C da APOA Tabela 28 - Correlação de Pearson 72 Tabela 29 - Correlação de Spearman 72

11 xi ÌNDICE DE FIGURAS Figura 1 - Metabolismo das lipoproteínas 20 Figura 2 - Esquema das isoformas da apolipoproteína E 31 Figura 3 - Padrões de RFLP para APOB 54 Figura 4 - Eletroforese, em gel de poliacrilamida a 12% corado pela prata, dos produtos de PCR-RFLP do fragmento de 263pb do gene da APOE Figura 5 - Eletroforese, em gel de poliacrilamida a 8% corado pela prata, dos produtos de PCR-RFLP do fragmento de 465pb do gene da APOB Figura 6 - Eletroforese, em gel de poliacrilamida a 8% corado pela prata, dos produtos de PCR do fragmento de 187pb do gene da APOA Figura 7 - Níveis plasmáticos de LDLc nos grupos E2, E3 e E4 da APOE 64 Figura 8 - Correlação entre os níveis de CT e TG no grupo E2 da APOE 65 Figura 9 - Correlação entre os níveis de CT e TG no grupo E3 da APOE 65 Figura 10 - Correlação entre os níveis de CT e TG no grupo E4 da APOE 65 Figura 11 - Níveis plasmáticos de HDLc nos grupos C e T da APOA5 70

12 xii LISTA DE ABREVIATURAS 3'HVR - 3' hyper-variable region ou região hipervariável 3' ABCA1 - ATP-binding cassette transporter ABCG1 - ATP-binding cassette transporter G1 AHA - American Heart Association ANOVA - Análise de variância APOA1 - Apolipoproteína A1 APOA5 - Gene da apolipoproteína A5 APOA5 - Apolipoproteína A5 APOB - Gene da apolipoproteína B APOB - Apolipoproteína B APOE - Gene da apolipoproteína E APOE - Apolipoproteína E AVC - Acidente vascular cerebral B/E - Receptor B/E (ver LDLR) COEP - Comitê de Ética em Pesquisa CT - Colesterol total DA - Doença de Alzheimer DAC - Doença arterial coronariana DACT - Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas DAOP - Doença arterial obstrutiva periférica DL - Desequilíbrio de ligação DNA - Ácido desoxirribonucleico dntps - Desoxirribonucleotídeos EDTA - Ácido etilenodiaminotetracético HC-UFMG - Hospital das Clínicas da UFMG HDL - High density lipoprotein ou lipoproteína de alta densidade HDLc - Colesterol presente na lipoproteína de alta densidade

13 xiii HF - Hipercolesterolemia familiar HMGCoA redutase - Hidroximetil glutaril coenzima A redutase IAM - Infarto agudo do miocárdio IC - Intervalo de confiança IDL - Intermediate density lipoprotein ou lipoproteína de densidade intermediária IDLc - Colesterol presente na lipoproteína de densidade intermediária IMC - Índice de massa corporal LDL - Low density lipoprotein ou lipoproteína de baixa densidade LDLc - Colesterol presente na lipoproteína de baixa densidade LDLox - LDL oxidada LDLR - Receptor de LDLc ou o mesmo que receptor B/E LCAT - Lecitina colesterol acil transferase Lp(a) - Lipoproteína(a) LPL - Lipoproteína lípase LRP - LDL receptor related ou proteína de ligação ao receptor de LDL mg/dl - miligramas por decilitro mrna - RNA mensageiro NCEP - III National Cholesterol Education Program nmol/dl - Nanomols por decilitro OR - Odds ratio PB - Pares de bases PCR - Polymerase chain reaction ou reação em cadeia da polimerase QM - Quilomícrons QSP - Quantidade suficiente para RPM - Rotações por minuto RFLP - Restriction fragment length polymorphism ou polimorfismo de tamanho de fragmento de restrição SBC - Sociedade Brasileira de Cardiologia SNPs - Single nucleotide polymorphism ou polimorfismo de um único nucleotídeo

14 xiv SUS - Sistema Único de Saúde TG - Triglicérides UFMG - Universidade Federal de Minas Gerais VLDL - Very low density lipoprotein ou lipoproteína de muito baixa densidade VLDLc - Colesterol presente na lipoproteína de muito baixa densidade WHO - World Health Organization

15 xv RESUMO As dislipidemias apresentam estreita relação com a aterosclerose, uma doença multifatorial, iniciada ainda na infância e na qual participam fatores genéticos e ambientais. É de grande importância a identificação de marcadores genéticos associados às dislipidemias para melhor estabelecer as condutas de prevenção e tratamento. Até o momento, poucos trabalhos foram realizados com crianças e adolescentes dislipidêmicos, independentemente da população avaliada. O presente estudo teve como objetivo estabelecer a freqüência de quatro variações genéticas - polimorfismo HhaI (APOE), mutação R3500Q e polimorfismo MspI (APOB), e polimorfismo -1131T>C (APOA5) - em crianças e adolescentes mineiros, com idade de 2 a 19 anos. Além disso, foram avaliadas as correlações entre os perfis genético e clínico e os parâmetros apolipoproteicos. Os polimorfismos e mutações foram investigados por PCR-RFLP. Odds ratio (OR), qui-quadrado e teste exato de Fisher foram utilizados para análise estatística dos polimorfismos e teste t e ANOVA para as variáveis quantitativas. Dentre as variantes genéticas analisadas, foi observada significância estatística para o alelo C da APOA5 (OR=2,38; IC=1,15-4,89; p=0,018). Foram observadas diferenças significativas entre os parâmetros lipídicos e apolipoproteicos entre os grupos normolipêmico e dislipidêmico. Finalmente, a presença do alelo ε2 da APOE se associou com menores níveis de colesterol LDL (p=0,01) e apolipoproteína B (p=0,03). Os dados obtidos demonstraram que jovens dislipidêmicos apresentam alterações significativas no perfil apolipoproteico, e dentre as variáveis genéticas avaliadas apenas o alelo C da APOA5 se correlacionou com aumento de susceptibilidade ao desenvolvimento de dislipidemia. Palavras-chave: dislipidemia, crianças e adolescentes, polimorfismo HhaI da APOE, polimorfismo MspI da APOB, polimorfismo -1131T>C da APOA5.

16 xvi ABSTRACT Dyslipidemia and atherosclerosis, a polygenic and multifactorial disease of early-onset, are strictly related. The identification of genetic markers associated to dyslipidemias is crucial to better establish the conducts for both prevention and treatment. Up to now, very few studies have targeted dyslipidemic children and teenagers. The aim of this research was to describe the frequencies of four genetic alterations - HhaI polymorphism (APOE), mutation R3500Q and MspI polymorphism (APOB), and -1131T>C polymorphism (APOA5) - in school children and teenagers (2 to 19 year-old) from Minas Gerais, Brazil. Correlations between genetic, clinic and lipid profiles were also made. The polymorphisms and mutations were investigated with PCR-RFLP. Odds ratio (OR), chi-square and Fisher s exact test were used for the statistical analyses of the polymorphisms frequencies, and Student s t test and ANOVA were used for quantitative variables. Among the investigated genetic variants, statistical significance was observed for the C allele (APOA5)(OR=2,38; IC=1,15-4,89; p=0,018). The lipid and apolipoproteic profiles were significantly different between the normolipemic and dyslipidemic groups. Finally, lower level of LDL cholesterol (p=0,01) and apolipoprotein B (p=0,03) were associated with the presence of the ε2 allele (APOE). The results demonstrate that dyslipidemic young people have considerably alterated lipid and apolipoprotein profiles and, among the genetic variants analyzed, only the C allele (APOA5) gene could be positively correlated with enhanced susceptibility to dyslipidemia. Keywords: dyslipidemia, children and teenagers, HhaI polymorphism (APOE), MspI polymorphism (APOB), -1131T>C polymorphism (APOA5)

17 17 INTRODUÇÃO

18 18 1 INTRODUÇÃO 1.1 LÍPIDES E DOENÇAS ATEROSCLERÓTICAS As alterações do metabolismo lipídico apresentam estreita relação com a aterosclerose e a doença arterial coronariana (DAC) (FROHLICH & DOBIASOVA, 2003). Entre as alterações lipídicas que favorecem o desenvolvimento da aterosclerose, as mais conhecidas e estudadas são as elevações dos níveis de colesterol total (CT) e da lipoproteína de baixa densidade (LDL), a redução dos níveis da lipoproteína de alta densidade (HDL), e o aumento dos níveis de triglicérides (TG). Outros fatores de risco cardiovascular, ainda relacionados às dislipidemias, incluem o sedentarismo, a obesidade, a resistência à insulina, o diabetes mellitus, o tabagismo e a hipertensão arterial (SBC, 2001). Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), a doença cardiovascular coronariana, decorrente da aterosclerose, é responsável por mortes de populações adultas em todo o mundo, apresentando alta prevalência nos países desenvolvidos e taxas ascendentes nos países em desenvolvimento (WHO, 2007; MENDES-LANA et al., 2007). No Brasil, a DAC ocupa, desde longa data, o primeiro lugar como causa de morte em algumas faixas de idade da população adulta (LESSA et al., 1998), cenário que permanece até os dias atuais. A aterosclerose é uma doença de evolução lenta e silenciosa, sendo que as manifestações clínicas surgem, em geral, muitos anos após o início da doença. Estudos em artérias de jovens falecidos trouxeram evidências de que a aterosclerose tem início na infância. Deposições lipídicas arteriais são relativamente comuns em jovens e sua frequência, distribuição e evolução podem ser influenciadas pelos níveis lipídicos (MARTINEZ, 2003). A prevenção da aterosclerose e de seus fatores relacionados, iniciada na infância, é considerada uma das principais estratégias para a prevenção da morbi-mortalidade cardiovascular (WHO, 2007). A progressão e a gravidade do processo aterosclerótico estão relacionadas à presença, número, magnitude e duração de uma série de fatores de risco. Como a maioria dos fatores de risco para a DAC tem início ou são adquiridos na infância, com tendência a prosseguir na fase adulta, o conhecimento dos mesmos, nesta faixa etária, torna-se de extrema importância nas condutas de prevenção (MARTINEZ, 2003), bem como na educação de crianças e jovens quanto aos cuidados com a saúde e manutenção de hábitos de vida saudáveis. 1.2 LÍPIDES E LIPOPROTEÍNAS Os lípides têm importantes funções em praticamente todos os aspectos da vida, pois são componentes estruturais das membranas celulares, fonte de energia para o organismo,

19 19 precursores de hormônios esteróides e de sais biliares, podendo atuar também como cofatores enzimáticos reguladores de diversas funções celulares. No entanto, as alterações do metabolismo lipídico estão intimamente envolvidas no desenvolvimento e progressão da aterosclerose, um processo patogênico que pode evoluir para conseqüências graves como o infarto agudo do miocárdio (IAM), doença cerebrovascular e doença vascular periférica (tromboses arteriais e venosas) (BURTIS et al., 2008). O colest-5-en-3β-ol ou colesterol é um componente essencial do metabolismo lipídico, sendo frequentemente encontrado esterificado com um ácido graxo. Nos seres humanos, o colesterol está presente em todos os tecidos corporais e a maioria das células é capaz de sintetizá-lo, sendo que 90% do colesterol é produzido pelo fígado e intestino. Os triglicérides constituem 95% da gordura de armazenamento no tecido e são a forma predominante de ésteres de gliceril encontrados no plasma. Os lípides sintetizados no fígado e intestino são transportados no plasma pelos complexos macromoleculares denominados lipoproteínas, moléculas de conformação esférica, compostas de lípides e proteínas (BURTIS et al., 2008). As lipoproteínas plasmáticas apresentam propriedades físico-químicas diferentes e foram tradicionalmente categorizadas com base nas diferenças em suas densidades, como determinado pela ultracentrifugação. Estas categorias incluem: [1] quilomícrons (QM), [2] lipoproteína de muito baixa densidade (VLDL), [3] lipoproteína de densidade intermediária (IDL), [4] lipoproteína de baixa densidade (LDL), [5] lipoproteína de alta densidade (HDL) e [6] lipoproteína(a) [Lp(a)] (MARTINEZ, 2003). A Lp(a) está estruturalmente relacionada ao LDL, apresentando alto conteúdo de colesterol e uma molécula de apolipoproteína B (APOB) por partícula. Diferentemente do LDL, a Lp(a) contém uma proteína rica em carboidrato, apo(a), covalentemente ligada à APOB por interações de pontes de dissulfeto (UTERMANN, 1989). Tal glicoproteína pertence à família do plasminogênio tecidual (t-pa), e é capaz de inibir a geração de plasmina e a fibrinólise, características que conferem à Lp(a) propriedades pró-aterogênicas (NELSON, 2002). As apolipoproteínas são os componentes protéicos das lipoproteínas, as quais apresentam importantes funções, como a manutenção da integridade estrutural do complexo lipoprotéico e a regulação de enzimas e de cofatores que atuam no metabolismo lipoprotéico. Essas proteínas também facilitam a captação de lipoproteínas, agindo como ligantes para receptores específicos de superfície celular (MARTINEZ, 2003). 1.3 METABOLISMO DAS LIPOPROTEÍNAS Os níveis plasmáticos de colesterol e triglicérides são resultantes do equilíbrio dinâmico entre os aspectos anabólicos e catabólicos do metabolismo das lipoproteínas. Os mecanismos pelos quais os lípides são utilizados, transportados e removidos pelo organismo são bastante complexos e envolvem diversos elementos, como receptores

20 20 celulares específicos, proteínas transportadoras, enzimas e vias de transporte (GAW et al., 2001). O metabolismo das lipoproteínas comumente é dividido nas vias exógena, endógena, transporte do colesterol intracelular e transporte reverso do colesterol (Figura 1). Figura 1 - Metabolismo das lipoproteínas (GAW et al., 2001). A via exógena é responsável pelo transporte dos lípides da dieta, que são absorvidos pelo intestino e incorporados aos quilomícrons. Essas lipoproteínas são secretadas na linfa, atingem a circulação e incorporam apolipoproteínas adicionais, apolipoproteína C (APOC) e apolipoproteína E (APOE) provenientes da HDL. A APOC2 é um ativador potente da lipoproteína lípase (LPL) que é fixada à superfície luminal das células endoteliais e rapidamente hidrolisa os triglicérides, originando os quilomícrons remanescentes. Essas partículas são captadas por receptores hepáticos específicos, denominados LRP (LDL receptor related - proteína de ligação ao receptor de LDL) que reconhecem a APOE e a APOB (MARTINEZ, 2003). A função primária da via endógena é transportar os lípides hepáticos para as células periféricas. Estes lípides representam tanto os lípides sintetizados no fígado quanto aqueles transferidos para o fígado pela via exógena (e que são incorporados à VLDL). Essa

21 21 lipoproteína é metabolizada na circulação, a partir de processos análogos ao catabolismo de quilomícrons. A lipólise progressiva dos triglicérides do núcleo da VLDL, pela ação da LPL da luz endotelial, transforma a VLDL em IDL e subsequentemente em LDL. Durante a transformação lipolítica da VLDL em partículas menores de LDL, ocorre transferência de lípides e apolipoproteínas entre VLDL e HDL, com participação da proteína transportadora de ésteres de colesterol (CETP). Parte da IDL é captada por receptores hepáticos específicos através da ligação da APOE com o receptor LRP e da APOB com o receptor de LDL (ou receptor B/E). As partículas de LDL, que transportam o colesterol do fígado até os tecidos periféricos, são capazes de interagir, através de ligações mediadas pela APOB100, com receptores de LDL (LDLR) de alta afinidade, localizados na superfície celular de quase todas as células (em especial nos hepatócitos) sendo assim captadas para o meio intracelular. O colesterol que retornou ao fígado é reutilizado para a secreção de lipoproteínas, utilizado na produção de sais biliares ou ainda excretado diretamente na bile (MARTINEZ, 2003). A via de transporte do colesterol intracelular representa os vários mecanismos homeostáticos que as células utilizam para manter seu equilíbrio de colesterol. Após a ligação com o receptor, a LDL sofre endocitose e a vesícula endocítica se funde a lisossomos, ocorrendo degradação da lipoproteína e a conseqüente liberação do colesterol livre, que pode tanto ser armazenado na forma de gotículas lipídicas citoplasmáticas, quanto seguir na direção de outras vias metabólicas. O receptor é reciclado e retorna à superfície celular. O número e a função dos receptores controlam os níveis de LDL na circulação. O equilíbrio de colesterol na célula é resultante do controle entre a biossíntese intracelular, regulada pela enzima hidroximetil glutaril coenzima A redutase (HMGCoA redutase), e a expressão de receptores da LDL, que induz a síntese de proteínas envolvidas no transporte reverso do colesterol (BURTIS et al., 2008). A função da via de transporte reverso de colesterol é remover o excesso de colesterol das células periféricas e retorná-lo para o fígado para excreção, processo amplamente mediado pela HDL. O colesterol é ativamente bombeado para fora da célula pelo transportador ABCA1 (ATP-binding cassette transporter) para a apolipoproteína A1 (APOA1), resultando daí a formação de HDL nascente em forma de disco, produzida pelo fígado e intestino. A HDL discoidal também interage com ABCA1 nas células periféricas (como os macrófagos) e remove o colesterol adicional. A esterificação do colesterol livre na HDL, catalisada pela lecitina colesterol acil transferase (LCAT), é um processo importante, pois os ésteres de colesteril são mais hidrofóbicos do que o colesterol e se mantêm presos no núcleo da HDL até que sejam removidos pelo fígado. Este processo de esterificação do colesterol na HDL converte a HDL nascente, discoidal, em HDL esférica. A HDL esférica também atua como aceptor extracelular para o colesterol que pode ser removido das células pelo transportador ABCG1 (ATP-binding cassette transporter G1) ou por um mecanismo de

22 22 difusão passiva. No estágio seguinte, o fígado remove seletivamente os ésteres de colesterol da HDL esférica e libera a HDL nascente para retornar à circulação para rodadas adicionais de remoção de colesterol nas células periféricas (BURTIS et al., 2008). Além de promover o efluxo do excesso de colesterol celular, a HDL também apresenta propriedades antiaerogênicas, antioxidantes, antiinflamatórias e anticoagulantes, ainda não bem compreendidas, mas provavelmente também benéficas na redução de risco de desenvolvimento da aterosclerose (VAN ECK, 2006; TABET, 2009). Finalmente, a Lp(a), é uma lipoprototeína sintetizada no fígado, sendo constituída pela união entre a APO(a) e a APOB da LDL, processo que parece ocorrer ainda no interior do hepatócito (UTERMANN, 1989). O metabolismo da Lp(a) não está totalmente elucidado, e os estudos demonstraram que os níveis plasmáticos de Lp(a) e sua massa molecular são muito variáveis entre os indivíduos, sendo geneticamente determinados (MARCOVINA et al., 2003). A Lp(a) está presente em maior quantidade nas artérias com aterosclerose em comparação às artérias normais, o que contribui para a redução da atividade fibrinolítica na placa aterosclerótica (DURIEZ et al., 1996). 1.4 DISLIPIDEMIAS As alterações relacionadas ao metabolismo lipídico podem ser coletivamente denominadas dislipidemias e classificadas em quantitativas ou qualitativas e primárias ou secundárias, de acordo com a sua etiologia. Podem desencadear estados de hiperlipoproteinemia (mais frequentemente) ou de hipolipoproteinemia (SBC, 2001). Para a maioria dos pacientes com dislipidemias, não existe uma única explicação genética imediatamente identificável. Devido à complexidade do metabolismo das lipoproteínas, muitos fatores, variáveis em importância dependendo do indivíduo em questão, provavelmente são responsáveis pela maioria dos casos de dislipidemias. Dentre estes fatores, podem ser citados a dieta, a frequência de exercícios físicos e a obesidade, cada um desempenhando importantes papéis na contribuição da gênese de hipercolesterolemias e hipertrigliceridemias. Além disso, acredita-se que polimorfismos genéticos comuns de enzimas, proteínas estruturais e receptores envolvidos no metabolismo das lipoproteínas têm, coletivamente, um impacto maior na tendência de qualquer indivíduo a desenvolver um determinado tipo de uma dislipidemia. Existem também muitas causas secundárias de dislipidemia, sejam conseqüências de distúrbios (diabetes mellitus, hipotireoidismo, síndrome nefrótica, hepatopatias colestásicas crônicas) ou de condições como o tabagismo e etilismo ou ainda decorrentes do uso de alguns tipos de medicamentos (diuréticos, beta-bloqueadores, corticosteróides, estrógenos, etc) (SBC, 2001).

23 23 Os defeitos poligênicos, associados a fatores ambientais desfavoráveis tais como dietas ricas em gorduras saturadas, são, provavelmente, a causa mais freqüente de dislipidemia em crianças e adolescentes (MARTINEZ, 2003) VALORES DE REFERÊNCIA PARA LÍPIDES E LIPOPROTEÍNAS PARA A POPULAÇÃO PEDIÁTRICA A determinação do perfil lipídico é indicada para adultos, a partir de 20 anos de idade. Uma triagem universal não tem sido indicada na infância e adolescência. Segundo a I Diretriz Brasileira de Prevenção da Aterosclerose na Infância e na Adolescência (SBC, 2005), a dosagem laboratorial de lípides e lipoproteínas para crianças e adolescentes é recomendada nas seguintes situações: história familiar sugestiva de doença coronariana de ocorrência prematura (por exemplo, pais, irmãos, tios ou avós que tiveram infarto, angina, derrame ou morte súbita em idade inferior a 55 anos); presença de obesidade; relato ou observação de xantomas cutâneos e/ou tendinosos; arco corneano; manifestação de pancreatite; observação de lipemia em exame da retina e a observação de soro com aspecto turvo, leitoso ou cremoso (DIAMANTE, 2002; MARTINEZ, 2003; SBC, 2005). Estudos de autópsia após morte inesperada em crianças e adultos jovens demonstraram que a presença e a gravidade de lesões ateroscleróticas correlacionam-se positiva e significativamente com os fatores de risco cardiovascular. O período de maior progressão das estrias gordurosas para placas fibrosas ocorre a partir dos 15 anos de idade (SBC, 2005). Os fatores de risco de doença cardiovascular aterosclerótica estão presentes desde o útero e continuam ao longo de todo o curso da vida. O recém-nascido pequeno para a idade gestacional apresenta maior incidência de doença cardiovascular (hipertensão arterial sistêmica e aterosclerose) e intolerância à glicose (diabetes mellitus ou síndrome metabólica). O recém-nascido grande ou com macrossomia ou obesidade fetal apresenta maior risco de desenvolver obesidade, diabetes e dislipidemias. Estas observações são concordantes com a associação epidemiológica descrita para níveis de lípides fetais e o risco de doença cardiovascular (BARKER et al., 1995; BARKER, 2000). Ao nascimento, os recém natos apresentam perfil lipídico semelhante, com níveis de CT entre 65 a 75mg/dL, que se elevam significativamente a partir da primeira semana de vida. Aos dois anos de idade, o indivíduo atinge os níveis de colesterol que devem ser mantidos ao longo da primeira década de vida, independente de sexo ou raça. Durante toda a infância e adolescência, os níveis mais altos de CT e colesterol LDL (LDLc) são verificados durante a puberdade. As crianças do sexo feminino apresentam CT e LDLc mais elevados que aquelas do sexo masculino até por volta de 20 anos de idade, padrão diferente daquele observado em adultos (DIAMANTE, 2002).

24 24 Apesar de os níveis de colesterol HDL (HDLc) apresentarem uma tendência à redução na fase de adolescência, em ambos os sexos e entre as raças, essa tendência se mostra mais acentuada em meninos caucasianos. Os níveis de TG e de colesterol VLDL (VLDLc) aumentam em todas as crianças durante a puberdade, porém, após a maturação sexual, o aumento se torna mais significativo em meninos caucasianos. Dessa forma, após o período da maturação sexual, estão estabelecidos os níveis lipídicos encontrados na vida adulta (MARTINEZ, 2003). Há uma associação entre a incidência de obesidade e dislipidemia em crianças. Foram encontradas prevalências de cerca de 50% de dislipidemias em crianças com índice de massa corporal (IMC, calculado dividindo-se o peso, em quilos, pelo quadrado da altura, em metros) acima do percentil 99 para a idade, sendo a obesidade considerada um critério para a triagem de perfil lipídico em crianças e adolescentes (SBC, 2005). Os valores de referência recomendados pela I Diretriz Brasileira de Prevenção da Aterosclerose na Infância e na Adolescência (SBC, 2005) são apresentados na tabela 1. Tabela 1 - Valores de referência de lípides para a população pediátrica (2 a 19 anos) Valores (mg/dl) Lípides Desejáveis Limítrofes Aumentados TG < CT < LDLc < HDLc TG - Triglicérides; CT - colesterol total; LDLc - colesterol LDL; HDLc - colesterol HDL Existem estudos que apresentam os valores de referência em tabelas que definem a distribuição dos lípides por percentil, idade e sexo (TERSHAKOVEC, 2004). Na interpretação dos resultados, devem-se considerar as variações fisiológicas relacionadas a idade, sexo e gravidez e as decorrentes de variações pré-analíticas (biológicas, coleta do sangue) e analíticas (métodos, coeficiente de variação, controle de qualidade). Na avaliação do perfil lipídico, é importante que o indivíduo não apresente estados infecciosos e seja avaliado em um estado metabólico de equilíbrio. O mesmo deve seguir dieta habitual e seu peso deve permanecer estável pelo menos duas semanas antes da determinação do perfil lipídico. Além disso, o indivíduo deve ser orientado a observar jejum de horas, a não praticar exercícios extenuantes 24 horas antes da coleta do sangue, e a fazer abstinência de uso de etanol por 72 horas antes da coleta (SBC, 2001).

25 DETERMINANTES DO PERFIL LIPÍDICO DE CRIANÇAS E JOVENS A interpretação dos resultados do perfil lipídico de crianças e jovens deve ser acompanhada de uma avaliação clínica completa, pois vários fatores podem atuar durante a fase de crescimento e de desenvolvimento. Na puberdade, a resistência à insulina está elevada, sendo compensada por um aumento na sua produção. Nesta fase, há associação entre resistência relativa à insulina e facilitação da resposta insulínica à glicose no metabolismo dos aminoácidos, aumentando os efeitos anabólicos da insulina sobre o metabolismo protéico e também do metabolismo lipídico. Ainda durante a puberdade, em função do aumento de esteróides sexuais, a composição corporal e o perfil de secreções hormonais passam por profundas mudanças. O aumento do hormônio do crescimento pode ser determinante no aumento da resistência insulínica. A hiperglicemia pode levar à glicação de proteínas extracelulares (como a proteína do LDL, que é mais aterogênica), à geração de radicais livres (aumento do estresse oxidativo) e de produtos terminais de glicação avançada. A geração de radicais livres pela hiperglicemia pode promover a aterogênese por meio da peroxidação da LDL, pela oxidação do fibrinogênio (aumento da coagulação), pelo aumento da ativação plaquetária pelo colágeno e pela diminuição da produção de óxido nítrico (YAMAGISHI et al., 2001). Além disso, a concentração mais elevada de insulina pode estar associada à hipertensão por múltiplos mecanismos, tais como a resistência à vasodilatação mediada pela insulina, alterações da função endotelial, retenção de sódio, dentre outros (MCFARLANE et al., 2001). Outro fator determinante do perfil lipídico são os fatores ambientais, como as modificações de hábitos e preferências alimentares introduzidas na infância e que podem se tornar permanentes. As gorduras saturadas são consideradas aterogênicas, pois se ingeridas em excesso, podem levar ao aumento do LDLc (NCEP, 2001). O consumo de ácidos graxos trans (ácidos graxos insaturados formados no processo de hidrogenação de óleos vegetais líquidos) deve ser inferior a 1%, e a ingestão de colesterol não deve ultrapassar 200mg por dia (LICHTENSTEIN & DECKELBAUM, 2001). A alimentação inadequada, somada ao sedentarismo, pode se associar à obesidade na infância e adolescência. Há descrições de relação direta entre a gravidade da obesidade na infância e o risco desta criança manter-se com sobrepeso ou obesidade na vida adulta. Sugere-se que talvez os fatores ambientais estejam mais implicados na perpetuação da obesidade durante o crescimento e desenvolvimento do que os fatores genéticos. Talvez esse mecanismo possa ser explicado pelo aumento da insulina e da leptina e pela redução da ativação da adiponectina, que por sua vez aumenta a oxidação dos ácidos graxos. Nestas crianças, a adiponectina possui uma associação positiva com a sensibilidade à insulina e com os níveis de HDLc e negativa com os níveis de triglicérides. Quanto ao LDL,

26 26 as crianças obesas parecem ter um maior percentual de padrão B (partículas menores e mais densas) do que crianças com peso normal para a estatura (SBC, 2005). Assim, mesmo nas crianças obesas com níveis desejáveis de LDLc, o seu perfil pode ser menos favorável, dada a proporção entre as subclasses de suas lipoproteínas (LIMA et al., 2004) PREVENÇÃO DA ATEROSCLEROSE NA INFÂNCIA E ADOLESCÊNCIA Os profissionais de saúde, dentre estes o médico, desempenham um papel importante na educação para a promoção da saúde de crianças e adolescentes no que diz respeito a comportamentos saudáveis. Os programas de prevenção da aterosclerose devem enfocar o controle da obesidade e das disfunções metabólicas, por meio de mudanças de hábitos alimentares e aumento de atividade física. Nesta faixa etária, além de inúmeros fatores da vida moderna, o estresse emocional, associado à preferência por alimentos doces e gordurosos, representa um obstáculo à modificação do estilo de vida (SBC, 2005). Do ponto de vista de prevenção de doença aterosclerótica, estratégias que elevam o nível de atividade física devem ser adotadas em intervenções na escola e na comunidade. A recomendação atual é de aproximadamente 30 minutos de atividade física moderada na maior parte dos dias (150 minutos/semana), mas idealmente a criança deve realizar cerca de 60 minutos diários de atividade física (SBC, 2005). Para a identificação da dieta aterogênica, pode ser avaliado o conteúdo alimentar de 24 horas ou de três dias (dois dias de semana e um do final de semana). É importante a detecção de uma ingestão excessiva de ácidos graxos saturados e trans, sódio e carboidratos simples e frituras (THOMPSON & BYERS, 1994). Além dos fatores anteriormente citados, o papel da família na promoção de hábitos saudáveis para crianças e jovens é fundamental nas condutas de prevenção de aterosclerose. A família desempenha um papel crítico na formação da criança para a atividade física através da motivação para que as estas se tornem fisicamente ativas e que desenvolvam atividades físicas prazerosas, no lazer ou em atividades esportivas. Adicionalmente, a família exerce grande influência nos hábitos alimentares das crianças, muitas vezes introduzindo e permitindo uma alimentação inadequada que pode gerar vícios futuros. Além disso, a família e os professores devem orientar as crianças para a prevenção do tabagismo. Quanto mais cedo as crianças tiverem acesso à informação sobre os males causados pelo hábito de fumar, mais distantes estas provavelmente ficarão da aceitação social do cigarro. A promoção dos cuidados com a saúde para crianças e jovens é também papel da sociedade. As escolas e a comunidade têm, potencialmente, a capacidade de melhorar a qualidade da promoção à saúde das crianças e adolescentes por meio da criação de

27 programas e serviços que promovam a educação dos jovens e os incentivem a modificar o estilo de vida (SBC, 2005) CONDUTAS TERAPÊUTICAS NAS DISLIPIDEMIAS A American Heart Association (AHA) tem apresentado grandes esforços para a redução dos fatores de risco para a doença cardiovascular e, de acordo com o III National Cholesterol Education Program (NCEP) de 2001, a redução destes riscos deve incluir menor ingestão de gordura saturada e colesterol, maior ingestão de fibras solúveis (pectinas de frutas e gomas de aveia e leguminosas) e de proteína de soja, redução do peso corporal e prática de atividade física regular (MARTINEZ, 2003). A dieta constitui o aspecto mais importante do tratamento na infância e adolescência, sendo também de grande importância no manejo de dislipidemia de adultos. Esquemas dietéticos para as hipercolesterolemias graves recomendam a restrição de gorduras saturadas e colesterol, aumentando a quantidade relativa de mono e poliinsaturados. Nas hipertrigliceridemias graves, o mesmo esquema é seguido, acrescido de redução de carboidratos simples. É importante levar em consideração que dieta com grande restrição de gorduras pode comprometer o aporte de energia, de vitaminas lipossolúveis e oligoelementos e também reduzir o HDLc (LEITE et al., 2003). A intervenção farmacológica das dislipidemias, segundo a AHA (ATP III) e as Diretrizes Brasileiras para Tratamento das Dislipidemias da Sociedade Brasileira de Cardiologia (SBC), deve ser norteada pela estratificação de risco, com utilização de dados epidemiológicos e de resultados de estudos clínicos para a justificativa do tratamento. Os fármacos mais utilizados são os inibidores da HMGCoA redutase (estatinas), os seqüestrantes de ácidos biliares (resinas), os derivados do ácido fíbrico (fibratos) e uma nova droga, o ezetimiba, que diminui a absorção do colesterol no intestino (MARTINEZ, 2003). A maioria das recomendações evita a indicação de medicamentos para crianças menores de 7 ou 10 anos de idade e, acima desta faixa de idade, apenas nos casos graves que não respondem satisfatoriamente aos esquemas dietéticos e de atividade física. Existem valores de referência estabelecidos para o LDLc para tratamento farmacológico hipolipemiante em crianças com idade igual ou maior que 10 anos, conforme a condição clínica. Um valor de LDLc maior que 190mg/dL, acompanhado de dislipidemia com base genética, ou um valor maior que 160mg/dL em presença de história familiar de DAC prematura ou dois ou mais fatores de risco indicam a necessidade da terapia farmacológica (SBC, 2005). A experiência com o uso de estatinas em crianças é limitada pela falta de estudos de longo prazo para a avaliação de desfechos clínicos e segurança. Estudos com lovastatina,

28 28 sinvastatinas, pravastatina e atorvastatinas mostaram reduções agressivas do LDLc. Todos estes fármacos têm sido utilizados nos Estados Unidos (EUA) e os dois últimos já possuem indicações para seu uso no Brasil. Entretanto, são contraindicados durante a gestação e as adolescentes e mulheres em idade fértil não devem fazer uso de estatinas sem uma adequada contracepção, pois seu uso pode estar associado com malformações fetais, especialmente do sistema nervoso central. As doses do fármaco a serem empregadas variam conforme os níveis basais de LDLc e, nas formas mais graves de hipercolesterolemia familiar, têm sido sugerida a associação de estatina com resina ou, mais recentemente, com ezetimiba (SBC, 2005). As estatinas podem induzir a aumento discreto das enzimas hepáticas e miosite, sendo recomendada a monitoração das enzimas hepáticas (transaminases) e da creatinofosfoquinase, especialmente na presença de sintomas musculares (TONSTAD, 2000). A colestiramina e o colestipol (seqüestrantes de ácidos biliares) são os medicamentos de escolha que oferecem maior segurança e são as drogas aprovadas para uso em crianças. Por diminuir a absorção intestinal de ácidos biliares, aumentam a expressão de receptores hepáticos para a LDL, determinando assim a redução do colesterol plasmático. O uso de doses mais elevadas que 8-10g/dia aumenta a incidência de efeitos adversos gastrointestinais e não acentua a redução do colesterol, devido a mecanismos compensatórios. Outras drogas, como o ácido nicotínico (efeito na redução da síntese hepática de VLDLc), são raramente indicados, visto que seus benefícios e segurança, a longo prazo, não estão ainda bem estabelecidos para os jovens (LEITE et al., 2003). A atividade física é um aspecto importante, tanto na prevenção como no tratamento das dislipidemias de crianças, jovens e adultos. Esta atividade deve ser regular, orientada e adequada a cada indivíduo, com benefícios na redução de TG, aumento do HDLc e também na manutenção de peso adequado. A melhor forma de abordagem do paciente dislipidêmico é o atendimento por uma equipe multidisciplinar (pediatra, cardiologista, nutricionista, psicólogo, educador físico e outros) recomendando-se, ainda, o envolvimento da família e da escola. Como o diagnóstico de dislipidemia pode gerar grande ansiedade para o paciente e a família, recomenda-se uma abordagem sempre cautelosa, onde cada caso deve ser avaliado de forma especial, dando ênfase na promoção da saúde cardiovascular e tendo o cuidado de não rotular o paciente como de risco (DIAMANTE, 2002). Orientações para mudança de estilo de vida, incluindo boa alimentação, eliminação do tabagismo e estímulo à prática de atividade física regular para crianças e adultos devem ser incorporados à prática diária de médicos e dos profissionais de saúde e educação (DIAMANTE, 2002).

29 GENÉTICA E DISLIPIDEMIAS Aproximadamente 80% do colesterol necessário ao organismo é sintetizado endogenamente. Assim, a influência da dieta alimentar sobre os níveis séricos de colesterol não é tão importante quanto o metabolismo celular, que é determinado primariamente pela constituição genética individual. Os avanços no conhecimento do metabolismo lipídico, aliados à utilização de novos procedimentos de biologia molecular, muito têm contribuído para a formulação de diagnósticos e orientação de condutas de prevenção e tratamento de dislipidemias (SBC, 2005). Devido à grande proporção da contribuição genética para o perfil lipídico individual, a identificação dos genes envolvidos na determinação dos diferentes fenótipos e dos passos metabólicos envolvidos é particularmente importante, uma vez que possibilita um melhor entendimento dos meios pelos quais as variações genéticas determinam objetivos clínicos. Permite ainda a identificação, num dado indivíduo ou em seus parentes, de combinações genéticas relacionadas a um maior ou menor risco de desenvolvimento de certos tipos de doenças (KORHONEN et al., 1999; MARTINEZ, 2003; MENDES-LANA et al., 2007). Dentre os genes envolvidos no metabolismo lipídico, quatro destes são especialmente interessantes pelas suas bem definidas funções e merecem ser descritos com mais detalhes: o gene codificador do receptor de LDL (LDLR), o gene da apolipoproteína E (APOE), o gene da apolipoproteína B (APOB) e o gene da apolipoproteína A5 (APOA5) GENE CODIFICADOR DO RECEPTOR DE LDL (LDLR) O receptor de LDL (LDLR) ou receptor B/E localiza-se na superfície celular de células extra-hepáticas e, através de ligações mediadas pela APOB, interage com as partículas circulantes de LDL, seguindo-se então a internalização desta partícula pela célula e sua consequente remoção do plasma. O gene codificador de LDLR localiza-se no braço curto do cromossomo 19, sendo composto de 18 éxons (PUBMED - ENTREZ GENE a ). Mutações neste gene levam ao distúrbio conhecido como hipercolesterolemia familiar (HF). A HF é uma das dislipidemias mais estudadas. É um distúrbio de caráter autossômico co-dominante, clinicamente caracterizado pelo aumento da concentração plasmática de LDLc (e, em menor proporção, de IDLc e VLDLc) associada ao aparecimento de xantomas em tendões e pele, arco corneano e obstrução coronária em idade jovem. A morte em idade prematura (geralmente antes dos 30 anos) em conseqüência a aterosclerose grave pode mesmo ser observada (BURTIS et al., 2008).

30 30 Análises moleculares já possibilitaram a identificação de mais de mutações diferentes no gene codificador de LDLR (VARRET et al., 2008). A maioria destas apresenta repercussão fenotípica tanto em homozigose quanto em heterozigose, com efeitos mais severos no primeiro caso - pacientes homozigotos podem apresentar concentrações plasmáticas de LDLc de 4 a 8 vezes maiores em relação a indivíduos normais (MOORJANI et al., 1993). Na maioria das populações, a frequência dos indivíduos heterozigotos é estimada em 1/500 (0,2%) indivíduos e a dos homozigotos em 1/10 6 (0,0001%) de indivíduos, podendo ocorrer manifestações clínicas de DAC a partir da segunda década de vida (SOUTAR & NAOUMOVA, 2007). Porém, em libaneses, franco-canadenses, afrikâners sul-africanos e judeus lituanos, as taxas de HF são muito mais altas, provavelmente devido ao efeito do fundador combinado com condições geográficas e sociais favoráveis (ALBERTO et al., 1999). No ano de 2002, estimou-se em 320 mil o número de indivíduos heterozigotos para HF no Brasil (SALAZAR et al., 2002) GENE DA APOLIPOPROTEÍNA E (APOE) A APOE foi identificada no começo da década de 70. Seu gene, localizado no braço longo do cromossomo 19 (PUBMED - ENTREZ GENE b ), apresenta uma região polimórfica que pode codificar três alelos comuns - ε2 (APOE c609c>t, rs7412), ε3 e ε4 (APOE c471t>c, rs429358) - que, por sua vez, codificam três isoformas - E2, E3 e E4, respectivamente - da proteína (EICHNER et al., 2002; FUZIKAWA et al., 2008). Desta forma, existem diferentes fenótipos de APOE, resultantes de seis genótipos: três homozigotos (ε2ε2, ε3ε3, ε4ε4) e três heterozigotos (ε2ε3, ε2ε4 e ε3ε4) (SCHWANKE et al., 2002). O alelo ε3 é o mais comum, estando presente em mais de 60% dos indivíduos de todas as populações já estudadas (BARONI et al., 2003). Em populações asiáticas, ameríndias e européias, este alelo atinge frequências próximas a 80% (MENDES-LANA et al., 2007). Acredita-se que os outros alelos, ε2 e ε4, teriam se originado por mutações ocorridas no alelo ε3. Como resultado, a isoforma E2 apresenta uma substituição de arginina por cisteína no códon 158, enquanto a isoforma E4 apresenta uma substituição de cisteína por arginina no códon 112, considerando-se a isoforma E3 como referência (SIEST et al., 1995; MARTINEZ, 2003). A figura 2 apresenta um esquema das três isoformas da APOE, com suas respectivas modificações de aminoácidos. As frequências dos alelos ε2, ε3 e ε4 variam bastante entre diferentes populações (SCHWANKE et al., 2002; EICHNER et al., 2002; MENDES-LANA et al., 2007), conforme demonstra a tabela 2. É ainda interessante destacar que existe um gradiente geográfico

31 mundial norte-sul no qual a frequência do alelo ε4 decresce enquanto a de ε3 aumenta (MENDES-LANA et al., 2007). 31 Figura 2 - Esquema das isoformas da apolipoproteína E Os polimorfismos da APOE constituem um dos fatores que mais afetam a variabilidade das concentrações dos lípides e lipoproteínas plasmáticos em populações adultas normais (DAVIGNON et al., 1998), em crianças (KURVINEN et al., 2005) e em pacientes portadores de DAC (STUYT et al., 1991), além de influenciarem a resposta de pacientes dislipidêmicos ao tratamento com estatinas (ILVESKOSKI et al., 2007). Tem sido sugerido que os alelos ε2 e ε4 da APOE possam representar marcadores genéticos para identificação de indivíduos com alto risco para desenvolvimento de DAC (SIEST et al., 1995; MARTINEZ, 2003). Sabe-se que a interação específica entre a APOE e os receptores de LDL é um mecanismo essencial no controle da remoção de partículas ricas em APOE, como o VLDL, os quilomícrons remanescentes e o IDL. Como a isoforma E2 da APOE apresenta baixa afinidade de ligação com os receptores de LDL - de fato, apresenta menos de 2% da afinidade das isoformas E3 e E4 (BARONI et al., 2003) - as partículas lipídicas que as expressam são lentamente removidas do plasma, desta forma configurandose um quadro de hiperlipoproteinemia do tipo III, com aumento de QM e remanescentes de VLDL no plasma. A conversão de VLDL em LDL também se encontra diminuída (FUZIKAWA et al., 2008; KORHONEN et al., 1999). O alelo ε2 está associado a menores níveis de LDLc (SOUSA et al., 2008 a ) e ao aumento das concentrações de TG e de lipoproteínas remanescentes, quando comparado aos alelos ε3 e ε4 (DAVIGNON et al., 1999). A isoforma E4, por sua vez, apresenta alta afinidade de ligação com os receptores de LDL, maior até que aquela observada com a isoforma E3. Como o VLDL, o IDL e os QM são removidos muito rapidamente do plasma, um mecanismo de feedback ativa uma resposta hepática de diminuição de expressão de receptores de LDL, o que resulta no aumento dos níveis plasmáticos de LDLc e configura um quadro de hiperlipoproteinemia do tipo II (SIEST et al., 1995). Em essência, um efeito oposto àquele gerado pela presença da isoforma E2 (FUZIKAWA et al., 2008). Assim, os indivíduos com genótipos ε4ε4 e ε3ε4 apresentam

32 níveis mais altos de LDLc e CT em relação a indivíduos ε3ε3, sendo particularmente susceptíveis ao desenvolvimento precoce de DAC. 32 Tabela 2 - Frequências relativas dos alelos do polimorfismo HhaI da APOE em diferentes populações População Estudada Tamanho Frequências alélicas amostral ε2 ε3 ε4 Africanos (nigerianos) ,028 0,662 0,310 Afroamericanos ,131 0,668 0,201 Índios americanos homens 0,017 0,850 0, mulheres 0,016 0,858 0,126 Caucasianos Massachusetts (EUA) homens 0,083 0,785 0, mulheres 0,077 0,789 0,133 Munster (Alemanha) ,082 0,782 0,136 Finlândia ,039 0,767 0,194 França ,081 0,802 0,117 Itália ,073 0,827 0,100 Chineses homens 0,074 0,844 0,082 Japoneses ,037 0,846 0,117 Mexicano-americanos ,039 0,859 0,102 Brasil Bambuí, MG (+60 anos) 0,06 0,80 0,14 Gravataí, RS ,07 0,77 0,16 São José do Rio Preto, SP ,04 0,84 0,12 Ouro Preto, MG ,08 0,72 0,20 1 KAMBOH et al., 1989; 2 HOWARD et al., 1998; 3 KATAOKA et al., 1996; 4 SCHAEFER et al., 1994; 5 ASSMAN et al., 1984; 6 LEHTMÄKI et al., 1990; 7 LUC et al., 1994; 8 CATTIN et al., 1997; 9 EVANS et al., 1993; 10 ETO et al., 1989; 11 HANIS et al., 1991; 12 FUZIKAWA et al., 2008; 13 GOTTLIEB et al., 2005; 14 SOUZA et al., 2007; 15 MENDES-LANA et al., Adaptado de EICHNER et al., Finalmente, a APOE é sintetizada e secretada também no sistema nervoso central, participando de processos tais como proteção e reparo neuronal (SCHWANKE et al., 2002). Vários estudos independentes mostraram associação entre o alelo ε4 da APOE e a Doença de Alzheimer (DA) de início precoce. Os mecanismos propostos para esta relação sugerem

33 que a presença do alelo ε4 esteja associada a um depósito mais severo de proteína beta amilóide (Aβ) no meio extracelular cerebral (OJOPI et al., 2004) GENE DA APOLIPOPROTEÍNA B (APOB) A APOB é a proteína principal da partícula de LDL e é o maior ligante fisiológico para o receptor de LDL (KORHONEM et al., 1999). O gene codificador da APOB se localiza no braço curto do cromossomo 2 (PUBMED - ENTREZ GENE c ) e pode dar origem a duas formas diferentes da proteína: APOB100 e APOB48. A APOB100, sintetizada no fígado, é o produto da transcrição integral do gene, enquanto a APOB48 é produzida no intestino delgado, como resultado de uma modificação pós-transcripcional do mrna da APOB100. A APOB48 não apresenta o domínio C-terminal da APOB100 e, portanto, não se liga ao receptor de LDL (HONG et al., 2001). Mutações no gene da APOB podem levar a uma diminuição no catabolismo do LDLc, resultando no quadro clínico conhecido como defeito familiar da APOB, um distúrbio de caráter autossômico co-dominante. Em conseqüência destas alterações, ocorre diminuição da afinidade de ligação da APOB100 com o receptor de LDL, comprometendo a remoção desta partícula da corrente sangüínea e resultando em conseqüente desenvolvimento de hipercolesterolemia (devido ao aumento exclusivo de LDLc) (MARTINEZ, 2003). O defeito familiar da APOB100 é fenotipicamente similar à HF e clinicamente indistinguível desta. Apesar de várias mutações já terem sido descritas para o gene da APOB, apenas três já foram comprovadamente ligadas ao desenvolvimento do distúrbio: as mutações R3500Q (Arg 3500 Gln), R3500W (Arg 3500 Trp) e R3531C (Arg 3531 Cys) (FISHER et al., 1999; CAVALLI et al., 2000), todas localizadas na região do domínio funcional do gene da APOB. A mutação R3500Q foi a primeira destas mutações a ser descrita (CAVALLI et al., 2001), e estudos independentes já demonstraram sua ocorrência em caucasianos dos EUA, Canadá, Inglaterra, Dinamarca, Áustria, Alemanha, Itália, Holanda, Noruega, Austrália e África do Sul (CAVALLI et al., 2000). Embora as estimativas de frequência sejam baseadas em diferentes populações, acredita-se que a mutação R3500Q seja tão freqüente quanto a HF em heterozigose, ou seja, 1/700 (0,14%) a 1/500 (0,2%) em indivíduos caucasianos na América do Norte e Europa (BORÉN et al., 2001). Mais de 10 polimorfismos comuns no gene da APOB ou em suas regiões flanqueadoras já foram identificados (dentre estes AluI, EcoRI, HincII, MspI, PvuII, XbaI e 3 HVR). Vários estudos já foram realizados procurando estabelecer relações entre esses loci polimórficos e os níveis plasmáticos de CT, LDLc e APOB mas, até o momento, os resultados têm sido contraditórios - geralmente, as associações são detectadas em populações caucasianas, mas não em populações asiáticas (HONG et al., 2001).

34 34 A tabela 3 mostra as freqüências alélicas e genotípicas em relação ao polimorfismo MspI, também denominado R3611Q ou ainda Arg3611Gln (indicando a substituição, no códon 3611, de uma arginina por uma glutamina). Tabela 3 - Frequências alélicas e genotípicas do polimorfismo MspI da APOB em diferentes populações População estudada Tamanho Frequência genotípica Frequência alélica amostral M+M+ M+M- M-M- M+ M- Estados Unidos 1 ND 0,77 0,21 0,02 0,88 0,12 Sérvia ,79 0,20 0,01 0,89 0,11 Bulgária ,92 0,078 0,002 0,96 0,04 Brasil ,85 0,144 0,006 0,92 0,08 Caucasiana 5 ND Variável Variável Variável 0,78-0,93 0,07-0,22 1 HUANG et al., 1988; 2 GLISIC et al., 1995; 3 HORVATH et al., 2003; 4 CAVALLI et al., 2001, 5 HONG et al., 2001 (PRIESTLEY, 1985; HEGELE, 1986; DE BENEDICTIS, 1993) No Brasil, Cavalli e colaboradores, em 2000 (CAVALLI et al., 2000), estudaram os polimorfismos MspI, XbaI, Ins/Del e 3 HVR do gene da APOB, de modo a determinar sua frequência e influência no perfil lipídico de pacientes hipercolesterolêmicos da cidade de São Paulo - SP. Outro estudo, realizado em 2003 (SCARTEZINI et al., 2003), avaliou os polimorfismos XbaI e EcoRI do mesmo gene, procurando por associações entre a presença destes polimorfismos e um diagnóstico estabelecido de DAC, tendo como objeto de estudo uma amostra da população da cidade de Ribeirão Preto - SP. A padronização de um procedimento para a identificação das mutações R3500Q, 3531C e do polimorfismo MspI foi a proposta de um estudo realizado por Cavalli e colaboradores, em 2001 (CAVALLI et al., 2001). Atualmente, propõe-se que a análise de haplótipos, e não de apenas um marcador dialélico, seja mais eficiente na identificação de genótipos associados ao risco de desenvolvimento de DAC (HONG et al., 2001) GENE DA APOLIPOPROTEÍNA A5 (APOA5) No ano de 2001, dois grupos independentes, Pennachio e colaboradores (PENNACHIO et al., 2001) e Van der Vliet e colaboradores (VAN DER VLIET et al., 2001) identificaram um novo membro da família das apolipoproteínas, o gene da apolipoproteína A5 (APOA5). Localizado no braço longo do cromossomo 11 (PUBMED - ENTREZ GENE d ) este gene foi identificado como o quarto membro do conjunto gênico (cluster) das

35 35 apolipoproteínas APOA4/APOC3/APOA1. Este conjunto gênico é uma região bem conhecida por sua influência sobre os níveis plasmáticos de lípides e lipoproteínas. Mutações nesta região afetam o perfil lipídico tanto em humanos como em camundongos, e alguns polimorfismos do gene da APOA5 já foram associados à hipertrigliceridemia grave (HTG) (PENACCHIO et al., 2001; SOUSA et al., 2008 b ). A APOA5 é encontrada nas partículas de VLDL, HDL e QM, mas não no LDL (BECKSTEAD et al., 2003; WEINBERG et al., 2003; O BRIEN et al., 2005). Seu gene é preferencialmente expresso no fígado, mas sua exata função biológica ainda não está clara. Alguns estudos, porém, demonstraram que os níveis de APOA5 se relacionam inversamente aos níveis de TG, ou seja, camundongos transgênicos com superexpressão de APOA5 apresentavam de 60 a 70% de decréscimo nos níveis de TG, enquanto camundongos nocaute (knock-out) para o mesmo gene tinham aproximadamente quatro vezes os níveis de TG em relação aos controles (TALMUD et al., 2004). O gene da APOA5 é polimórfico. Os três haplótipos mais comuns da APOA5 (APOA5*1, APOA5*2 e APOA5*3) podem ser definidos por 5 SNPs (single nucleotide polymorphism), cujas freqüências variam de acordo com a população analisada (FRANCÉS, 2005). APOA5*1, definido pela presença de alelos comuns nos cinco sítios de SNPs, é considerado o haplótipo selvagem; APOA5*2 apresenta alelos raros em 4 sítios (-1131T>C, -3A>G, 715G>T e 1891T>C) e APOA5*3 apresenta um alelo raro (56C>G) que resulta na substituição de triptofano por serina no resíduo 19 (S19W) (TALMUD et al., 2005). Excetuando-se o polimorfismo 56C>G, os outros quatro SNPs apresentam forte desequilíbrio de ligação. Assim, os três haplótipos comuns resultantes - APOA5*1 (11111), APOA5*2 (22122) e APOA5*3 (11211) representam aproximadamente 98% da população caucasiana (FRANCÉS, 2005), sendo que APOA5*1 é encontrado com uma freqüência de 69%, neste mesmo grupo étnico (TALMUD et al., 2005). A tabela 4 mostra as variações das frequências genotípicas e alélicas do polimorfismo -1131T>C (rs662799) da APOA5 para diferentes populações. Os haplótipos APOA5*2 e APOA5*3 são de particular interesse, uma vez que se encontram associados ao aumento dos níveis plasmáticos de TG em caucasianos saudáveis (PENNACCHIO et al., 2001; PENNACCHIO et al., 2002; TALMUD et al., 2002; PENNACCHIO et al., 2003), em afro-americanos e hispânicos (PENNACCHIO et al., 2002) e em indivíduos portadores de dislipidemias (RIBALTA et al., 2002; HORINEK et al., 2003). O polimorfismo APOA5-1131T>C tem sido associado a aumento de risco de desenvolvimento de hipertrigliceridemia em crianças japonesas (ENDO et al., 2002) e também a aumento da susceptibilidade à HTG em pacientes espanhóis dislipidêmicos (SOUSA et al., 2008 c ). As variantes alélicas da APOA5 também vêm sendo associadas ao desenvolvimento de doenças coronarianas (SOUSA et al., 2008 b ). O estudo prospectivo Epic-Norfolk Population Study (VAESSEN et al., 2006) demonstrou que o polimorfismo -

36 T>C foi associado a aumento de risco de DAC tanto para homens quanto para mulheres, independentemente dos valores dos níveis plasmáticos de APOA5. Este polimorfismo também foi associado a aumento de susceptibilidade ao desenvolvimento de DAC na população chinesa (LIU et al., 2005). Tabela 4 - Frequências alélicas e genotípicas do polimorfismo -1131T>C da APOA5 em diferentes populações População estudada Tamanho Frequência genotípica Frequência alélica amostral TT TC CC T C Afroamericanos mulheres 0,777 0,213 0,010 0,884 0,116 Afroamericanos homens 0,772 0,218 0,010 0,881 0,119 Hispânicos mulheres 0,668 0,310 0,021 0,824 0,176 Hispânicos homens 0,741 0,245 0,014 0,863 0,176 Hispânicos ,853 0,138 0, ,078 Caucasianos mulheres 0,866 0, ,933 0,067 Caucasianos homens 0,872 0, ,936 0,064 Inglaterra homens 0,883 0,111 0,006 0,940 0,060 Canadá caucasianos 0,848 0,138 0,014 0,917 0,083 Japão ,418 0,477 0,105 0,656 0,344 Japão ,408 0,476 0,116 0,646 0,354 China ,404 0,494 0,102 0,651 0,349 1 PENNACHIO et al., 2002; 2 SOUSA et al., 2008 b ; 3 TALMUD et al., 2002; 4 LEE et al., 2003; 5 NABIKA et al., 2002; 6 ENDO et al., 2002; 7 LI et al., 2004 Finalmente, a associação entre o polimorfismo -1131T>C da APOA5 e as variantes ε2 e ε4 da APOE pode aumentar a susceptibilidade a desenvolvimento de HTG em pacientes espanhóis (SOUSA et al., 2008 c ) e holandeses (HENNEMAN et at., 2007). 1.6 GENÉTICA E DOENÇA ARTERIAL CORONARIANA A DAC é a causa mais comum de morte nos países desenvolvidos em todo o mundo e apresenta taxas ascendentes nos países em desenvolvimento (MENDES-LANA et al., 2007). Estima-se que as doenças cardiovasculares sejam responsáveis pela morte de 17 milhões de pessoas no mundo (WHO, 2003). Nos EUA, mais de um milhão de casos de IAM ocorrem a cada ano e aproximadamente 7 pacientes em 10 sobrevivem ao evento agudo.

37 37 No Brasil, a doença coronariana já ocupa o primeiro lugar como causa de morte em algumas faixas de idade da população adulta, sem diferenciação de gênero (MENDES-LANA et al., 2007). Segundo a OMS (WHO, 2007), as doenças cardiovasculares são distúrbios que afetam a função do coração e dos vasos sangüíneos. Dentre as mais importantes estão o IAM, acidente vascular cerebral (AVC), isquemia cerebral transitória e doença arterial obstrutiva periférica (DAOP), que são resultantes de eventos trombóticos arteriais. A doença cardiovascular coronariana caracteriza-se por lesões coronarianas potencialmente capazes de evoluir para síndrome coronariana aguda (SCA) (AHA, 2004) e, atualmente, é aceita a teoria de que a aterosclerose (processo de degeneração gordurosa, com espessamento e endurecimento da parede arterial) é o mecanismo comum entre as patologias cardiovasculares (MARTINEZ, 2003). A aterosclerose é uma doença de evolução lenta e silenciosa, de desenvolvimento complexo e influenciado por uma miríade de fatores de risco, dentre os quais se incluem hipertensão, dislipidemia, predisposição genética, sedentarismo, obesidade, resistência à insulina, diabetes mellitus e tabagismo (GOTTLIEB et al., 2005). Duas teorias principais têm sido propostas para os fatores iniciadores associados à aterosclerose. A primeira envolve a alteração dos lípides plasmáticos e hipercolesterolemia e, conseqüentemente, a formação de extensas lesões ricas em lípides sem evidências de perda do endotélio e presença de trombos. A segunda teoria de aterosclerose envolve lesão endotelial num estado de normocolesterolemia como fator iniciador, sendo que essa lesão ocorre em locais de fluxo turbulento. Embora essas duas teorias de aterosclerose apresentem diferenças nos seus fatores iniciadores e tenham sido estudadas independentemente, existem alguns aspectos comuns entre ambas. Quando a lesão e a hipercolesterolemia ocorrem juntas, os efeitos no desenvolvimento da aterosclerose são provavelmente aditivos ou até mesmo sinérgicos (WINOCOUR, 1994). As manifestações clínicas da aterosclerose surgem, em geral, muitos anos após o início da doença. Estudos em artérias de jovens falecidos trouxeram evidências de que a aterosclerose tem início na infância. Deposições lipídicas arteriais são relativamente comuns em jovens e sua frequência, distribuição e evolução podem ser influenciadas pelos níveis lipídicos. As variações genéticas associadas ao aumento dos níveis plasmáticos de colesterol, como alterações nos loci responsáveis por estruturas de lipoproteínas e de receptores de LDL, podem ser indiretamente associadas a um alto risco de desenvolvimento de aterosclerose e DAC precoce (CAVALLI et al., 2001), uma vez que o LDL elevado constitui a principal via pela qual o colesterol incorpora-se nas placas de ateroma (GAW et al., 2001). As alterações do metabolismo lipídico provavelmente têm um papel relevante na evolução da aterosclerose (FROHLICH & DOBIASOVA, 2003).

38 38 Presentemente, a maioria das análises econômicas e dos estudos de custoefetividade sobre o manejo da dislipidemia concentra-se nos custos associados com as doenças cardiovasculares que são prevenidas através da diminuição dos níveis de colesterol. Nos últimos 25 anos, vários estudos clínicos e observacionais já comprovaram que a redução dos níveis séricos de colesterol (mais especificamente o de LDLc) é um fator significativo para a prevenção de DAC, como mostram seus resultados, abaixo relacionados: - Estudo de Framigham evidenciou a importância do nível de colesterol em indivíduos normais no desenvolvimento de complicações da doença aterosclerótica; - MRFIT (Multiple Risk Factor Intervention Trial) durante um período superior a 6 anos, realizou-se um acompanhamento em mais de 360 mil pacientes nos EUA para definir e estudar o comportamento dos principais fatores de risco coronarianos, demonstrando, ao seu final, a relação negativa entre HDLc e DAC e positiva entre LDLc e DAC; - PROCAM (Prospective Cardiovascular Munster Study) demonstrou, de forma clara, a confirmação dos outros benefícios provenientes da redução da hipertrigliceridemia no que diz respeito a outros fatores de risco para DAC, mostrando assim a importância do tratamento desta dislipidemia; - Estudo dos sete países demonstrou haver correlação entre níveis médios de colesterol de diferentes populações e índices de mortalidade por DAC. - Meta-análises de Gould e colaboradores demonstraram haver redução de 13-15% do risco de mortalidade relacionada à DAC e 10-11% do risco de mortalidade em geral para cada 10% de redução nos níveis de CT. - Cholesterol Treatment Trialists' Collaborators demonstrou haver redução de 19% do risco de mortalidade relacionada à DAC e 12% do risco de mortalidade em geral para cada 1mmol/L (38,7mg/dL) de redução nos níveis de LDLc. No Brasil, os dados sobre a incidência de DAC e suas manifestações são muito escassos, sendo os estudos populacionais muito restritos, baseados em pequenas amostras ou em grupos específicos (LESSA et al., 1998). A quase inexistência de estudos que representem a população brasileira como um todo se deve, primariamente, a quatro fatores importantes: a grande heterogeneidade étnica da população brasileira; o fato de o Brasil ser um país de dimensões continentais, com uma população distribuída de forma heterogênea ao longo de sua expansão territorial (DOS SANTOS & ZAGO, 2003); a falta de recursos financeiros para investigações populacionais; e a carência de pesquisadores em epidemiologia das doenças crônicas não-transmissíveis e seus determinantes (LESSA et al., 1998). O único estudo brasileiro abrangente (FORTI et al., 1997) incluiu várias capitais e foi realizado em 1997, revelando diferenças regionais importantes nos níveis de lípides séricos, principalmente do HDLc e em pacientes com DAC. Dados mais recentes nos apresentam a

39 39 DAC como a segunda causa de morte cardiovascular no Brasil e a primeira em São Paulo e outras capitais (LESSA, 2003). Todos esses dados evidenciam, de forma bastante concreta, o importante papel do colesterol no desenvolvimento de doenças cardiovasculares e, de forma mais indireta, seu alto impacto econômico e social. A prevenção das hipercolesterolemias, sua detecção precoce em indivíduos jovens e adultos e o tratamento das dislipidemias, portanto, configuram-se cada vez mais, e em nível mundial, como importantes medidas de saúde pública DAC E POLIMORFISMOS DA APOLIPOPROTEÍNA E Calcula-se que os polimorfismos da APOE sejam responsáveis por uma variação de 4 a 15% dos níveis do LDLc. Como mencionado anteriormente, o alelo ε4 se encontra associado a níveis plasmáticos elevados de LDLc, enquanto o alelo ε2 se relaciona a níveis diminuídos de LDLc e concentrações elevadas de TG. Outros estudos apontaram essas associações em aproximadamente 7%, das quais 2,8% podem ser consideradas representativas de risco para DAC - uma contribuição considerável quando se considera um único fator genético (SOUZA et al., 2007). Recentemente, realizou-se um estudo de meta-análise envolvendo os polimorfismos da APOE e o risco de desenvolvimento de DAC. Foram avaliados 48 estudos, publicados de 1983 a 2003 e incluindo principalmente populações européias, norte-americanas e asiáticas. Neste estudo, demonstrou-se que o risco de DAC em indivíduos portadores do alelo ε4 é 42% maior do que em relação àqueles com genótipo ε3/ε3 (SONG et al., 2004). Alguns estudos brasileiros recentes procuraram estabelecer relações entre os polimorfismos da APOE e o risco de hipertensão e desenvolvimento de DAC. O BHAS (Bambuí Health Aging Study) (FUZIKAWA et al., 2008), realizado em 2008, envolveu 1406 indivíduos com idade acima de 60 anos, na cidade de Bambuí, Minas Gerais. O objetivo do estudo foi tentar estabelecer relações entre os polimorfismos da APOE e a presença de hipertensão arterial. Vários outros fatores de risco para DAC também foram analisados, entre estes o IMC, os níveis plasmáticos de lípides, creatinina e ácido úrico e ainda outras diversas variáveis, tais como idade, sexo, tabagismo, etilismo e diabetes. Apesar do estudo não encontrar associações significativas entre a presença de hipertensão e os polimorfismos da APOE, ficou evidenciado o efeito dos alelos ε2 e ε4 sobre os níveis de LDLc (diminuição e aumento, respectivamente). Outro estudo, realizado em 2007 na Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto (SOUZA et al., 2007), envolveu 200 indivíduos, divididos em dois grupos: portadores de DAC (100 indivíduos, com lesões confirmadas por angiografia coronária) e nãoportadores de DAC (100 indivíduos, comprovadamente sem lesões). Contrariamente a

40 40 alguns outros estudos, não foi encontrada associação significativa entre o alelo ε4 e a DAC. Porém, no grupo dos não-portadores de DAC, mais uma vez foi encontrada associação entre o alelo ε4 e níveis aumentados de LDLc. Finalmente, um terceiro estudo, realizado em 2005 na PUC-RS (GOTTLIEB et al., 2005) avaliou, em indivíduos sem histórico de doença cardiovascular, a possível associação entre os níveis de LDL oxidada (LDLox) e os polimorfismos da APOE. Entretanto, nenhuma correlação foi observada neste grupo. Embora a associação entre os alelos da APOE e a variação individual nos níveis plasmáticos de lípides e lipoproteínas, bem como a participação destas variantes genéticas no risco de DAC já tenham sido descritos em diferentes populações, a maior parte destas evidências são resultados de estudos envolvendo populações de origem européia ou norteamericana. Até o momento, são poucos os estudos realizados com a APOE na população brasileira, extremamente heterogênea em sua constituição (MENDES-LANA et al., 2007), havendo uma lacuna ainda mais considerável para a população na faixa etária pediátrica. Dessa forma, considera-se importante a avaliação do polimorfismo da APOE em grupos de crianças e jovens em nossa população, por considerar o importante papel desta lipoproteína no metabolismo lipídico e seu possível envolvimento nos mecanismos que desencadeiam o desenvolvimento da aterosclerose e seu progresso. Como a aterosclerose é uma doença multifatorial, iniciada ainda na infância e envolvendo a participação de diversos fatores genéticos e ambientais, é de importância fundamental a identificação de marcadores genéticos e determinantes biológicos associados a esta doença, para melhor fundamentar as condutas de prevenção e tratamento, especialmente nos grupos de alto risco.

41 41 OBJETIVOS

42 42 2 OBJETIVOS 2.1 OBJETIVO GERAL Analisar as frequências de alterações em três genes relacionados ao metabolismo lipídico: apolipoproteína E (APOE), apolipoproteína B (APOB) e apolipoproteína A5 (APOA5) em indivíduos dislipidêmicos e normolipêmicos, bem como estabelecer possíveis relações entre o perfil genético e o perfil lipídico destes indivíduos avaliados. 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 1. Caracterizar clinicamente os participantes quanto à idade, sexo, IMC, histórico familiar de DAC, uso de medicamentos, estado geral de saúde e hábitos de vida (dieta, atividade física, alcoolismo, tabagismo); 2. Caracterizar o perfil lipídico de todos os participantes; 3. Identificar o genótipo de cada um dos participantes em relação aos polimorfismos ε2, ε3 e ε4 no éxon 4 do gene codificador da apolipoproteína E; 4. Analisar a frequência da mutação R3500Q e do polimorfismo MspI no éxon 26 do gene codificador da apolipoproteína B; 5. Analisar a frequência do polimorfismo -1131T>C na região promotora do gene codificador da apolipoproteína A5; 6. Estabelecer as frequências alélicas encontradas para cada uma das variáveis estudadas e comparar os resultados obtidos com aqueles descritos na literatura; 7. Avaliar as correlações entre os perfis genéticos e os perfis lipídicos de cada paciente, em relação a cada uma das variáveis estudadas. Comparar os resultados obtidos com aqueles descritos na literatura.

43 43 MATERIAIS E MÉTODOS

44 44 3 MATERIAL E MÉTODOS 3.1 CASUÍSTICA Este estudo, que envolve crianças e jovens normolipêmicos e dislipidêmicos em idade escolar, faz parte do projeto intitulado Análise da freqüência de mutações e tipificação de genótipos clinicamente relacionados à hipercolesterolemia em indivíduos de Minas Gerais, aprovado no Comitê de Ética em Pesquisa da UFMG (ETIC 446/04, de 01/12/2004), pela Diretoria de Ensino, Pesquisa e Extensão (DEPE/HC-UFMG, n 089/04) e pela Faculdade de Medicina da UFMG (parecer 54/04) (Apêndice). As crianças e adolescentes participantes do estudo (n=130), com idade compreendida entre 2 a 19 anos, foram selecionadas pela equipe de médicos pediatras do Anexo São Vicente do Hospital das Clínicas (HC) da Universidade Federal de Minas Gerais. Aos indivíduos selecionados, bem como aos seus pais ou responsáveis, foi feito o esclarecimento da pesquisa. Aqueles que concordaram em participar do estudo assinaram um Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (sendo necessária a permissão dos pais ou responsáveis, no caso de menores de 18 anos) (Anexo 1) e responderam a perguntas sobre os dados demográficos e outros para preenchimento da Ficha Clínica (Anexo 2). Para complementação dos dados clínicos e laboratoriais da Ficha Clínica, também foram consultados os prontuários dos pacientes, com devida autorização da equipe médica e do hospital. Para a composição do grupo de dislipidêmicos (pacientes) foi adotado o critério de diagnóstico clínico prévio de hipercolesterolemia (TG >130mg/dL, CT 170mg/dL e/ou LDLc 130mg/dL) (SBC, 2005), segundo as orientações da equipe médica do Ambulatório de Doenças Nutricionais do HC-UFMG. O HC-UFMG é um centro de referência que recebe pacientes de todas as regiões do estado de Minas Gerais. A rotina de atendimento de crianças e adolescentes no seu Ambulatório de Doenças Nutricionais ocorre com marcação de consultas após a avaliação geral de um pediatra geral do HC ou na rede de atendimento do Sistema Único de Saúde (SUS), os quais fazem o encaminhamento dos pacientes para este setor específico. As primeiras consultas são realizadas por professor/médico do serviço, que decide sobre a propedêutica e os atendimentos complementares necessários. As consultas subseqüentes são agendadas conforme a necessidade de cada caso e diagnóstico, com no mínimo um atendimento semestral e no máximo um atendimento por semana. Os pacientes podem ser encaminhados para outros profissionais como nutricionistas, que avaliam prioritariamente crianças com obesidade e dislipidemia, psicólogos e terapeuta ocupacional, que avaliam apenas as crianças obesas, com grupo operativo e fisioterapeuta, para estabelecer programas de atividades físicas para as crianças obesas e com sobrepeso.

45 45 O grupo normolipêmico (controle) foi constituído por crianças e jovens hígidos, sob o ponto de vista clínico e laboratorial, selecionados em três locais diferentes: entre os alunos do Centro Pedagógico da UFMG, entre os alunos da Escola Estadual Alcindo Vieira, localizada no bairro Ermelinda (Belo Horizonte), e entre um grupo de jovens da cidade de Itabira, UFMG. As crianças e jovens selecionados para a composição do grupo controle apresentavam o mesmo nível sócio-econômico dos indivíduos dislipidêmicos. A coleta de sangue dos indivíduos dislipidêmicos foi realizada no Laboratório Central do Hospital das Clínicas, sempre em dias previamente agendados e em comum acordo e com a colaboração da equipe de funcionários do local. Para os indivíduos normolipêmicos, a coleta foi feita no local, com equipe especializada do Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas (DACT) da Faculdade de Farmácia da UFMG. Para a coleta do sangue, todos os indivíduos foram devidamente orientados a observar as recomendações de jejum de horas e a não realizar atividade física vigorosa no dia da coleta ou dia anterior, assim como a não consumir etanol por 72 horas antes da coleta (SBC, 2005). 3.2 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO E EXCLUSÃO CRITÉRIOS DE INCLUSÃO 1. Crianças e adolescentes com idades de 2 a 19 anos. 2. No caso de indivíduos aparentados (irmãos), apenas um foi selecionado aleatoriamente, para continuar no estudo, devido às análises genéticas realizadas CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO A existência de qualquer um dos estados listados a seguir resultou na exclusão do indivíduo: 1. Alcoolismo 2. Anorexia nervosa 3. Diabetes mellitus 4. Doença hepática 5. Gravidez 6. Hipotireoidismo 7. Lúpus eritematoso sistêmico 8. Pancreatite 9. Síndrome nefrótica 10. Insuficiência renal crônica 11. Uso de medicamentos contendo: estrogênios, androgênios, esteróides anabolizantes, β-bloqueadores, carbamazepina, progestinas, corticosteróides, diuréticos tiazídicos.

46 AMOSTRAS BIOLÓGICAS Foram coletadas amostras de 10mL de sangue venoso dos pacientes (5mL sem anticoagulante e 5mL em EDTA), após jejum de 12-14h, em tubos do Sistema Vacutainer (Becton-Dickinson). As amostras de sangue obtidas foram então centrifugadas a rpm por 10 minutos para separação do plasma e do soro e divididas em várias alíquotas. Conforme necessário, essas alíquotas foram processadas ou estocadas a -80 C. 3.4 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL Os seguintes parâmetros foram avaliados neste estudo: 1. Triglicérides; 2. Colesterol total; 3. Colesterol HDL; 4. Colesterol LDL; 5. Apolipoproteína A1; 6. Apolipoproteína B; 7. Índice APOB/APOA1 8. Perfil genético individual em relação aos alelos ε2, ε3 e ε4 no gene codificador da apolipoproteína E; 9. Perfil genético individual em relação à mutação R3500Q e ao polimorfismo MspI no gene codificador da apolipoproteína B; 10. Perfil genético individual em relação ao polimorfismo -1131T>C no gene codificador da apolipoproteína A5; 3.5 DETERMINAÇÃO DOS NÍVEIS PLASMÁTICOS DE LÍPIDES E LIPOPROTEÍNAS TRIGLICÉRIDES A determinação dos níveis plasmáticos de TG foi realizada através do uso do conjunto diagnóstico BIOBRÁS TRIGLICÉRIDES GPO-PAP, cujo princípio analítico é o método enzimático colorimétrico, seguindo-se as instruções fornecidas pelo fabricante. O soro controle Bioclin/Quibasa foi utilizado para verificação de desempenho durante o ensaio COLESTEROL TOTAL A determinação dos níveis plasmáticos de CT foi realizada através do uso do conjunto diagnóstico BIOBRÁS COLESTEROL ENZIMÁTICO, cujo princípio analítico é o

47 método enzimático colorimétrico, seguindo-se as instruções fornecidas pelo fabricante. O soro controle Bioclin/Quibasa foi utilizado para verificação de desempenho durante o ensaio COLESTEROL HDL A determinação dos níveis plasmáticos de HDLc foi realizada através do uso do conjunto diagnóstico BIOBRÁS HDL COLESTEROL DIRETO (RANDOX Laboratories, United Kingdon), cujo princípio analítico é o método enzimático de eliminação, seguindo-se as instruções fornecidas pelo fabricante. O soro controle Bioclin/Quibasa foi utilizado para verificação de desempenho durante o ensaio COLESTEROL LDL A determinação dos níveis plasmáticos de LDLc foi estimada utilizando um procedimento simplificado descrito por Friedewald e colaboradores (FRIEDEWALD et al., 1972). Neste método, os níveis de CT, TG e HDLc são previamente determinados e as concentrações obtidas são expressas em mg/dl. O VLDLc é estimado como o valor dos triglicérides plasmáticos dividido por cinco (TG/5), e o LDLc pode ser calculado usando a seguinte equação: LDLc = colesterol total [HDLc + (TG/5)] Esta equação não é apropriada para ser usada com amostras nas quais as concentrações de triglicérides excedam 400mg/dL, em amostras com presença de QM e, ainda, em caso de disbetalipoproteinemia (aumento de IDLc) APOLIPOPROTEÍNA A1 A determinação quantitativa da APOA1 foi realizada no soro utilizando o conjunto diagnóstico Biotécnica Apolipoproteína A (APOA) Turbidimetria, cujo princípio analítico é o imunoensaio turbidimétrico, e seguindo as instruções fornecidas pelo fabricante. O ensaio foi realizado utilizando-se o aparelho Cobas Mira Plus em sistema completamente automatizado. As amostras foram acondicionadas no aparelho e os resultados impressos diretamente após o término da análise. O soro controle Apolipoproteínas (Biotécnica Biotecnologia Avançada) foi utilizado para verificação de desempenho durante o ensaio. Os valores de referência para APOA1 variam de 110 a 210mg/dL APOLIPOPROTEÍNA B A determinação quantitativa da APOB foi realizada no soro utilizando o conjunto diagnóstico Biotécnica Apolipoproteína B (APOB) Turbidimetria, cujo princípio analítico é o imunoensaio turbidimétrico, e seguindo as instruções fornecidas pelo fabricante.

48 48 O ensaio foi realizado utilizando-se o aparelho Cobas Mira Plus em sistema completamente automatizado. As amostras foram acondicionadas no aparelho e os resultados impressos diretamente após o término da análise. O soro controle Apolipoproteínas (Biotécnica Biotecnologia Avançada) foi utilizado para verificação de desempenho durante o ensaio. Os valores de referência para APOB variam de 60 a 155mg/dL ÍNDICE APOB/APOA1 O índice APOB/APOA1 foi calculado para cada indivíduo em particular, dividindo-se o valor plasmático da APOB pelo valor plasmático da APOA EXTRAÇÃO DO DNA O DNA dos leucócitos foi extraído seguindo-se o protocolo apresentado: a um volume de 900µL de solução de lise de hemácias em um tubo tipo eppendorf de 1,5 ml foram adicionados 300µL de sangue total colhido em EDTA e incubado por 10 minutos à temperatura ambiente. Após a lise das hemácias, a mistura foi centrifugada a rpm por 60 segundos à temperatura ambiente em microcentrífuga FANEN. O sobrenadante foi desprezado e o pellet foi solubilizado com 300µL de solução de lise nuclear, sendo homogeneizado cuidadosamente. Nesta etapa, foram adicionados 100µL de solução de precipitação de proteínas, sendo a solução misturada no vórtex por 20 a 30 segundos e então centrifugada a rpm por 3 minutos. O sobrenadante foi transferido para outro tubo tipo eppendorf contendo 300µL de isopropanol e homogeneizado para que ocorresse a precipitação do DNA. Posteriormente, essa solução foi centrifugada a rpm por 2 minutos, e o sobrenadante foi descartado. Foram então foram adicionados 300µL de etanol a 70%, invertendo-se o tubo várias vezes. Novamente a mistura foi centrifugada a rpm por 2 minutos e o sobrenadante desprezado. Finalmente, foram adicionados 50µL de solução de hidratação (Tris 10mM/EDTA 0,1 mm) e as amostras foram armazenadas no freezer a - 20º C para posterior pesquisa dos polimorfismos e mutações. 3.7 DETERMINAÇÃO DO PERFIL GENÉTICO INDIVIDUAL - APOE REAÇÃO DE PCR A análise do gene da APOE foi realizada pela técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR - polimerase chain reaction), seguida pela análise dos fragmentos polimórficos (RFLP - restriction fragment lenght polymorphism), de acordo com a metodologia descrita por Hixson e Vernier (HIXSON E VERNIER, 1990), modificada. Após a extração de DNA total, uma região de 263 pares de base (pb) no éxon 4 do gene da APOE

49 49 foi amplificada utilizando-se o oligonucleotídeo senso 5 TAAGCTTGGCACGGCTGTCCAAGGA 3 e o oligonucleotídeo antisenso 5 CAGTGTACCAGGCCGGGGACCG 3, conforme descrito por Souza e colaboradores (SOUZA et al., 2005). A tabela 5 apresenta o protocolo final utilizado na reação de PCR. As reações foram realizadas para um volume final de 20µL em termociclador TECHNE TC-312. Na preparação das reações de PCR, foram utilizados os seguintes reagentes: oligonucleotídeos iniciadores sintetizados pela Invitrogen, desoxirribonucleotídeos (dntps) (Invitrogen ), tampão (15mM de MgCl 2, 500mM de KCl, 100mM de Tris HCl ph 8,4 e 1% de Triton-X) (Phoneutria ) e Taq DNA polimerase (Phoneutria ). As concentrações dos reagentes utilizados na reação de PCR encontram-se apresentadas na tabela 6. Tabela 5 - Protocolo da reação de PCR para amplificação de fragmento da APOE Estágio Temperatura (ºC) Tempo Nº de ciclos "Hot start" min 1 Desnaturação min Anelamento min 40 Extensão min Extensão final min min min 1 Tabela 6 - Concentração dos reagentes para a reação de PCR para amplificação de fragmento do gene da APOE Reagentes Estoque Concentração final Tampão 10X (15mM MgCl 2 ) 1X (1,5mM MgCl 2 ) dntp 2mM 0,2mM Oligonucleotídeo senso 10µM 1,0µM Oligonucleotídeo antisenso 10µM 1,0µM Taq DNA polimerase 5u/µL (unidades) 1,0u DNA genômico* 100ng/µL (média) ~10µg Água miliq qsp 20µL 20µL * Não foi realizada quantificação espectrofotométrica para todas as amostras de DNA, portanto as quantidades mencionadas correspondem a estimativas.

50 REAÇÃO DE DIGESTÃO COM ENZIMA DE RESTRIÇÃO ESPECÍFICA Após a detecção da amplificação do fragmento específico em gel de poliacrilamida a 6%, uma alíquota de 5µL da reação de amplificação foi digerida com uma das seguintes endonucleases de restrição, HhaI ou CfoI, de acordo com o protocolo apresentado na tabela 7. Essa mistura foi então incubada, em banho-maria a 37ºC, por 18 horas. As enzimas HhaI e CfoI são isoesquizômeros, significando que apresentam o mesmo padrão de restrição específica. Ambas foram testadas no laboratório e produziram resultados idênticos e igualmente satisfatórios. Optou-se então pela utilização da enzima CfoI pelo fato de ser comercialmente mais vantajosa que HhaI. Tabela 7 - Protocolo da reação de digestão do fragmento de 263pb do gene da APOE Reagente µl / tubo eppendorf Água 7,0 Tampão de enzima 2,0 Enzima 1,0 (10 unidades) Produto de PCR 5,0 Volume final 15,0 O produto da digestão foi posteriormente visualizado em gel de poliacrilamida a 12%, e o perfil dos fragmentos no gel forneceu a base para a identificação do perfil genético, de acordo com a tabela 8. Tabela 8 - Perfil de bandas no gel para a identificação dos alelos do gene da APOE Genótipos APOE Fragmentos gerados pela digestão (pb) ε2ε2 91, 63 e 75 Homozigotos ε3ε3 91, 63 e 48 ε4ε4 72, 63, 48 e 27 ε2ε3 91, 75, 63, 48 e 27 Heterozigotos ε2ε4 91, 75, 72 e 63 ε3ε4 91, 72, 63, 48 e 27

51 DETERMINAÇÃO DO PERFIL GENÉTICO INDIVIDUAL - APOB REAÇÃO DE PCR Uma vez que a mutação R3500Q e o polimorfismo MspI encontram-se próximos (respectivamente, resultam em alterações nos códons 3500 e 3611 do gene da APOB) e, coincidentemente, apresentam sítios de clivagem para a endonuclease de restrição MspI, a análise dessas alterações pôde ser conduzida simultaneamente por meio da técnica de PCR-RFLP, de acordo com a metodologia descrita por Cavalli e colaboradores (CAVALLI et al., 2001). Após a extração de DNA total, uma região de 465pb no éxon 26 do gene da APOB foi amplificada utilizando-se o oligonucleotídeo senso 5' CCAACACTTACTTGAATTCCAAGAGCACCC 3', conforme descrito por Hansen (HANSEN et al., 1991), e o oligonucleotídeo antisenso 5' GGAAGCTTAGGTGTCCTTCTAAGGATCCTG 3', conforme descrito por Pulliger (PULLIGER et al., 1995). A tabela 9 apresenta o protocolo final utilizado na reação de PCR. Tabela 9 - Protocolo da reação de PCR para amplificação de fragmento do gene da APOB Estágio Temperatura (ºC) Tempo Nº de ciclos "Hot start" min 1 Desnaturação min Anelamento min 40 Extensão min Extensão final min min min 1 As reações foram realizadas para um volume final de 20µL em termociclador TECHNE TC-312. Na preparação das reações de PCR, foram utilizados os seguintes reagentes: oligonucleotídeos iniciadores sintetizados pela Invitrogen, desoxirribonucleotídeos (Invitrogen ), tampão (15mM de MgCl 2, 500mM de KCl, 100mM de Tris HCl ph 8,4 e 1% de Triton-X) (Phoneutria ) e Taq DNA polimerase (Phoneutria ). As concentrações dos reagentes utilizados na reação de PCR encontram-se apresentadas na tabela 10.

52 52 Tabela 10 - Concentração dos reagentes para a reação de PCR para amplificação de fragmento do gene da APOB Reagentes Estoque Concentração final Tampão 10X (15 mm MgCl 2 ) 10X (1,5mM MgCl 2 ) dntp 2mM 0,2mM Oligonucleotídeo senso 10µM 1,0µM Oligonucleotídeo antisenso 10µM 1,0µM Taq DNA polimerase 5u/µL (unidades) 1u DNA genômico* 100ng/µL (média) ~10µg Água miliq qsp 20µL 20µL * Não foi realizada quantificação espectrofotométrica para todas as amostras de DNA, portanto as quantidades mencionadas correspondem a estimativas REAÇÃO DE DIGESTÃO COM ENZIMA DE RESTRIÇÃO ESPECÍFICA Após a detecção da amplificação do fragmento específico, em gel de poliacrilamida a 6%, uma alíquota de 5µL da reação de amplificação foi digerida com a endonuclease de restrição MspI, de acordo com o protocolo apresentado na tabela 11. Essa mistura foi então incubada, em banho-maria a 37ºC, por 18 horas. Tabela 11 - Protocolo da reação de digestão do fragmento de 465pb do gene da APOB Reagente µl / tubo eppendorf Água miliq 7,0 Tampão de enzima 2,0 Endonuclease 1,0 (10 unidades) Produto de PCR 5,0 Volume final 15,0 O produto da digestão foi posteriormente visualizado em gel de poliacrilamida a 8%, corado pela prata, e o perfil das bandas forneceu a base para a identificação do perfil genético, de acordo com a tabela 12.

53 Tabela 12 - Perfil de bandas no gel para a identificação dos diferentes perfis genéticos da mutação R3500Q e do polimorfismo MspI do gene da APOB 53 Mutação R3500Q Polimorfismo MspI M+M+ M+M- M-M- Homozigose Heterozigose 362 e 103 pb 465, 362 e 103 pb 465 pb 436, 362, 103 e 29 pb 362, 333,103 e 29 pb ou 465, 436 e 29 pb 465, 333, 103 e 29 pb Ausente 333, 103 e 29 pb 436, 333,103 e 29 pb 436 e 29 pb Para interpretação dos perfis genéticos, é importante ressaltar que a endonuclease MspI reconhece dois sítios no produto de PCR: na posição 29, quando a mutação R3500Q está ausente, e na posição 362, quando o alelo M+ do polimorfismo MspI está presente. Desta forma, 9 genótipos são possíveis considerando essas duas alterações. Para melhor visualização, um esquema de clivagem do produto de PCR pela endonuclease MspI é apresentado na figura 3.

54 54 Figura 3 - Padrões de RFLP para APOB As regiões em cinza indicam os fragmentos polimórficos, gerados pela digestão do fragmento de 465pb pela endonuclease MspI. Os fragmentos dos 9 genótipos possíveis resultantes se encontram esquematizados à direita da figura. 3.9 DETERMINAÇÃO DO PERFIL GENÉTICO INDIVIDUAL - APOA REAÇÃO DE PCR A análise do gene da APOA5 foi realizada pela técnica de PCR-RFLP, de acordo com a metodologia descrita por Pennachio e colaboradores (PENNACHIO et al., 2001), modificada. Após a extração de DNA total, uma região de 187pb da região promotora do gene da APOA5 foi amplificada utilizando-se o oligonucleotídeo senso 5' GATTGATTCAAGATGCATTTAGGAC 3' e o oligonucleotídeo antisenso 5' CCCCAGGAACTGGAGCGAAATT 3' conforme descrito por Sousa e colaboradores (SOUSA et al., 2008 b ). A tabela 13 apresenta o protocolo final utilizado na reação de PCR.

55 55 As reações foram realizadas para um volume final de 20µL em termociclador TECHNE TC-312. Na preparação das reações de PCR, foram utilizados os seguintes reagentes: oligonucleotídeos iniciadores sintetizados pela Invitrogen, desoxirribonucleotídeos (Invitrogen ), tampão (15mM de MgCl 2, 500mM de KCl, 100mM de Tris HCl ph 8,4 e 1% de Triton-X) (Phoneutria ) e Taq DNA polimerase (Phoneutria ). As concentrações dos reagentes utilizados na reação de PCR encontram-se apresentadas na tabela 14. Tabela 13 - Protocolo da reação de PCR para amplificação de fragmento do gene da APOA5 Estágio Temperatura (ºC) Tempo Nº de ciclos "Hot start" min 1 Desnaturação seg Anelamento seg 30 Extensão seg Extensão final min min min 1 Tabela 14 - Concentração dos reagentes para a reação de PCR para amplificação de fragmento do gene da APOA5 Reagentes Estoque Concentração final Tampão 10X (15 mm MgCl 2 ) 10X (1,5mM MgCl 2 ) dntp 2mM 0,2mM Oligonucleotídeo senso 10µM 1,0µM Oligonucleotídeo antisenso 10µM 1,0µM Taq DNA polimerase 5u/µL (unidades) 1u DNA genômico* 100ng/µL (média) ~10µg Água miliq qsp 20µL 20µL * Não foi realizada quantificação espectrofotométrica para todas as amostras de DNA, portanto as quantidades mencionadas correspondem a estimativas.

56 REAÇÃO DE DIGESTÃO COM ENZIMA DE RESTRIÇÃO ESPECÍFICA Após a detecção da amplificação do fragmento específico em gel de poliacrilamida a 6%, uma alíquota de 3µL da reação de amplificação foi digerida com a endonuclease de restrição MseI, de acordo com o protocolo apresentado na tabela 15. Essa mistura foi então incubada, em banho-maria a 37ºC, por 18 horas. Tabela 15 - Protocolo da reação de digestão do fragmento de 187pb do gene da APOA5 Reagente µl / tubo eppendorf Água miliq 5,9 Tampão de enzima 1,0 Endonuclease 1,0 (10 unidades) Produto de PCR 3,0 Volume final 10,0 O produto da digestão foi posteriormente visualizado em gel de poliacrilamida a 8%, corado pela prata, e o perfil das bandas forneceu a base para a identificação do perfil genético, de acordo com a tabela 16. Tabela 16 - Perfil de bandas no gel para a identificação dos alelos do polimorfismo -1131T>C da APOA5 Homozigotos Genótipos APOA5 Fragmentos gerados pela digestão (pb) TT 165, 22 CC 187 Heterozigoto TC 187, 165, ANÁLISES ESTATÍSTICAS Os resultados foram analisados utilizando-se os programas Sigma Stat versão 2.03 e Prisma versão 3.0. Para os marcadores que apresentaram distribuição normal, foi realizado o teste t de Student para as situações de comparação de dois grupos e a análise de variância (ANOVA) para comparação de vários grupos. No caso dos marcadores que não apresentaram distribuição normal, foi empregado o método não paramétrico de Mann- Whitney para comparação de dois grupos e ANOVA para comparação de mais grupos, sendo realizado o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis, seguido do teste de comparação múltipla de Dunn s, quando apropriado. Valores de p < 0,05 foram considerados

57 57 significativos. A investigação das correlações entre os parâmetros estudados foi realizada pela correlação de Pearson para variáveis quantitativas e Spearman para variáveis qualitativas. Os dados de frequências alélicas e genotípicas das mutações e polimorfismos foram calculados matematicamente, aplicando-se a fórmula x/y, onde x = número de alelos/indivíduos com o marcador em questão e y = número total de alelos/indivíduos da amostra. Os níveis de significância foram verificados pelo teste qui-quadrado. Foram calculados valores de odds ratio (OR), com intervalo de 95% de confiança, utilizando-se o teste exato de Fisher para os dados que apresentavam número de amostras menor que 15.

58 58 RESULTADOS

59 59 4 RESULTADOS 4.1 CARACTERIZAÇÃO DOS GRUPOS NORMOLIPÊMICO E DISLIPIDÊMICO De acordo com o critério utilizado de diagnóstico clínico prévio de dislipidemia (TG>130mg/dL, CT 170mg/dL e/ou LDLc 130mg/dL) (SBC, 2005), os 130 indivíduos incluídos no estudo foram divididos em normolipêmicos (controles) e dislipidêmicos (pacientes). Outros 47 indivíduos foram excluídos, 39 por apresentarem consanguinidade (irmãos em 1º grau), um por apresentar hipotireoidismo e sete por apresentarem formas graves de dislipidemias, com consequente comprometimento do fracionamento do colesterol total. A tabela 17 apresenta a caracterização dos indivíduos participantes. Tabela 17 - Características gerais e parâmetros lipídicos dos grupos normolipêmico e dislipidêmico Normolipêmicos (n=77) Dislipidêmicos (n=53) P Idade (anos) 11,2 ± 3,4 10,4 ± 2,7 0,503 Sexo F / M 38 / / 24 0,547 IMC (kg/m 2 ) 18,8 ± 3,2 20,6 ± 4,3 0,012 TG (mg/dl) 73 (56,7-86,5) 114 (81-147,5) <0,001 CT (mg/dl) 143,5 ( ) 207,5 ( ,5) <0,001 LDLc (mg/dl) 84,5 (69,9-95,5) 139,0 (111,5-159,5) <0,001 HDLc (mg/dl) 44,0 (39-52) 48,0 (35-53) 0,427 APOA1 (mg/dl) 181 (151,3-226,8) 159,7 (148,7-186,1) 0,018 APOB (mg/dl) 65,2 (54,3-81,4) 90,6 (75,1-113,4) <0,001 APOB/APOA1 0,37 (0,30-0,43) 0,54 (0,42-0,69) <0,001 n=130; idade e IMC representados por média e desvio-padrão; demais valores representados por medianas e interquartis; p calculado por Mann-Whitney e considerado significativo quando < 0,05. A idade e o sexo dos indivíduos participantes não variaram significativamente entre os grupos normolipêmico e dislipidêmico. Já para o IMC, houve variação significativa entre os grupos, sendo o valor mais alto encontrado entre os indivíduos dislipidêmicos. Todos os parâmetros lipídicos, com exceção do HDLc, apresentaram diferenças significativas entre os dois grupos, resultado esperado pelo próprio desenho do estudo, que agrupou os indivíduos de acordo com os critérios de diagnóstico de dislipidemias em crianças e jovens (SBC, 2005).

60 60 Dos 130 indivíduos analisados, 21 adolescentes declararam uso esporádico de álcool, 10 destes no grupo normolipêmico e 11 no dislipidêmico. Nenhum participante declarou fazer uso de tabaco. Poucos indivíduos responderam se realizavam atividades físicas regulares e, em geral, respostas positivas significavam apenas aulas de educação física na escola. Para a análise do histórico familiar, foi investigada a presença de casos de DAC prematura na família (IAM, AVC ou trombose antes dos 55 anos), diabetes, hipertensão ou colesterol e/ou triglicérides elevados. A maior parte dos 130 participantes relatou histórico familiar positivo, sendo que as informações mais detalhadas foram obtidas para o grupo dislipidêmico, que apresentou alta prevalência de hipercolesterolemia e/ou hipertrigliceridemia em parentes de 1º grau. Como os dados para esta variável estavam incompletos, optou-se por não calcular os valores percentuais para os dois grupos. GENÓTIPOS 4.2 POLIMORFISMOS DA APOE, APOB E APOA5 - IDENTIFICAÇÃO DOS As figuras 4, 5 e 6 representam os resultados dos géis de eletroforese com os fragmentos utilizados para a identificação genotípica dos polimorfismos da APOE, APOB e APOA5, respectivamente. 91pb 75pb 72pb 63pb 48pb Figura 4 - Eletroforese, em gel de poliacrilamida a 12% corado pela prata, dos produtos de PCR-RFLP do fragmento de 263pb do gene da APOE. Canaleta 1 - genótipo ε2ε4; canaleta 2 - genótipo ε4ε4; canaleta 3 - genótipo ε3ε3; canaleta 4 - genótipo ε3ε4; canaleta 5 - genótipo ε2ε3

61 61 500p b 400p b 300p b 200p b Figura 5 - Eletroforese, em gel de poliacrilamida a 8% corado pela prata, dos produtos de PCR-RFLP do fragmento de 465pb do gene da APOB. Canaleta 1 - padrão de peso molecular (1kb); canaletas 2, 3 e 6 - genótipo M+M+; canaleta 4 - genótipo M+M-; canaleta 5 - genótipo M-M- 400p b 300p b 200p b 100p b Figura 6 - Eletroforese, em gel de poliacrilamida a 8% corado pela prata, dos produtos de PCR do fragmento de 187pb do gene da APOA5. Canaleta 1 - padrão de peso molecular (1kb); canaleta 2 - genótipo CC; canaletas 3, 6 e 7 - genótipo TC; canaletas 4, 5 e 8 - genótipo TT