TRABALHO DE DISSERTAÇÃO

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1 1 UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA TRABALHO DE DISSERTAÇÃO VANESSA DA SILVA BRITO FREQUÊNCIA DE SUBTIPOS LINFOCITÁRIOS PERIFÉRICOS E EXPRESSÃO DE FOXP3 NA INFECÇÃO PELO VÍRUS LINFOTRÓPICO DE CÉLULAS T HUMANAS TIPO 1 (HTLV-1). Salvador, BA 2013

2 2 VANESSA DA SILVA BRITO FREQUÊNCIA DE SUBTIPOS LINFOCITÁRIOS PERIFÉRICOS E EXPRESSÃO DE FOXP3 NA INFECÇÃO PELO VÍRUS LINFOTRÓPICO DE CÉLULAS T HUMANAS TIPO 1 (HTLV-1). Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Imunologia, da Universidade Federal da Bahia como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Imunologia. Orientadora: Profa. Dra. Songeli Menezes Freire Co-Orientadora: Profa. Dra. Maria Fernanda Rios Grassi Salvador, BA 2013

3 3 Dedico esse trabalho a minha família, pois sem o apoio delas a minha vida não seria tão maravilhosa.

4 4 AGRADECIMENTOS A minha família, fonte de amor e força para lutar pelos meus objetivos, e por caminharem sempre ao meu lado. À Dra. Songeli Menezes Freire, pela oportunidade de fazer parte do seu grupo de pesquisa, pelos conhecimentos compartilhados, pelos anos de orientação pessoal e profissional. Á Dra. Fernanda Grassi, por ter sido tão atenciosa, pelo exemplo de profissional, pela importante colaboração e orientação. Ao Dr. Bernardo Galvão e ao seu grupo de pesquisa, por permitir o desenvolvimento deste projeto em colaboração. Ao Dr. Roberto Meyer, por conduzir de forma tão humana as atividades do Labimuno. Ao querido colega Geraldo Pedral, por todos esses anos de amizade, me ensinando a executar e entender muitas técnicas em imunologia, com inesgotável tranqüilidade. Às minhas companheiras de projetos Bruna Mattos, Taís Gardênia e Clécia Caribé por todo o apoio prestado e pela amizade. À todos os colegas do Labimuno, do PPGIm, e do ADAB, pelo auxílio na execução do projeto, na compreensão dos dados e, principalmente, pelas sábias palavras de força dadas na reta final. A todos os docentes do Programa de Pós-graduação em Imunologia. Aos meus amados amigos pelos infinitos momentos de alegrias. Ao suporte financeiro dado pelo CNPq, CAPES e PRONEX. Na certeza de que todos contribuíram para a realização deste estudo, agradeço imensamente.

5 5 RESUMO Introdução: O vírus linfotrópico de células T humanas tipo 1 (HTLV-1) é um retrovírus linfotrópico, descrito como agente causador da leucemia/linfoma de células T do adulto (ATL) e paraparesia espástica tropical/mielopatia associada ao HTLV-1 (HAM/TSP). Mesmo nos portadores aparentemente assintomáticos existem evidências de comprometimento funcional da resposta imune celular. Os objetivos do presente trabalho foram avaliar as subpopulações linfocitárias e células T regulatórias em indivíduos infectados pelo HTLV-1 e comparar as populações de células T (CD4 +, CD8 + ), por dois kits comerciais diferentes disponíveis. Material e Métodos: Este estudo foi aprovado pelo CEP-207/2009CPqGM/FIOCRUZ. Em amostras de sangue periférico de 55 indivíduos infectados com HTLV-1 (soropositivos) e 80 controles (não infectados / HTLV soronegativos), foram quantificados com os reagentes e kits Lymphogram (Cytognos-Espanha) e Tritest (BD-USA), linfócitos T (CD4 +, CD8 +, CD25 + ), células NK e linfócitos B, por reagentes de marcação simultânea, e avaliada a expressão de Foxp3 nas células T CD4 + CD25 +. Resultado: Com os dados analisados, os indivíduos infectados pelo HTLV-1 apresentam valores mais elevados de células T CD4 + e CD8 +, redução na frequência de células NK (p<0,05), sem diferença nas células B, quando comparados aos controles. Observa-se uma menor expressão da proteína Foxp3 em células T CD3 + CD4 + CD25 + de indivíduos infectados pelo HTLV quando comparados aos não infectados/soronegativos (p<0,05). Discussão: Com base nos resultados, pode-se concluir que o Lymphogram é um método confiável, rápido e de baixo custo para o diagnóstico e monitoramento de linfopatias como a infecção pelo HTLV- 1. Conclusão: As análises quantitativas mostraram que indivíduos infectados pelo HTLV-1 apresentam uma contagem de células T CD4 + e CD8 + maior, mantendo a proporcionalidade nas duas células, e valores menores de células NK, quando comparados aos controles não infectados. Palavras-chave: Vírus linfotrópico de células T humanas tipo 1 (HTLV-1); imunofenotipagem; Foxp3. Lymphogram, TCD4 +, TCD8 +, Tritest.

6 6 ABSTRACT Introduction : The human T lymphotropic virus type 1 ( HTLV - 1 ) is a cell lymphotropic retroviruses described to cause leukemia / lymphoma adult T-cell ( ATL ) and tropical spastic paraparesis / HTLV-associated myelopathy - 1 ( HAM / TSP ). Even in apparently asymptomatic patients there is evidence of functional impairment of the cellular immune response. The objectives of this study were to evaluate the lymphocyte subsets and regulatory T cells in individuals infected with HTLV - 1 and compare the populations of T (CD4 +, CD8 + ) by two different commercially available kits. Material and Methods: This study was approved by CEP- 207/2009CPqGM/FIOCRUZ. In peripheral blood samples of 55 individuals infected with HTLV -1 ( HIV + ) and 80 controls, non-infected ( HTLV seronegative ) were measured with the reagents and kits Lymphogram ( Cytognos, Spain) and Tritest (BD, USA ), T lymphocytes (CD4 +, CD8 +, CD25 + ), NK cells and B lymphocytes by simultaneous marking reagents, and measured the expression of Foxp3 in CD4 + CD25 +. Results: With the data analyzed, individuals infected with HTLV - 1 show higher values of CD4 and CD8 cells, reduction in the frequency of NK ( p < 0.05 ), with no difference in cell B cells, when compared to controls. Observed a lower expression of Foxp3 protein in T cells CD3 + CD4 + CD25 + HTLV -infected individuals compared to uninfected / seronegative (p < 0.05). Discussion: Based on the results, we can conclude that the Lymphogram is a reliable, fast and cost effective for the diagnosis and monitoring of lymphopathies method as HTLV 1. Conclusion : The quantitative analysis showed that patients infected by HTLV - 1 show a count of CD4 + and CD8 + cells greater, however proporcinal in two cells, NK cells and lower values when compared to uninfected controls. Keywords: Human T lymphotropic virus type 1 (HTLV-1) cells, immunophenotyping; Foxp3. Lymphogram, CD4 +, CD8 +, Tritest.

7 7 LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS ADAB Ag AgHBs AIDS APC APCs ATL CD CREB CTL DNA DST EDTA ELISA EUA FITC Foxp3 FSC GITR GLUT-1 GM-CSF gp HAM Ambulatório Docente Assistencial da Bahiana Antígeno Antígeno de Superfície da Hepatite B Acquired Immune Deficiency Syndrome (Síndrome da Imunodeficiência Adquirida) Allophycocyanin (Aloficocianina) Antigen Presenting Cells (células apresentadoras de antígeno) Adults T-cell lymphoma (Linfoma de células T do adulto) Cluster of differentation (marcador de diferenciação de grupo) camp response element-binding protein (proteína de resposta de ligação a camp) Cytotoxic T Lymphocytes (células T citolíticas ou citotóxica) Deoxyribonucleic Acid (ácido desoxirribolucléico) Doença Sexualmente Transmissível Ethylene Diamine Tetracetic Acid (ácido etilenodiamino tetra-acético) Enzyme-Linked-Immunosorbent Assay (ensaio imuno-enzimático) Estados Unidos da América Fluorescein Isothiocyanate (isotiocianato de fluoresceína) Forkhead box P3 ( suporte de forquilha proteína intracelular) Forward scatter (dispersão frontal) Glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor (Receptor do fator de necrose tumoral induzida por glucocorticóides) Glucose transporter 1 (transportador de glicose-1) Granulocyte macrophage colony-stimulating factor (Fator estimulador de colônia de macrófagos e granulócitos ) Glicoproteína HTLV-I associated myelopathy (mielopatia associada ao HTLV-I)

8 8 HAM/TSP HBZ Human T-lymphotropic virus type-i-associated myelopathy / tropical spastic paraparesis (Mielopatia humana associada as Víirus T-linfotrópico tipo I / paraparesia espástica tropical) HBZ (HTLV-I bzip factor) - HTLV-1 basic leucine-zipper (bzip) factor HCV Hepatitis C vírus (vírus da Hepatite C) HIV HLA HSPGs HTLV-1 IFN IgG IL-1 IL-2 IL-6 IL-15 IL-2R LCR LLTA LTR MoAb mrna MS NF-κB NK NKT NRP-1 OMS Human immunodeficiency vírus (vírus da imunodeficiência humana) Human Leukocyte Antigen (antígeno leucocitário humano) Heparan Sulfate Proteoglycans (proteoglicanos de sulfato de heparano) Human T lymphotropic virus type 1 (vírus linfotrópico de células humanas tipo1) Interferon (interferon) Imunoglobulina de classe G Interleucina-1 Interleucina-2 Interleucina-6 Interleucina-15 Receptor de Interleucina-2 Líquido céfalo-raquidiano Leukemia / lymphoma, adult T-cell (Leucemia / linfoma de células T de adulto) Long Terminal Repeat (terminal de longa repetição nucleotídica) Monoclonal antibodies (anticorpos monoclonais) Ribonucleic Acid messenger (ácido ribonucléico mensageiro) Ministério da Saúde Factor nuclear kappa B Natural killer (Células assassinas naturais ou celulas NK) Natural killer T cells (células NKT) neuropilina-1 Organização Mundial de Saúde

9 9 ORFs pb PBMC PCR PE Open reading frames (quadros de leitura aberta) Pares de bases Peripheral blood mononuclear cells (células mononucleares do sangue periférico) Polimerase chain reaction (reação em cadeia da polimerase) Phycoerythrin (ficoeritrina) PECy5 Phycoerythrin cyanine 5 (ficoeritrina cianina 5) PerCP PET rgp RNA RT-PCR SNC SRF SSC T reg Th TNF TNF-α TSP WB Peridinin chlorophyll protein (proteina clorofila peridinina) Paraparesia espástica tropical Recombinant glicoprotein (glicoproteína recombinante) Ribonucleic Acid (ácido ribonucléico) Real time PCR (reação em cadeia da polimerase em tempo real) Sistema nervoso central serum response factor (fator de resposta sérica) Side scatter (dispersão lateral) Célula T regulatória Célula T helper Tumor necrosis factor (fator de necrose tumoral) Tumor necrosis factor-alpha (fator de necrose tumoral) Tropical spastic paraparesis (paraparesia espástica tropical) Western-Blotting

10 10 LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1: Representação esquemática da estrutura de uma partícula viral do HTLV-1 e da estrutura genômica do vírus. Figura 2: Critério de análise das subpopulações linfocitárias pelo kit Lymphogram. A-seleção por gate da população de linfócitos totais para o estudo (tamanho-fsc versus granulosidade-ssc); B-Dot plot de purificação/identificação (FL-FITC versus FL-PE); C- identificação de CD3 + através da análise de FSC versus padrão de fluorescência (CD56/CD3 PE ); D- identificação de CD3 + através da análise do padrão de fluorescência CD56/CD3PE versus CD4/PECy5; E- identificação de CD8 +, CD56 + e CD19 + através da análise do padrão de fluorescência CD56/CD3PE versus CD8/CD19FITC. A distribuição das células é avaliada de acordo com intensidades de fluorescência emitidas pela ligação dos anticorpos monoclonais específicos, em ambos os eixos. Figura 3: Critério de análise das subpopulações linfocitárias pelo kit Tritest. A população de linfócitos totais para o estudo (CD3 PerCP ) versus granulosidade-ssc); B os subtipos de linfócitos CD3 + (CD4 FITC versus CD8 PE ). Figura 4: Representação gráfica das médias±dp dos valores absolutos (gráfico da esquerda) e relativos (gráfico da direita) de linfócitos T totais (CD3 + ) em indivíduos infectados pelo HTLV e controles (não infectados/soronegativos). Amostras de 55 pacientes infectados e 80 controles foram quantificadas utilizando os reagentes para teste de imunofluorescendia direta Lymphogram e Perfect Count (ambos Cytognos) por citometria de fluxo. (Significância estatística p<0,05; test t). Figura 5: Representação gráfica das médias±dp dos valores absolutos (gráfico a esquerda) e relativos (gráfico á direita) de de linfócitos T CD4 + em indivíduos infectados pelo HTLV e controles não infectados. Amostras de 55 pacientes infectados e 80 controles foram quantificadas utilizando os reagentes para teste de imunofluorescendia direta Lymphogram e Perfect

11 11 Count (ambos Cytognos) citometria de fluxo. (Significância estatística p<0,05; test t). Figura 6: Representação gráfica das médias±dp dos valores absolutos (gráfico a esquerda) e relativos (gráfico a direita) de linfócitos T CD8 + em indivíduos infectados pelo HTLV e controles não infectados. Amostras de 55 pacientes infectados e 80 controles foram quantificadas utilizando os reagentes para teste de imunofluorescendia direta Lymphogram e Perfect Count (ambos Cytognos) por citometria de fluxo. (Significância estatística p<0,05; test t). Figura 7: Representação gráfica das médias±dp da razão entre linfócitos T CD4 + /CD8 + em indivíduos infectados e controles negativos. Amostras de 55 pacientes infectados e 80 controles foram quantificadas utilizando os reagentes para teste de imunofluorescendia direta Lymphogram e Perfect Count (ambos Cytognos) por citometria de fluxo. (Significância estatística p<0,05; test t). Figura 8: Representação gráfica das médias±dp dos valores absolutos (gráfico a esquerda) e relativos (gráfico a direita) de células NK em indivíduos infectados e controles negativos. Amostras de 55 pacientes infectados e 80 controles foram quantificadas utilizando os reagentes para teste de imunofluorescendia direta Lymphogram e Perfect Count (ambos Cytognos) por citometria de fluxo. (Significância estatística p<0,05; test t). Figura 9: Representação gráfica das médias±dp dos valores absolutos e relativos de linfócitos B em indivíduos infectados e controles negativos. Amostras de 55 pacientes infectados e 80 controles foram quantificadas utilizando os reagentes para teste de imunofluorescendia direta Lymphogram e Perfect Count (ambos Cytognos) por citometria de fluxo. (Significância estatística p<0,05; test t). Figura 10: Representação gráfica das médias±dp dos valores relativos de de linfócitos T CD3+CD4+CD25+ e análise da expressão de Foxp3 nesta subpopulação linfocitária em infectados pelo HTLV-1 e controles negativos. Amostras de 46 pacientes infectados e 64 controles foram quantificadas utilizando os reagentes para teste de imunofluorescendia direta por

12 12 citometria de fluxo. (Significância estatística p<0,0001; test t). Figura 11: Valores absolutos de células CD3 +, CD4 + e CD8 + por citometria de fluxo utilizando Lymphogram / (Cytognos) e Tritest (BD) em 36 indivíduos infectados pelo HTLV-1, e 70 indivíduos controles. (Correlação por Spearman e Significância por Wilcoxon test). 40

13 13 LISTA DE TABELAS Tabela 1: Composição dos anticorpos monoclonais e fluorocromos utilizados como reagentes de kits para quantificação de subpopulações linfocitárias. Tabela 2: Características clínicas e epidemiológicas da população estudada. Tabela 3: Aspectos leucometricos dos participantes voluntários soropositivos para HTLV e soronegativos Tabela 4: Valores de linfócitos T totais (CD3 + ), representado em Média± Desvio Padrão, e o valor de p. Tabela 5: Valores de linfócitos T CD4+, representado em Média± Desvio Padrão, e o valor de p. Tabela 6: Valores de linfócitos T CD8 +, representado em Média± Desvio Padrão, e o valor de p Tabela 7: Valores de células Natural Killer, representando em média±dp, valor de p. Tabela 8: Valores de linfócitos B, representando em média±dp, valor de p. Tabela 9: Média±DP dos valores relativos das células T regulatórias

14 14 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO GERAL REVISÃO DE LITERATURA ASPECTOS DO VÍRUS LINFOTRÓPICO DE CÉLULAS T HUMANAS Estrutura e Genoma Viral Aspectos Epidemiológicos da infecção pelo HTLV Replicação Viral CARACTERÍSTICAS DA INFECÇÃO PELO HTLV Manifestações clínicas relacionadas a Infecção Patogênese PAPEL DOS LINFÓCITOS NA INFECÇÃO PELO HTLV OBJETIVOS Capítulo 1: artigo científico 1 : Frequência de subtipos linfocitários 23 periféricos e expressão de Foxp3 na infecção pelo vírus linfotrópico de células T humanas tipo 1 (HTLV-1). 4.1 INTRODUÇÃO MATERIAIS E MÉTODOS 25 POPULAÇÃO DE ESTUDO 25 IMUNOFENOTIPAGEM LINFOCITÁRIA 26 Análises das aquisições por Lymphogram 27 Análises das aquisições por Tritest 28 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS 29 ANÁLISE ESTATÍSTICA RESULTADOS 30 CARACTERÍSTICAS DA POPULAÇÃO ESTUDADA 30 ANÁLISE DAS SUBPOPULAÇÕES LINFOCITÁRIAS DISCUSSÃO CONCLUSÃO REFERÊNCIAS 45 5 CONCLUSÃO GERAL 53 6 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 54 APÊNDICES (A, B, C e D) 61 ANEXOS (A e B) 64

15 15 1. INTRODUÇÃO GERAL O vírus linfotrópico de células T humanas tipo 1 (HTLV-1) foi isolado em 1980 em células de sangue periférico de um doente que sofria de uma doença linfoproliferativa de células T (POIESZ et al., 1980). Em 1981, foi relacionado com a Leucemia das Células T do Adulto (ATL) pela demonstração de partículas de anticorpos anti-htlv-1 no soro de pacientes com ATL (HINUMA et al., 1981), a partir daí assumiu-se a designação de vírus do Linfoma de células T do adulto (ATLV). Em 1983, investigações levaram à descoberta da associação entre este retrovírus e uma neuromielopatia crônica, e em 1985, na Martinica, houve a constatação da presença de anticorpos anti-htlv-1 no soro de mais de 60% dos pacientes com paraparesia espástica tropical TSP. Em 1986, foi descrita com a denominação de mielopatia associada ao HTLV-I - HAM (OSAME et al., 1986). Em 1988, a Organização Mundial de Saúde (OMS), determinou que se tratavam da mesma doença, denominando-a de HAM/TSP. Este vírus foi mais tarde associado com outras condições clínicas, além da leucemia de células T do adulto e da HAM/TSP, como a uveíte, dermatite infecciosa, miosite e poliartrites (FENG YU, 1991; PARKER, 1992). Aproximadamente 10 a 20 milhões de pessoas estão infectadas pelo HTLV-1 em todo o mundo (EDLICH et al., 2000). Estimativas baseadas nas prevalências conhecidas apontam 2,5 milhões de pessoas estão infectadas no Brasil (PROIETTI et al., 2005). No estado da Bahia foi estimado que aproximadamente 40 mil pessoas estejam infectadas (DOURADO et al., 2003; SANTOS et al., 2009). Na cidade de Salvador Bahia -Brasil foi registrada uma taxa de 1,8% da população local, infectados pelo HTLV-1 (GALVÃO-CASTRO et al., 2009) Diversos fatores estão associados ao desenvolvimento da patologia associada ao HTLV-1, porém a resposta imunológica do hospedeiro parece ter importante influência na evolução da infecção. Embora as células T CD4 + sejam as células alvo primárias para transformação por este vírus, aproximadamente 10% dele é transportado por células T CD8 +, com maior carga proviral do que células T CD4 +, em pacientes HAM/TSP e portadores assintomáticos (MATSUOKA, 2011; KANNIAN, 2012). Assim as células T CD8 +, células B, células dendríticas e células

16 16 Natural Killer podem ser reservatórios adicionais para o vírus in vivo (GESSAIN & MAHIEUX, 2012). Aspectos da celularidade e da distribuição dos subtipos celulares linfocitários podem ser interessantes na observação do paciente portador do vírus, na condição de assintomático ou sintomático para estudos futuros prognósticos ou de aspectos clínicos associados à resposta imune. 2. REVISÃO DA LITERATURA 2.1. ASPECTOS DO VÍRUS LINFOTRÓPICO DE CÉLULAS T HUMANAS Estrutura e Genoma Viral O HTLV-1 pertence à família Retroviridae, a subfamília Orthoretrovirinae e ao género Deltaretrovirus. Apresenta-se numa conformação esférica, com 100nm de diâmetros, composto de core central, envelope gliocoproteíco e duas fitas simples de RNA, que necessitam de transcriptase reversa para se multiplicar. O genoma proviral de HTLV-1 possui genes estruturais (gag, pol e env) delimitados por sequências de repetições terminais longas (LTR). A LTR 5' serve como o promotor viral para a transcrição. O gene pol codifica a transcriptase reversa, endonuclease e protease. O gene gag (codifica (p19, p24) fornece as proteínas do core do virion, e env (codifica gp46 e gp21) é utilizado para a infectividade viral. O genoma do vírus tem uma região px, que contém sequências reguladoras de fatores virais (Tax, Rex, p12, p13, p30 e HBZ). (Figura 1) (GAUDRAY et al., 2002; CAVANAGHET et al., 2006; KANNIAN, 2012; GESSAIN & MAHIEUX, 2012). Figura 1: Representação esquemática da estrutura de uma partícula viral do HTLV-1 e da estrutura genômica do vírus. Fonte: adaptado de: LAIRMORE et al., Mechanisms of human T-lymphotropic vírus

17 17 type 1 transmission and disease. Current opinion in virology, 2012; Adaptado de Matsuoka, et al. Human T-cell leukemia virus type 1 (HTLV-1) and leukemic transformation: viral infectivity, Tax, HBZ and therapy. Oncogene Embora as proteínas acessórias p12, p30, p13 e HBZ sejam importantes para a infectividade viral e replicação, não são necessários para a imortalização de linfócitos, mas existem relatos de que a proteína viral p12, interage com cadeias pesadas do complexo de histocompatibilidade de classe-i do humano, levando a degradação deste último, e esse processo facilita o escape viral do sistema imune do hospedeiro, e que a proteína HBZ parece ser indispensável para a proliferação e sobrevivência de células ATL (LAIRMORE, 2012). As proteínas reguladoras Tax e Rex, são essenciais para a replicação viral. Enquanto Tax aumenta a síntese de mrna viral pela transativação do promotor de HTLV-1-LTR 5, Rex controla a síntese das proteínas estruturais, a nível póstranscricional (JOHNSON et al., 2001). A proteína Tax é um cofator de transcrição, que sequestra muitas vias de sinalização relacionada à anti-apoptoses ou proliferação celular. Esta proteína viral estimula e regula a expressão de genes virais e celulares interagindo com fatores de transcrição celular e moléculas de sinalização que induzem a proliferação espontânea dos linfócitos T e conseqüente produção de várias citocinas e aumentam a expressão constitutiva de IL-2R. Mas, ao mesmo tempo, é conhecido como um alvo principal do sistema imune do hospedeiro (YOSHIDA, 2001). Por muito tempo, a investigação da patogênese mediada pelo HTLV-1 tem sido focada em Tax, desde que foi vista como crítica para leucemogênese por causa de seus efeitos pleiotrópicos, tanto viral como em genes celulares responsáveis para a proliferação celular, instabilidade genética, a desregulação do ciclo celular e apoptose. No entanto, a expressão de Tax não é detectada em cerca de 60% dos casos de ATL (leucemia de Células T do Adulto) (SAITO, 2011). Acredita-se que existe uma relação importante entre as células T CD8 + e a proteína Tax, pois estas células parecem reconhecer diretamente a proteína Tax. Os fatores que confirmam essa afirmação são que quando há depleção dos linfócitos T CD8 +, aumenta a expressão da Tax in vivo (HANON et al., 2000;), e quando o inibidor de histonas, é usado na ativação da transcrição da Tax, a carga proviral do HTLV-1 em individuos com HAM/TSP tornam-se reduzidos, assim a replicação do

18 18 vírus parece resultar na supressão in vivo da expressão da Tax. O resultado é que células CTLs (células T citolíticas/linfócitos T CD8 + ) do hospedeiro, ativadas por expressão a Tax, reduzem o número de células infectadas in vivo (LEZIN et al., 2007) Aspectos Epidemiológicos da infecção pelo HTLV O tipo 1 do HTLV é o mais frequentimente observado em portadores deste vírus, e mesmo quando isolados de regiões geográficas diversas, mantêm grande homologia dentre os tipos (FERREIRA et al., 1997). Essa estabilidade genética é uma característica incomum para um retrovírus. A amplificação viral através da expansão clonal de células infectadas é a razão para esta estabilidade genética notável. (MAHIEUX et al., 1997; VERDONCK et al., 2007). Porém as poucas substituições de nucleotídeos observadas entre cepas do vírus são específicas para a origem geográfica dos portadores, e não relacionada com a patologia. Quatro principais subtipos geográficos (genótipos) têm sido relatados, nestes incluem o: subtipo A: Cosmopolitan; subtipo B: Central African; subtipo C: Melanesian; e subtipo D: Central African/Pygmies (GESSAIN. & MAHIEUX, 2012). Encontra-se maior soroprevalencia de mais elevadas no sul do Japão (18% da população com anticorpos anti-htlv-i circulantes) (OSAME et al., 1986) porém está presente na região sudeste dos Estados Unidos nas ilhas do Caribe, na América Central e na do Sul (EDLICH et al., 2003). No Brasil estima-se que 2,5 milhões de pessoas estão infectadas (PROIETTI et al., 2005). As principais vias de transmissão do HTLV-1 são: contato sexual, transmissão vertical e transfusão sanguínea e produtos hemoderivados. Apesar da infecção pelo vírus se instalar principalmente na infância, o desenvolvimento da doença ocorre em adultos após a quarta década de vida (SAGY et al., 1990).

19 Replicação Viral O HTLV-1 tem sido descrito como capaz de infectar, tanto in vitro como in vivo, um grande número de tipos celulares. Embora as células T CD4 + sejam as células alvo primárias para transformação pelo HTLV-1, sabe-se que o este vírus pode infectar uma grande variedade de tipos de células, incluindo células T, células B, macrófagos, fibroblastos e células dendríticas (JONES et al., 2008). O vírus entra em contato com as células do sistema imune, preferencialmente, linfócitos T CD 4 + e CD8 +, ligam-se ao receptor de membrana celular, e inicia o ciclo de replicação (TAKENOUCHI et al., 2007). Consequentemente ocorre a fusão da membrana do vírus com uma proteína transmembrana celular, e o cerne viral é introduzido no citoplasma da célula infectada. A transcrição do RNA viral para DNA ocorre com o auxilio da transcriptase reversa viral, quando a transcrição estiver concluída, o core se rompe, permitindo a entrada do DNA viral no núcleo celular e sua subsequente interação com o DNA da célula hospedeira (LAIRMORE, 2012). O genoma viral integrado passa a ser denominado DNA proviral, e é passível a replicação quando a célula hospedeira sofrer mitose. A partir deste momento, no núcleo celular, começa a síntese do RNA viral com auxilio da maquinaria celular, utilizando como molde o provirus integrado. Então o RNA transcrito é processado em RNAm e finalmente em genoma viral, assim as proteínas virais são sintetizadas e ocorre o início da montagem e brotamento dos virions, que é posteriormente direcionado a membrana celular para formação dos envelopes virais (MATSUOKA & JEANG, 2011). O principal mecanismo de disseminação deste retrovírus no hospedeiro é a transmissão célula a célula, a partir de células infectadas. Isso é possível devido a proteína viral Tax favorecer uma reprogramação na célula infectada, promovendo a expressão de proteínas de adesão celular e produção de imunomoduladores na célula infectada para a não infectada. Após o encontro da molécula de adesão, as proteínas virais são transportadas por microtubos, e partículas do core viral, infectam a nova célula (Figura 5) (JASSAL et al. 2001; DELAMARRE, et al., 1997; DERSE & HEIDECKER, 2003).

20 CARACTERÍSTICAS DA INFECÇÃO PELO HTLV Manifestações clínicas relacionadas à Infecção O vírus linfotrópico de células T humanas tipo 1 (HTLV-1) é o agente etiológico da Leucemia de células T do adulto (ATL) (HINUMA et al., 1981), da mielopatia associada ao HTLV-I/paraparesia espástica tropical (HAM/TSP) (GESSAIN et al, 1985; OSAME et al., 1986), da uveíte associada ao HTLV-1 (MOCHIZUKI, 1992) e de dermatites infecciosas (LA GRENADE, 1995). Atualmente tem sido associado a uma série de manifestações clínicas, como artrites (IJICHI et al., 1990) e polimiosites (MORGAN et al., 1989), ceratoconjutivite seca (MERLE, et al., 1996) e doenças infecciosas como tuberculose, estrongiloidíase e escabiose (MARINHO, et al., 2005; PORTO, et al., 2002; BRITES, et al., 2002; PEDRAL- SAMPAIO, et al., 1997), demonstrando o caráter sistêmico desta infecção. Relatos indicam que a infecção pode também estar associada à indução de imunodeficiência, doenças inflamatórias crônicas persistentes e infecções oportunistas como uveítes, artropatias inflamatórias, poliartrite, polimiosites e pneumonia intersticial linfocítica (MOCHIZUKI et al.,1992; MOCHIZUKI et al.,1994; MORGAN et al.,1989, NISHIOKA et al.,1992,; SANTOS et al., 2009). Tem sido associado igualmente a uma maior prevalência de outras doenças infecciosas, como a tuberculose, estrongiloidíase (PEDRAL-SAMPAIO et al., 1997;MARINHO et al., 2005; PORTO, 2002), escabiose, e dermatite infecciosa em crianças (LAGRENADE et al., 1990) Patogênese A patogenese da infecção pelo HTLV depende em parte da expansão clonal persistente de células infectadas, que dependem principalmente do ciclo celular de células CD4 + infectadas, e na prevenção da morte de células T CD8 +. A expansão clonal permite o armazenamento, persistência, e disseminação do vírus (ZANE, 2012).

21 21 Apesar de não estar totalmente definido o mecanismo patogênico desta doença, admitem-se três hipóteses para explicar o papel do HTLV-1 no desenvolvimento da HAM/TSP: a primeira hipótese aponta para um mecanismo de citotoxicidade direta, onde células T citotóxicas CD8 +, específicas para antígenos do vírus, cruzariam a barreira hematoencefálica e destruiriam, por mecanismos citotóxicos diretos ou via produção de citocinas, as células da glia infectadas pelo HTLV-1; a segunda hipótese, denominada de autoimune, aponta para um processo de mimetismo molecular no qual a semelhança entre uma proteína neuronal (ribonucleoproteina nuclear heterogênea, hnrnp-a1) do hospedeiro e a mais importante proteína do vírus, o antígeno Tax, acarretaria um processo inflamatório de auto-imunidade com lesão neuronal; e a terceira e última hipótese, e a mais aceita, também denominada de dano circundante ou by stander envolveria os linfócitos T CD4 + infectados e os linfócitos T CD8 + específicos para a proteína viral Tax, que juntos atravessariam a barreira hematoencefálica e produziriam grande quantidade de citocinas pró-inflamatórias levando a um processo de intensa inflamação e destruição tecidual. (ITOYAMA Y.,1988; LEVIN M.C., 2002; NDHLOVU L.C., 2009; SANTOS B.S., et al, 2009). A natureza desses fatores, e os mecanismos pelos quais eles se manifestam precisam ficar claros. Alguns parâmetros como alta carga proviral, elevada linfoproliferação espontânea in vitro, altos títulos de anticorpos e de linfócitos T CD8 + específicos para antígenos do HTLV-1 tanto no soro quanto no fluido cerebrospinal parecem estar associados com a presença da manifestação neurológica (HAM/TSP). No entanto com relação ao processo de progressão da forma clínica assintomática para HAM/TSP, pouco se sabe, porém acredita-se ser conseqüência do estabelecimento de mecanismos imunoprotetores, os quais de alguma maneira conseguem criar um equilíbrio nas interações vírus-hospedeiro (PORTO et al., 2002) PAPEL DOS LINFÓCITOS NA INFECÇÃO PELO HTLV Em portadores que desenvolvem HAM/TSP foi relatado um aumento da produção de IFN-, TNF-α, GM-CSF e IL-1 (NISHIURA, Y., et al., 1996; WATANABE,

22 22 H., et al.,1995) e o aumento de células T CD4+ (GOON, P. K., E., et al, 2002; GOON, P. K., E., et al, 2004; WU, et al., 2000; IWASAKI et al., 1992) e células T CD8+ (JACOBSON, et al., 1990; ELOVAARA, et al., 1993; KUBOTA, et al., 1998; NAGAI, et al., 2001; YAMANO, et al., 2002). Também são observados valores reduzidos de células NK (Yu, et al., 1991; SAITO, et al., 2003; KITAJIMA, et al., 1988) e células B (BRITO-MELO, et al., 2002). Nos indivíduos infectados com Linfoma de Células T do Adulto (ATL) é observado um predomínio de células T CD4+ maduras (TAKATSUKI, 2005; KARUBE, et al, 2004). Em portadores que desenvolveram cerotoconjutivite seca (KCS) relacionado ao HTLV-1, foi relatado um maior número de células T CD8+ em sangue periférico (PINHEIRO, et al., 2006). Pacientes com Uveíte associada ao HTLV-1 exibem uma porcentagem elevada de células T, tanto CD4+ quanto CD8+, em sangue periférico (MOCHIZUKI, et al., 1992), porém apresentam um número elevado do subtipo CD4+ no olho (KIMITAKA, et al, 1995). 3. OBJETIVOS 3.1 Geral Avaliar entre os linfócitos periféricos, as subpopulações linfocitárias e células T regulatórias de indivíduos infectados pelo HTLV Específicos Quantificar subpupulações de linfócitos T (CD4 +, CD8 + e CD4 + CD25 + Foxp3 + ), linfócitos B, células NK; Avaliar a expressão de Foxp3 + em células T CD4 + CD25 + Comparar os valores de linfócitos T CD4 + e CD8 + analisados por dois reagentes de marcação simultânea para imunofluorescência direta.

23 23 CAPÍTULO 1: Artigo Científico 1 : Frequência de subtipos linfocitários periféricos e expressão de Foxp3 na infecção pelo vírus linfotrópico de células T humanas tipo 1 (HTLV-1).

24 INTRODUÇÃO O vírus linfotrópico de células T humanas tipo 1 (HTLV-1) é o agente etiológico da Leucemia de células T do adulto (ATL) (HINUMA et al., 1981), da mielopatia associada ao HTLV-I/paraparesia espástica tropical (HAM/TSP) (GESSAIN et al, 1985; OSAME et al., 1986), da uveíte associada ao HTLV-1 (MOCHIZUKI, 1992) e de dermatites infecciosas (LA GRENADE, 1995). Atualmente tem sido associado a uma série de manifestações clínicas, como artrites (IJICHI et al., 1990) e polimiosites (MORGAN et al., 1989), ceratoconjutivite seca (MERLE, et al., 1996) e doenças infecciosas como tuberculose, estrongiloidíase e escabiose (MARINHO, et al., 2005; PORTO, et al., 2002; BRITES, et al., 2002; PEDRAL- SAMPAIO, et al., 1997), demonstrando o caráter sistêmico desta infecção. O HTLV infecta cerca de 20 milhões de pessoas no mundo (EDLICH et al., 2000), principalmente Nigéria, República Democrática do Congo, Japão, Gana, África do Sul, Moçambique, Brasil e Peru (GERSSAIN & CASSAR 2012). O Brasil representa uma das maiores áreas endêmicas para HTLV-1 e doenças associadas, apresentando uma soroprevalência de 0.04 a 1%, dependendo da localização geográfica (CATALAN-SOARES et al., 2005), com uma estimativa de 300 a 800 mil infectados (GERSSAIN & CASSAR, 2012). No Brasil, a cidade brasileira com maior prevalência mundial, Salvador em Bahia, apresenta uma soroprevalência de cerca de 1,3% entre os doadores de sangue, e 1,8 % na população geral (GALVÃO- CASTRO et al., 1997 e 2009; DOURADO, et al., 2003). A principal célula alvo da infecção é o linfócito T CD4+ (RICHARDSON, 1990), em menor proporção os linfócitos T CD8+ (NAGAI M, et al., 2001), e células dendríticas, (JONES, K. S., et al., 2008). Uma vez infectadas pelo HTLV-I as células T proliferam intensamente, mesmo na ausência de estímulos exógenos, e aumentam a expressão de IL-2R, consequentemente ocorre uma alta produção de citocinas envolvidas na manutenção e proliferação celular como IFN-, TNF-α, IL-15 e IL-2 (YOSHIDA M., 2001; HOLLSBERG, 1999; CARVALHO, 2001). O vírus induz

25 25 ativação do sistema imunológico com expansão clonal de subpopulações linfocitárias por isso possui um papel importante na regulação da resposta imune. Em portadores que desenvolvem HAM/TSP foi relatado um aumento da produção de IFN-, TNF-α, GM-CSF e IL-1 (Nishiura Y, et al., 1996; Watanabe H, et al.,1995) e o aumento de células T CD4 + (GOON, P. K., E., et al, 2002; GOON, P. K., E., et al, 2004; WU, et al., 2000; IWASAKI et al., 1992) e células T CD8+ (JACOBSON, et al., 1990; ELOVAARA, et al., 1993; KUBOTA, et al., 1998; NAGAI, et al., 2001; YAMANO, et al., 2002). Também são observados valores reduzidos de células NK (Yu, et al., 1991; SAITO, et al., 2003; KITAJIMA, et al., 1988) e células B (BRITO-MELO, et al., 2002). Nos infectados com Linfoma de Células T do Adulto (ATL) é observado um predomínio de células T CD4 + maduras (TAKATSUKI, 2005; KARUBE, et al, 2004). Em portadores que desenvolveram cerotoconjutivite seca (KCS) relacionado ao HTLV-1, foi relatado um maior número de células T CD8 + em sangue periférico (PINHEIRO, et al., 2006). Pacientes com Uveíte associada ao HTLV-1 exibem uma porcentagem elevada de células T, tanto CD4 + quanto CD8 +, em sangue periférico (MOCHIZUKI, et al., 1992), porém apresentam um número elevado do subtipo CD4 + no olho (KIMITAKA, et al, 1995). A quantificação de linfócitos e suas subpopulações no sangue periférico por citometria de fluxo tem sido utilizados no diagnóstico e acompanhamento clínico de pacientes infectados pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV). No contexto da infecção pelo HTLV esses biomarcadores não são utilizados na prática clínica. Os objetivos do presente trabalho foram avaliar as subpopulações linfocitárias e células T regulatórias em indivíduos infectados pelo HTLV MATERIAIS E MÉTODOS POPULAÇÃO DE ESTUDO Cinquenta e cinco indivíduos infectados com HTLV-1 (diagnosticados por ELISA anti HTLV I/II+ e confirmados por Western Blot para HTLV+) do Centro de HTLV do Ambulatório Docente Assistencial da Bahiana (ADAB) foram incluídos no

26 26 estudo. Os pacientes foram incluídos sequencialmente, no momento da consulta médica, independente dos sintomas de doença. Amostras de sangue de 80 indivíduos soronegativos para HTLV do Laboratório de Patologia Clínica do ADAB foram incluídos no grupo controle. Foram excluídos os participantes que apresentaram soropositividade para HIV, HCV ou HBV. Este subprojeto faz parte de um projeto maior, realizado pelo grupo de HTLV da ADAB, com aprovação no CEP- 207/2009 CPqGM/FIOCRUZ (ANEXO A). Todos os participantes voluntários assinaram previamente o termo de consentimento livre e esclarecido (ANEXO B) IMUNOFENOTIPAGEM LINFOCITÁRIA Amostras de sangue foram coletadas em tubo contendo EDTA, e dentro de 24 horas, foram marcadas com anticorpos monoclonais conjugados a fluorocromos para identificação dos antígenos de superfície celular da linhagem de linfócitos B (CD19 + ), linhagem linfócitos T totais (CD3 + ), linfócitos T CD4 + (CD3 + CD4 + CD8 - ), linfócitos T CD8 + (CD3 + CD8 + CD4 - ), células NK (CD56 + CD3 - ), de acordo com recomendações dos kits Lymphogram (Cytognos) e Tritest (BD Biosciences) (Tabela 1). Foi utilizado solução de lise Excellyse (Exbio) para a remoção de eritrócitos. Para quantificação de Linfócitos T regulatórios utilizou-se anticorpos anti-cd3, anti-cd4, anti-cd25 e anti-foxp3 (todos BD Biosciences) conjugados a fluorocromos, juntamente com solução fixadora e solução permeabilizante (ADG Andergrub & FixPerm). As amostras marcadas foram adquiridas imediatamente após a marcação no citômetro FACSCalibur (BD Biosciences- Immunocytometry Systems, San Diego, CA, USA) utilizando-se o programa FACScomp (BD). A aquisição de cada amostra, pelo software CellQuest (BD), foi finalizada após eventos terem sido processados. As análises das aquisições foram feitas pelo software CellQuest (BD) e pelo Summit (Dako).

27 27 Tabela 1: Composição dos anticorpos monoclonais e fluorocromos utilizados como reagentes de kits para quantificação de subpopulações linfocitárias. Anticorpo Monoclonal X Fluorocromo Lymphogram Tritest Linf. T Regulatórios Anti-CD3 PE Anti-CD3 PerCP Anti-CD25 APC Anti-CD4 PECy5 Anti-CD4 FITC Anti-CD3 PECy5 Anti-CD8 FITC Anti-CD8 PE Anti-CD4 FITC Anti-CD56 PE Anti-CD19 FITC Anti-Foxp3 PE R-ficoeritrina (PE), R-ficoeritrina - cianina 5 (PECy5), isotiocianato de fluoresceína (FITC), proteina clorofila peridinina (PerCP), Aloficocianina (APC) Análises das aquisições das células marcadas com kit Lymphogram As análises das aquisições foram realizadas de acordo com Figura 2. Para seleção da população de interesse, realiza-se seleção denominada estratégia de gate, considerando-se tamanho e estrutura dos eventos, bem como a expressão de moléculas de superfície. O kit Lymphogram foi utilizado para quantificação relativa das subpopulações linfocitárias. Para o cálculo dos valores absolutos das subpopulações por microlitro de sangue, indicado pelo fabricante, foi utilizado o reagente PerfectCount Microspheres (Cytognos, Salamanca, Espanha), considerando-se o número de microesferas por microlitro, fornecido pelo fabricante, conforme formula abaixo: Fonte: bula do kit Lymphogram (Cytognos)

28 28 Figura 2: Critério de análise das subpopulações linfocitárias pelo kit Lymphogram. A-seleção por gate da população de linfócitos totais para o estudo (tamanho-fsc versus granulosidade-ssc); B- Dot plot de purificação/identificação (FL-FITC versus FL-PE); C- identificação de CD3 + através da análise de FSC versus padrão de fluorescência (CD56/CD3 PE ); D- identificação de CD3 + através da análise do padrão de fluorescência CD56/CD3PE versus CD4/PECy5; E- identificação de CD8 +, CD56 + e CD19 + através da análise do padrão de fluorescência CD56/CD3PE versus CD8/CD19FITC. A distribuição das células é avaliada de acordo com intensidades de fluorescência emitidas pela ligação dos anticorpos monoclonais específicos, em ambos os eixos Análises das aquisições das células marcadas com kit Tritest Reagente de imunofluorescência composto por anticorpos monoclonais usado com tubos de contagem absoluta contendo microesferas, para identificar e determinar contagem absoluta de célula/µl de linfócitos T maduros humanos. As análises das aquisições foram realizadas de acordo com Figura 3.

29 29 Figura 3: Critério de análise das subpopulações linfocitárias pelo kit Tritest. A observa-se a população de linfócitos totais para o estudo (CD3 PerCP versus granulosidade-ssc); B os subtipos de linfócitos CD3 + (CD4 FITC versus CD8 PE ) CONSIDERAÇÕES ÉTICAS O projeto foi aprovado no CEP-207/2009CPqGM/FIOCRUZ. (Anexo A) Os pacientes foram convidados a participar do estudo, sendo informados sobre o objetivo desta pesquisa e assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Anexo B). A coleta da amostra de sangue, realizada na rotina durante o seu atendimento e exames realizados no setor de coleta do laboratório, não implicou em riscos adicionais à saúde dos pacientes. Todas as informações coletadas foram mantidas sob sigílo, e armazenadas em bancos de dados protegidos, acessíveis apenas aos investigadores. Os resultados obtidos serão publicados sob a forma de artigos científicos em revistas especializadas e comunicações em congressos. A identidade dos participantes será preservada ANÁLISE ESTATÍSTICA Foi realizada a análise estatística descritiva. Para verificação de normalidade dos dados, foram aplicados os testes de Kolmogorov-Smirnov, e teste t para comparar os grupos. Para correlação dos reagentes de imunofluorescência, foi

30 30 aplicado teste de Spearman. Todas as análises/gráficos foram feitas com o software GraphPad Prism 6.0 para Windows. Todos os dados estão apresentados em média e desvio padrão. O intervalo de confiança para os testes estatísticos foi definido em 95% (p<0,05). 4.3 RESULTADOS CARACTERÍSTICAS DA POPULAÇÃO ESTUDADA Foram incluídos 135 indivíduos, dos quais 55 soropositivos para HTLV-1, sendo 84% do sexo feminino, com idade média de 43 ±13 anos; e 80 indivíduos soronegativos para HTLV-1, sendo 79% do sexo feminino, com idade média de 47 ±12 anos. Quarenta e sete por cento dos pacientes infectados pelo HTLV-1, eram recém-matriculados (1ª consulta) no centro de HTLV/ADAB-EBMSP, e 53% já realizavam acompanhamento por mais de 1 ano (Tabela 2). Os resultados de leucócitos totais, neutrófilos e linfócitos dos dois grupos de estudo estão representados na tabela 3. Observou-se um valor menor do número de neutrófilos em pacientes infectados pelo HTLV-1: 3662±1743 céls/µl, comparado aos valores obtidos em indivíduos não infectados: 4637±2250 céls/ul (p = 0,0117). Tabela 2: Características clínicas e epidemiológicas da população estudada. Infectados pelo HTLV Controles não infectados N=55 N=80 Idade (MÉDIA±DP) 44 (±13) 47 (±12) Sexo 16% Sexo Masculino 21% Sexo Masculino 84% Sexo Feminino 79% Sexo Feminino * Primeira consulta; DP=Desvio Padrão.

31 31 Tabela 3: Aspectos leucometricos dos participantes voluntários soropositivos para HTLV e soronegativos. Infectados pelo HTLV Controles não infectados N=55 N=80 Leucócitos Totais* (cél/µl) 6464 ± ±2528 Neutrófilos* (cél/µl) 3662 ± ±2250 (%) 54 ±10 57 ±12 Linfócitos Totais (cél/µl) 2306 ± ±660 (%) 36 ±9 33 ±10 Nota: Os resultados estão representados em média±desvio padrão. * Estatísticamente significante p<0,05 (teste t).

32 32 ANÁLISE DAS SUBPOPULAÇÕES LINFOCITÁRIAS Observou-se um aumento estatisticamente significante na média de linfócitos T totais (CD3 + ) (1708±795 células/µl) nos indivíduos infectados, comparado ao grupo controle (1440±531 células/µl) (p = 0,0221). Na análise dos valores relativos, verificou-se média de 75±9% da frequência de linfócitos T CD3 + em infectados e 67±8% nos controles (p<0,0001) (Figura 4 e Tabela 4). Todos os resultados deste estudo encontram-se representados em tabela no Apêndice C. Figura 4: Representação gráfica das médias±dp dos valores absolutos (gráfico da esquerda) e relativos (gráfico da direita) de linfócitos T totais (CD3 + ) em indivíduos infectados pelo HTLV e controles (não infectados/soronegativos). Amostras de 55 pacientes infectados e 80 controles foram quantificadas utilizando os reagentes para teste de imunofluorescendia direta Lymphogram e Perfect Count (ambos Cytognos) por citometria de fluxo. (Significância estatística p<0,05; test t). Tabela 4: Valores de linfócitos T totais (CD3 + ), representado em Média± Desvio Padrão, e o valor de p.

33 33 A média de linfócitos T CD4 + foi 1103±665 células/µl + em indivíduos infectados, e 882±354 células/µl nos controles (p= 0,0138). O mesmo aumento foi observado nos valores relativos, a média de porcentagem de linfócitos T CD4+ foi 47±10% em infectados e 42±8% nos controles, (p = 0,0006) (Figura 5 e Tabela 5). Figura 5: Representação gráfica das médias±dp dos valores absolutos (gráfico a esquerda) e relativos (gráfico á direita) de de linfócitos T CD4 + em indivíduos infectados pelo HTLV e controles não infectados. Amostras de 55 pacientes infectados e 80 controles foram quantificadas utilizando os reagentes para teste de imunofluorescendia direta Lymphogram e Perfect Count (ambos Cytognos) por citometria de fluxo. (Significância estatística p<0,05; test t). Tabela 5: Valores de linfócitos T CD4+, representado em Média± Desvio Padrão, e o valor de p.

34 34 Na quantificação de linfócitos T CD8 + foi observado um maior número de células (média de 548±261 células/µl) nos infectados pelo HTLV-1, comparados aos soronegativos (467±205 células/µl) (p= 0,0476). Na análise dos valores relativos observou-se uma presença de 24±8% de linfócitos T CD8+ nos infectados, e 21± 6% nos controles (p=0,0196) (Figura 6 e Tabela 6). Figura 6: Representação gráfica das médias±dp dos valores absolutos (gráfico a esquerda) e relativos (gráfico a direita) de linfócitos T CD8 + em indivíduos infectados pelo HTLV e controles não infectados. Amostras de 55 pacientes infectados e 80 controles foram quantificadas utilizando os reagentes para teste de imunofluorescendia direta Lymphogram e Perfect Count (ambos Cytognos) por citometria de fluxo. (Significância estatística p<0,05; test t). Tabela 6: Valores de linfócitos T CD8 +, representado em Média± Desvio Padrão, e o valor de p.

35 35 A razão entre linfócitos CD4 + /CD8 + não apresentou diferença nos grupos infectado pelo HTLV-1 (2,2±1,2) e controle (2,0±0,7) (p= 0,2629) (Figura 7). Figura 7: Representação gráfica das médias±dp da razão entre linfócitos T CD4 + /CD8 + em indivíduos infectados e controles negativos. Amostras de 55 pacientes infectados e 80 controles foram quantificadas utilizando os reagentes para teste de imunofluorescendia direta Lymphogram e Perfect Count (ambos Cytognos) por citometria de fluxo. (Significância estatística p<0,05; test t).

36 36 A contagem média de células NK nos indivíduos infectados pelo HTLV-1 (308±204 células/µl) foi inferior à média dos controles não infectados (383±216 células/µl) (p=0,0463). Na análise dos valores relativos, verificou-se uma contagem de 14±8% dessas células em infectados e 18±8% nos controles (p=0,0012) (Figura 8). Figura 8: Representação gráfica das médias±dp dos valores absolutos (gráfico a esquerda) e relativos (gráfico a direita) de células NK em indivíduos infectados e controles negativos. Amostras de 55 pacientes infectados e 80 controles foram quantificadas utilizando os reagentes para teste de imunofluorescendia direta Lymphogram e Perfect Count (ambos Cytognos) por citometria de fluxo. (Significância estatística p<0,05; test t). Tabela 7: Valores de células Natural Killer, representado em Média± Desvio Padrão, e o valor de p.

37 37 Não foram observadas diferenças do número absoluto de linfócitos B entre os indivíduos infectados pelo HTLV-1 (237±122 células/µl) e os controles não infectados (276±157 células/µl) (p=0,1291). No entanto, uma diferença significante foi obtida nos valores relativos de linfócitos B. Observou-se uma média de 11±5% de linfócitos B nos indivíduos infectados e 14±7% nos controles não infectados (p=0,0565) (Figura 9 Tabela 8). Figura 9: Representação gráfica das médias±dp dos valores absolutos e relativos de linfócitos B em indivíduos infectados e controles negativos. Amostras de 55 pacientes infectados e 80 controles foram quantificadas utilizando os reagentes para teste de imunofluorescendia direta Lymphogram e Perfect Count (ambos Cytognos) por citometria de fluxo. (Significância estatística p<0,05; test t). Tabela 8: Valores de linfócitos B, representado em Média± Desvio Padrão, e o valor de p.

38 38 Na avaliação da subpopulação de células T CD4 + foram quantificadas células com fenótipo CD3 + CD4 + CD25 + e dessas, as que expressavam Foxp3 +, em 34 indivíduos infectados e 64 controles. Observou-se uma maior contagem de células T CD3 + CD4 + CD25 + em indivíduos infectados pelo HTLV-1 (7,2±6,1%) comparados à média (3,7±1,3%) em controles não infectados (p< 0,0001). A expressão de Foxp3 nesta subpopulação foi inferior nos pacientes infectados pelo HTLV-1 (18,2±19,6%) comparados aos controles não infectados (44,3±30,5%) (p< 0,0001) (Figura 10). Figura 10: Representação gráfica das médias±dp dos valores relativos de de linfócitos T CD3+CD4+CD25+ e análise da expressão de Foxp3 nesta subpopulação linfocitária em infectados pelo HTLV-1 e controles negativos. Amostras de 46 pacientes infectados e 64 controles foram quantificadas utilizando os reagentes para teste de imunofluorescendia direta por citometria de fluxo. (Significância estatística p<0,0001; test t). Tabela 9: Médias±DP dos valores relativos das células T regulatórias. Infectados pelo Controles Não Valor de P HTLV-1 infectados N=46 N=64 CD3+CD4+CD25+ 7,2±6,1 3,7±1,3 p< 0,0001 CD3+CD4+CD25+Foxp3+ 18,2±19,6 44,3±30,5 p< 0,0001 Média da porcentagem. Significância estatística p<0,0001; test t

39 39 Foram feitas análises de 36 dos indivíduos infectados e 70 dos indivíduos controles pelo método Tritest. A média de valores de linfócitos CD3 +, linfócitos CD4 + e linfócitos CD8 + obtida com o Lymphogram desses 36 indivíduos infectados foi semelhante à obtida pelo Tritest (Tabela 10). Houve uma boa correlação de Spearman entre a contagem de linfócitos Tpelo Lymphogram e Tritest (Figura 11). Tabela 10: Dados (médias±dp) dos valores absolutos (cél/μl) e relativos (%) dos linfócitos T CD3+, CD4+, CD8+, de indivíduos infectados pelo HTLV-1 e não infectados, quantificados por citometria de fluxo utilizando Lymphogram e Triste, seus respectivos valores de P (significância) e r (Correlação). E médias±dp dos valores absolutos (cél/μl) e relativos (%) de células NK e linfócitos B, de indivíduos infectados pelo HTLV-1 e não infectados, quantificados por citometria de fluxo utilizando Lymphogram, seus respectivos valores de P (significância). LYMPHOGRAM TRITEST Infectados pelo HTLV-1 N=36 Controles Não infectados N=70 Valor de P Infectados pelo HTLV-1 N=36 Controles Não infectados N=70 Valor de P Linfócitos CD3+ Cél/µL 1642± ±569 P = 0, ± ±566 P<0,0001 % 73±9 68±8 P < 0, ±13 60±9 - Linfócitos CD3+CD4+ Cél/µL 1027± ±359 P = 0, ± ±323 P<0,0001 % 46±10 41±7 P = 0, ±9 56±9 - Linfócitos CD3+CD8+ Cél/µL 532± ±250 P = 0, ± ±266 P<0,0001 % 24±6 23±6 P = 0, ±8 35±8 - Células NK (CD56+CD3-) Cél/µL 414± ±257 P = 0, % 18±7 20±8 P = 0, Linfócitos B (CD19+CD3-) Cél/µL 228± ±153 P = 0, % 10±5 13±4 P = 0,

40 40 Figura 11: Valores absolutos de células CD3 +, CD4 + e CD8 + por citometria de fluxo utilizando Lymphogram / (Cytognos) e Tritest (BD) em 36 indivíduos infectados pelo HTLV-1, e 70 indivíduos controles. (Correlação por Spearman e Significância por Wilcoxon test).

41 DISCUSSÃO Os valores de linfócitos T obtidos do grupo controle no presente estudo foram semelhantes aos valores descritos em populações de doadores de sangue e de laboratório de hematologia quantificados com Lymphogram (GIUSTOLISI, et al., 2001; e BELLIDO, et al., 1998) e aos valores em doadores de sangue descrito com o Tristet (TORRES et al., 2013) (Apendice A). Nossas análises mostraram que indivíduos infectados pelo HTLV-1 apresentam uma contagem de células T CD4 + e CD8 + elevada e valores menores de células NK, quando comparados aos controles não infectados. A razão entre linfócitos CD4 + /CD8 + foi semelhante nos dois grupos, indicando que os indivíduos infectados apresentam valores proporcionalmente elevados de células T CD4 + e CD8 + nos portadores de HTLV. Os valores obtidos no presente estudo forama semelhantes aos encontrados por Brito-Mello e col. (2002), que avaliaram 74 indivíduos infectados pelo HTLV-1 utilizando diferentes paines para quantificação das subpopulações celulares. Diferindo em parte do resultado obtido por Sóuza e col. (2003), que observou uma relação CD4/CD8 menor no grupo soropositivo sintomático, porém sem significância estatística. No entanto devemos levar em consideração que o grupo de indivíduos infectados do presente estudo é heterogêneo no que se refere a sintomatologia. Copeland e Heeney (1996) sugerem que frequências mais elevadas de células T CD8 + em pacientes HAM/TSP estejam relacionadas com a carga proviral elevada, o que não é observado em pacientes com ATL. Resultados de Ndhlovu e col. (2011), entre indivíduos infectados pelo HTLV-1, na população brasileira, mostraram uma proporção significativamente elevada de células T CD4 +, e níveis significativamente baixos de células T CD8 + em indivíduos que desenvolveram HAM/TSP, quando comparados a infectados sem HAM/TSP e não infectados. Porto e col. (2002) sugerem também que células T CD8 + estão elevadas em indivíduos infectados pelo HTLV-1 (com HAM/TSP e em assintomáticos), levando a uma razão CD4 + /CD8 + <1,0. Essas observações apontam que a razão CD4 + /CD8 + está diretamente relacionada à manifestação clínica da infecção e a carga proviral. Para esclarecer os resultados conflitantes de análise imunofenotípica de células T de indivíduos soropositivos para HTLV são necessários análises dessas células

42 42 relacionando as manifestações clínicas e carga proviral, e adicionalmente estudos qualitativos dessas subpopulações. No presente estudo as médias das contagens de células NK de indivíduos infectados pelo HTLV foram menores que a média do grupo controle. O estudo de Brito-Mello e col. (2002) mostram também uma contagem de células NK (fenótipo CD16 + CD3 - ) menor em indivíduos infectados pelo HTLV-1 com HAM/TSP quando comparado aos grupos assintomático, oligosintomático e não infectado. Norris e col. mostram que além de células T, as células NK, também sofrem proliferação espontânea significativa em indivíduos infectados pelo HTLV-1, e sugerem que a proliferação espontânea de células NK está positivamente correlacionada com a carga proviral (Apendice D). Os valores delinfócitos B dos indivíduos infectados pelo HTLV-1 do presente estudo foram menores que o intervalo de referência do Lymphogram, observou-se que as médias de células B de indivíduos infectados do nosso estudo foram menores que os valores dos não infectados e dos valores indicados pelo kit. Porém sem significância estatística. Morbach e col. (2010) numa população de 32 indivíduos com idades entre 26 e 50 anos, da Würzburg (Alemanha), sugerem como valor de referência para linfócitos B (CD19+) a mediana dos valores absolutos 199 ( ) cél/µl, dos valores relativos 9,2 (7,2 11,2)%. Portanto estes dados não são indicados como referência para a população brasileira, visto que os valores médios dessas células em indivíduos controles também são mais baixos que os valores propostos por Morbach e col. (2010). Para ser aplicado clinicamente são necessários maiores estudos a respeito dos valores de referencia desta célula na população brasileira. Com o Lymphogram pode-se indenficar e quantificar os linfócitos T CD3 + pelo perfil de intensidade de fluorescência, que se observa na graficação dos resultados, de acordo com a expressão dessa molécula nas células, por este reagente pode-se identificar duas moléculas em único canal, observando a diferença da intensidade de fluorescência entre as células. Algumas células NK expressam a molécula CD3 +, sendo denominadas células NKT. No Lymphogram as células NKT são localizadas no gate de células que apresentam CD56, sendo incluídas no grupo de células NK, possibilitando uma determinação do valor de CD3 + mais exato. Por

43 43 outro lado, com o Tritest não se pode diferenciar as células NKT, é identificado CD3 total sem considerar a coexpressão de CD56. No presente estudo, os indivíduos infectados pelo HTLV-1 apresentaram menor número de leucócitos totais e neutrófilos em relação aos controles não infectados, porém os valores médios da contagem absoluta e relativa de linfócitos totais no sangue periférico não diferiram de forma significativa entre os grupos, estando os dois grupos dentro dos limites de normalidade. Sóuza e col. (2003) em população de doadores de sangue, no Ceará, com 35 indivíduos soropositivos para HTLV e 26 controles observou uma contagem média maior de neutrófilos no grupo soropositivo sintomático, embora sem neutrofilia, comparado aos grupos assintomático e não infectado, assim como os valores médios da contagem de linfócitos, porém ambos não alcançaram diferença significativa entre os grupos. Porém Brito-Mello e col. (2002) anteriormente não observaram diferença significativa no número de leucócitos totais, neutrófilos e linfócitos totais entre indivíduos infectados e não infectados. Estudos têm demonstrado uma redução significante na expressão de Foxp3 nas células T em várias doenças auto-imunes (SAKAGUCHI et al., 2006). Nossos resultados mostram uma menor expressão da proteína Foxp3 em células T CD3+CD4+CD25+ em indivíduos infectados pelo HTLV quando comparados aos não infectados, mesmo apresentando uma frequência significativamente maior de células T CD3+CD4+CD25+ nos infectados. Yamano e col. (2005) demonstraram a redução da expressão de Foxp3 e outros biomarcadores em células T CD4+CD25+ de indivíduos infectados pelo HTLV-1 com HAM/TSP. Em 2009, os mesmos autores, sugerem que o aumento da expressão do gene viral tax estaria associado à diminuição da expressão de Foxp3+ em células T CD4+CD25+ em infectados com HAM/TSP. Adicionalmente, Sakaguchi e col. (2008) atentam que em indivíduos sadios, as células T regulatórias são capazes, entre outras funções, de suprimir a proliferação e produção de citocinas tanto de células T CD4+ quanto de células T CD8+. Yamano e col. mostraram que células T CD4+CD25+ de pacientes HAM/TSP mostraram baixa expressão de CD38, CD62L, CD69, CTLA-4, e GITR comparado a células de indivíduos saudáveis, e diminuição na expressão de CD45RA, e um

44 44 aumento na expressão de CD45RO em células T CD4+CD25+ de pacientes HAM/TSP, sugerindo que há alguma relação entre a redução dessas moléculas, em particular GITR e CTLA-4, e a função de células T regulatórias em pacientes com HAM/TSP. Sendo assim, mais estudos são necessários para pesquisa desses subtipos celulares com biomarcadores de função, correlacionado a carga proviral, expressão de Tax e manifestações clínicas. 4.5 CONCLUSÃO Com base nos resultados, observamos que indivíduos infectados pelo HTLV-1 apresentam uma contagem de células T CD4 + e CD8 + maior, e valores menores de células NK, quando comparados aos controles não infectados. Apesar de não apresentar diferenças estatísticas nos valores de linfócitos B entre os dois grupos, fica a indicação da a necessidade de estudos de padronização quantitativa dessas células, bem como de células NK, na população brasileira. No presente estudo, a observação da baixa expressão do regulador da transcrição gênica (Foxp3) em células com fenótipo CD3 + CD4 + CD25 +, pode-se inferir necessidade de estudos voltados para este grupo de células, que pode estar relacionada em um mecanismo fundamental para a compreensão da patogenicidade celular pelo HTLV-1.

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53 53 5. CONCLUSÃO GERAL Nossas análises quantitativas mostraram que indivíduos infectados pelo HTLV-1 apresentam uma contagem de células T CD4+ e CD8+ maior, porém proporcinal nas duas células, e valores menores de células NK, quando comparados aos controles não infectados. Apesar de não apresentar diferenças estatísticas nos valores de linfócitos B entre os dois grupos, atentamos para a necessidade de estudos de padronização quantitativa dessas células, bem como de células NK, na população brasileira. Destacamos a observação da baixa expressão do regulador da transcrição gênica (Foxp3) em células com fenótipo CD3+CD4+CD25+, atentando para necessidades de estudos voltados para este grupo células, que pode estar relacionada em um mecanismo fundamental para a compreensão celular HTLV-1 patogenicidade. Nossos resultados indicam que o Lymphogram pode ser utilizado em diferentes contextos de investigação, como o diagnóstico e monitoramento na infecção pelo HTLV-1. A investigação de biomarcadores por citometria de fluxo é uma técnica estabelecida na enumeração das subpopulações de linfócitos T para a monitorização de pacientes com vírus da imunodeficiência humana (HIV). As vantagens na utilização deste reagente é identificação simultânea, rápida e de baixo custo das quatro principais subpopulações linfocitárias, porém é uma limitação do reagente a dificuldade de identificação das células NKT, pois o anticorpo anti-cd3+ e o anti-cd56+ utilizam o mesmo fluorocromo, o R-ficoeritrina (PE). Essa limitação pode ser solucionada, adicionanda anti-cd3+ conjugado ao fluorocromo Aloficocianina (APC), para detecção intracelular de CD3+. Nossos resultados corroboram com Giustolisi e col. e Bellido e col., que ao comparar imunofenotipagem linfocitária realizada por painel de citometria de fluxo convencional e o Lymphogram, também mostraram que não haviam discrepâncias na imunofenotipagem entre dois métodos.

54 54 6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS BELLIDO, M. et al. Rapid and simple immunophenotypic characterization of lymphocytes using a new test. Haematologica; vol.83: , BIDDISON, W.E., KUBOTA, R., KAWANISHI, T., TAUB, D.D., CRUIKSHANK, W.W., CENTER, D.M., CONNOR, E.W., UTZ, U., JACOBSON, S. Human T cell leukemia virus type I (HTLV-I)-specific CD8+ CTL clones from patients with HTLV-I-associated neurologic disease secrete proinflammatory cytokines, chemokines and matrix metalloproteinase. J.Immunol., v.159, n.4, aug. p BRITO-MELLO, G.E.A., et al. Phenotypic Study of Peripheral Blood Leucocytes in HTLV-I-Infected Individuals from Minas Gerais, Brazil. Scand. J. Immunol. v.55, p , CARVALHO, E. M., BACELLAR, O., et al. Cytokine profile and immunomodulation in asymptomatic human T-lymphotropic virus type 1-infected blood donors. J Acquir Immune Defic Syndr 27(1): 1-6, CASTRO, B. HTLV-I in the general population of Salvador, Brazil: a city with African ethnic and sociodemographic characteristics. J. Acquir. Immune. Defic. Syndr., v.34, n.5, Dec, p CASTRO-COSTA, C. M; et al. Proposal for Diagnostic Criteria of Tropical Spastic Paraparesis/HTLV-I-Associated Myelopathy (TSP/HAM). Aids Research And Human Retroviruses, v. 22, n. 10, pp , COPELAND, K.F. T; HEENEY, J. L. T Helper Cell Activation and Human Retroviral Pathogenesis. Microbiological Reviews, v. 60, n. 4, p , DELAMARRE, L., ROSENBERG, A.R., et al. A novel human T-leukemia virus type 1 cell-to-cell transmission assay permits definition of SU glycoprotein amino acids important for infectivity. J. Virol. v.71, DOURADO I., et al. HTLV-I in the general population of Salvador, Brazil\: a city with African ethnic and sociodemographic characteristics. J Acquir Immune Defic Syndr 34: , DOURADO, I., ALCANTARA, L.C., BARRETO, M.L., DA GLORIA TEIXEIRA, M., GALVÃO- DUYNE, R. V; et al. Localization and Sub-Cellular Shuttling of HTLV-1 Tax with the mirna Machinery. PLoS ONE, v. 7 Issue 7 e40662; July EDLICH, R.F., ARNETTE, J.A., WILLIAMS, F.M. Global epidemic of human T-Cell lymphotropic virus type-i (HTLV-I). J. Emerg. Med., v. 18, n.1, Jan, p , 2000.

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61 61 APÊNDICE A Médianas dos valores absolutos de células T totais, T CD4+ e T CD8+ de indivíduos infectados pelo HTLV e controles não-infectados do presente estudo, e medianas encontradas por Torres e col. em 2013, incluindo no estudo 645 doadores adultos e 280 crianças saudáveis de 280 voluntários (148 na Bahia e 132 no Rio de Janeiro), utilizando o kit Multitest (Becton Dickinson Immunocytometry Systems,)+Trucount tubes, e analisando os anticorpos anti-cd3 +, anti-cd8 +, anti-cd45 + e anti-cd4 +. HTLV-1 Controles TORRES 2013 Não infectados Lymphogram Tritest Lymphogram Tritest Multitest CD CD CD APÊNDICE B Médias [mínimo e máximo] dos valores relativos de células T totais, T CD4+, TCD8+, células NK e linfócitos B de indivíduos infectados pelo HTLV-1 do presente estudo (segunda e terceira colunas), médias [mínimo e máximo] dos valores relativos de linfócitos T descritos por Torres e col. (quarta coluna) e médias [mínimo e máximo] dos valores relativos do intervalo de referência indicado Lymphogram (última coluna). Infectados HTLV Não infectados HTLV Torres et al. Intervalo de Referencia Lymphogram CD3 74,88 [39,6-92,0] 67,75 [42,5-86,3] 77, [50,8-88,7] CD3+CD4+CD8-47,24 [21,3-76,6] 41,68 [28,0-64,1] 42, [24,4-67,1] CD3+CD4-CD8+ 24,47 [9,6-51,0] 21,75 [11,0-34,0] 25, [12,6-53,6] CD56+CD3-13,83 [3,2-35,9] 18,43 [4,3-43,4] [2,07-24,4] CD19+CD3-10,8 [3,2-23,6] 13,8 [4,0 57,0] [4,98-25,5]

62 APÊNDICE C 62

63 APÊNDICE D 63 Médias±DP dos valores relativos células T totais, T CD4 +, TCD8 +, células NK e linfócitos B de indivíduos infectados pelo HTLV-1 do presente estudo (primeira e segunda colunas), E médias±dp dos valores relativos de linfócitos T, NK e B descritos por Brito-Mello e col. (2002) (terceira, quarta, quinta e sextacolunas), em 74 indivíduos infectados pelo HTLV-1(18 assintomáticos,14 oligossintomáticos e 42 HAM/TSP definido) com 32 controles.

64 ANEXO 64

65 65 ANEXO B Termo de Consentimento Livre e Esclarecido Projeto de Investigação: Biomarcadores imunológicos no monitoramento da infecção pelo HTLV-1 Pesquisadores Responsáveis: Dra Maria Fernanda Rios Grassi Médico Responsável: Dr. Bernardo Galvão Prezado paciente: O Sr(a) está sendo convidado para participar desta pesquisa que pretende verificar se pacientes infectados pelo HTLV apresentam alguma diferença na atividade das células do sangue. A infecção pelo vírus chamado HTLV-1 pode causar dois tipo de doença: uma leucemia (câncer de glóbulos brancos do sangue) ou uma doença do sistema nervoso, que causa paralisia, porém muitas pessoas não apresentam nenhuma doença. Este estudo pretende buscar diferenças nos exames das pessoas que são infectadas por esse vírus e tem manifestações diferentes (tem doença ou não tem nenhum sintoma). Nesse sentido, acreditamos que esse estudo poderá ser contribuir para que no futuro os pacientes possam ser tratados antes de manifestarem a doença. Para que isso seja possível realizar esta pesquisa pedimos a doação de uma amostra de sangue para realizar exames de laboratório, sorologia (HIV, virus das hepatites C e B) e para ensaios de pesquisa das células de defesa. Essas amostras serão obtidas no momento em que exames de sangue forem necessários para o seu próprio acompanhamento clínico. Aproveitaremos o pedido de coleta de sangue para o exame de rotina, e solicitaremos ao laboratório que retire um pouco a mais (25ml, cerca de 5 colheres de sopa) para esta pesquisa. Esta doação ocorrerá apenas uma vez. Assim sendo, o número de vezes que o sangue será retirado não será maior do que o realmente necessário para o acompanhamento de rotina e não será necessário vir ao Centro médico apenas com o objetivo de participar da pesquisa. A coleta de sangue será realizada por um profissional treinado, entretanto pode ocorrer uma dor ligeira e um pequeno sangramento no local da picada, ficando o braço roxo. Esta mancha desaparece dentro de 1 a 2 dias. Será realizada igualmente a coleta do líquido da coluna por um médico experiente. Para o exame, o Sr (a) estará deitado (a) de lado, com o pescoço para baixo e as pernas encolhidas. O médico limpa a coluna e anestesia o local e coloca a agulha de punção entre a quarta e a quinta vértebras lombares. O líquido drenado é colocado nos tubos de ensaio e enviado para o laboratório para análise. Após o exame, o médico comprime o local com as mãos e coloca um bandaid. Depois do exame a pessoa pode ter dor de cabeça, 12 horas a 2 dias depois. Pode haver também dor na nuca e coluna, dormência nas pernas, rigidez do pescoço, vômitos e náuseas, visão turva, tonturas, vertigem ou zumbido. TODOS esses sintomas melhoram com medidas simples como ficar em deitar e beber muito líquido. Este exame

66 66 só será realizado se o médico detectar alterações no sistema nervoso qu precise ser diagnosticada com este exame. A sua participação neste estudo é voluntária e espontânea. A sua assistência médica não será modificada em função da sua aceitação ou não em participar deste estudo. Também não envolverá nenhum custo adicional. Caso necessite regressar ao hospital por razões ligadas ao estudo, suas despesas com transporte e alimentação serão pagas pelos responsáveis pela pesquisa. Além disso, você poderá desistir de participar a qualquer momento sem que isto interfira no tratamento futuro neste hospital. O material obtido de sua amostra de sangue (plasma e células) será utilizado apenas neste estudo. Toda a informação obtida ou disponibilizada neste estudo será considerada como sigilosa de modo a garantir confidencialidade e não será divulgada sem a sua permissão. Para que outros médicos possam no futuro ampliar seus conhecimentos sobre esta doença, gostaríamos de mostrar os resultados obtidos neste projeto em congressos (pôster ou apresentação oral) e em publicações em revistas científicas. Por outro lado, nos comprometemos a não dizer seu nome e a utilizar os resultados obtidos apenas com finalidade científica. A equipe de pesquisadores (Dr Bernardo Galvão, Dra Fernanda Grassi) está disponível a qualquer momento para qualquer esclarecimento no número Caso queira, o Sr (a) poderá entrar em contato com o Comitê de Ética em Pesquisas da Fiocruz pelo telefone Eu aceito fazer parte do grupo de estudo Biomarcadores imunológicos no monitoramento da infecção pelo HTLV-1 Recebi todas as orientações sobre este trabalho. Entendi o propósito do estudo, e compreendo que o objetivo deste estudo é uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos na infecção causada pelo vírus HTLV-1. Sei que este trabalho foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Humana. Estou recebendo uma cópia deste documento datada e assinada, e não estou abdicando de nenhum dos meus direitos legais. Salvador, / /. Assinatura: Assinatura da Testemunha:

67 67 ANEXO C Figura: Intervalo de referência indicado pelo Lymphogram. Fonte: Prospecto do kit Lymphogram Figura: Intervalo de referência indicado pelo Tritest. Fonte: Prospecto do kit Tritest.