Avaliação do efeito de extratos vegetais na formação de ligações cruzadas em córneas de coelho por calorimetria exploratória diferencial

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1 Avaliação do efeito de extratos vegetais na formação de ligações cruzadas em córneas de coelho por calorimetria exploratória diferencial Resumo A formação de ligações cruzadas (crosslinking), entre as fibrilas de colágeno, promovida por extratos ricos em flavonoides em córneas de coelho de abatedouro foi avaliada por calorimetria exploratória diferencial. A técnica de DSC mostrou-se satisfatória para mensurar a eficiência de extratos vegetais na promoção de ligações cruzadas. Os resultados obtidos mostraram um aumento na temperatura e entalpia de desnaturação em relação ao grupo controle, o que pode ser atribuído ao aumento das ligações cruzadas entre as fibrilas de colágeno. Palavras-chave: córnea, DSC, ligações cruzadas de colágeno. Introdução O estroma da córnea que representa 90% de sua espessura é composto principalmente por fibrilas de colágeno do tipo I. O ceratocone é uma doença ocular não inflamatória, que afeta o formato e a espessura da córnea pelo afrouxamento das fibrilas de colágeno, com diminuição da acuidade visual. O procedimento de crosslinking promove o enrijecimento da córnea pela formação de novas ligações cruzadas entre as fibrilas de colágeno, através de riboflavina fotoestimulada por radiação ultravioleta de 365 nm [1]. A riboflavina inicia o processo com formação oxigênio singlete, que promove a união de fibrilas de colágeno adjacentes por ligações covalentes, principalmente, entre resíduos de lisina e hidroxilisina. O resultado deste processo é o aumento da força biomecânica e da resistência da córnea, com diminuição da taxa de progressão do ceratocone. No entanto, a aplicação de radiação ultravioleta mostrou-se nociva aos queratócitos [2], tornando-se necessário a busca por moléculas promotoras de ligações cruzadas que não necessitem de fotoestimulação por radiação ultravioleta. Alguns flavonoides encontrados em frutos, como: uva, açaí e jabuticaba, apresentam potencial atividade na formação de ligações cruzadas em moléculas como o colágeno [3]. Essa modificação estrutural do colágeno pode ser avaliada por calorimetria exploratória diferencial, através da análise do perfil de desnaturação de córneas submetidas a tratamentos distintos.

2 Assim, no presente trabalho foi analisada a eficiência de alguns extratos vegetais ricos em flavonoides na promoção de ligações cruzadas entre as fibrilas de colágeno, através do perfil de desnaturação de córneas de coelho de abatedouro. Experimental Materiais A solução de riboflavina 0,1% em Dextran T-500 foi adquirida da Ophthalmos (São Paulo, SP). Os olhos de coelho enucleados foram obtidos de abatedouro (Granja dos Ipês, Salto de Pirapora, SP), com menos de 6 horas pós-morte. Os extratos de polpa de açaí e casca de jabuticaba foram preparados por extração com solvente etanol, seguida de concentração e secagem. A proantocianidina de semente de uva e o extrato de açaí comercial foram adquiridos da Gamma (São Paulo, SP). Crosslinking das córneas Inicialmente, os olhos de coelho foram submetidos à retirada mecânica do epitélio hidrofóbico. Três olhos foram utilizados no estudo para cada um dos seguintes grupos: 1. Controle: olhos de coelho sem epitélio foram usados como controle. As córneas foram retiradas por trepanação com lâmina específica. 2. Riboflavina/UVA: em três olhos de coelho sem epitélio aplicaram-se gotas de solução de riboflavina 0,1%, em intervalos de 5 min durante 30 min. Após este período, os olhos foram submetidos à radiação ultravioleta de 365 nm de uma fonte OPTO X-Link (São Carlos SP), a uma distância de 4,5 cm por 30 min, mantendo-se a aplicação da riboflavina. As condições da irradiação foram iguais às do tratamento clínico de pacientes (densidade de energia de 5,4 J cm -2 ). Após este procedimento, as córneas foram retiradas por trepanação. 3. Extratos vegetais: amostras de córneas trepanadas foram mergulhadas por 2 horas em solução aquosa a 4 % dos extratos de polpa de açaí, casca de jabuticaba ou em solução aquosa de proantocianidinas e de extrato de açaí comerciais. Análise Térmica As curvas DSC foram obtidas a partir da célula calorimétrica modelo DSC60 (Shimadzu, Kyoto, Japão) de 25 a 100 C, empregando-se razão de aquecimento de 10 C min -1, atmosfera dinâmica de N 2

3 (100 ml min -1 ), cadinhos de Al hermeticamente fechados e massa de amostra de 2-3 mg. Em todos os casos as amostras foram reaquecidas para confirmar a desnaturação. Antes dos ensaios, a célula DSC foi calibrada no eixo de temperatura e fluxo de calor com amostra padrão de In 0 (T fusão = 156,4 C e H fusão = 28,5 J g -1 ). Os valores de temperatura e entalpia de desnaturação foram analisados estatisticamente. Os valores médios e desvio-padrão de cada grupo foram calculados e a comparação dos grupos foi realizada pelo Teste t. Os valores de entalpia em J g -1 foram corrigidos levando em consideração a massa das amostras de córnea descontando a massa de água, determinada em termobalança Shimadzu TGA-51H (atmosfera de N 2 de 50 ml min -1 ; velocidade de aquecimento de 10 C min -1 ; massa inicial de aproximadamente 15 mg). Resultados e discussão As caracterizações térmicas dos grupos de estudo (controle, extrato de açaí 4 %, extrato de casca de jabuticaba 4 % e riboflavina/uva) foram realizadas em triplicata e os valores médios de temperatura e entalpia de desnaturação estão listados na Tabela 1. Os valores de entalpia foram calculados para a massa da córnea seca, determinada por análise termogravimétrica. Tabela 1. Valores de entalpia/j g -1 e temperatura/ºc de desnaturação de córneas de coelho controle e tratadas com agentes promotores de ligações cruzadas: extrato de açaí 4 %, extrato de casca de jabuticaba 4 % e riboflavina/uva. Amostra Controle Açaí Jabuticaba Ribo/UVA T H T H T H T H 1 61,1 27,6 63,4 37,5 58,5 33,9 60,8 33,2 2 59,3 23,5 62,5 38,8 58,6 34,9 62,8 31,7 3 59,0 22,5 62,9 41,9 57,9 33,5 63,7 34,4 Média 59,8 24,6 62,9 39,4 58,3 34,1 62,4 33,1 Desv. P 1,1 2,7 0,5 2,3 0,4 0,7 1,5 1,6 As curvas de DSC (Fig. 1) evidenciaram eventos endotérmicos, que correspondem ao fenômeno físico de desnaturação proteica. Os cadinhos de amostra, após o aquecimento, apresentaram o mesmo valor da massa inicial, indicando que o evento endotérmico pode ser atribuído ao processo de desnaturação. O aumento da temperatura promove a quebra de interações de hidrogênio e de algumas ligações cruzadas intermoleculares, que estabilizam a estrutura nativa, com consequente perda da

4 estrutura proteica tridimensional. Assim, a temperatura de desnaturação depende diretamente do número de ligações cruzadas e do teor de água da estrutura do colágeno. Fig. 1. Curvas DSC de córneas de coelho de abatedouro controle (A) e submetidas ao procedimento de crosslinking com: (B) riboflavina/uva, (C) extrato de casca de jabuticaba, (D) extrato de polpa de açaí. O grupo controle apresentou valores de temperatura e entalpia de desnaturação média, respectivamente, de 59,8 ± 1,1 o C e 24,6 ± 2,7 J g -1. No grupo riboflavina/uva houve um aumento da temperatura e entalpia (p < 0,05) que tiveram valores de 62,4 ± 1,5 o C e 33,1 ± 1,6 J g -1, respectivamente. Um aumento destes dois parâmetros em relação ao grupo controle (p < 0,05) também foi verificado nas córneas tratadas com extrato de açaí 4 % (T = 62,9 ± 0,5 o C; H = 39,4 ± 2,3 J g -1 ). Durante o processo de formação de ligações cruzadas, as fibras de colágeno perdem moléculas de água de hidratação, que são substituídas por ligações cruzadas entre os grupos funcionais de cadeias moleculares adjacentes. A nova estruturação das fibras colágenas proporciona um novo arranjo molecular, com aproximação das fibrilas adjacentes como visualizado por microscopia de fluorescência confocal [4]. Na calorimetria exploratória diferencial este processo é evidenciado pelo aumento da temperatura de desnaturação da córnea [5]. Para as amostras de córnea tratadas com extrato de jabuticaba 4 % houve um aumento no valor da entalpia de desnaturação (H = 34,1 ± 0,7 J g -1 ) em relação ao controle (p < 0,05), que está relacionado ao aumento na energia necessária para a desnaturação da córnea após o crosslinking. Por outro lado, neste grupo não foi observado um aumento na temperatura de desnaturação (p > 0,05).

5 Como os extratos vegetais de açaí e jabuticaba apresentam flavonoides e compostos de outras classes como ácidos fenólicos, uma ou mais moléculas podem ser responsáveis pela formação de ligações cruzadas de colágeno. Bedran-Russo et al. (2011) demonstraram o efeito das proantocianidinas, uma classe de flavonoides, na formação de ligações cruzadas de colágeno em matriz dentária [6]. Assim, analisou-se o efeito das proantocianidinas de semente de uva e de um extrato de açaí comercial, em córneas de coelho. O perfil de desnaturação (Fig. 2) evidenciou um aumento acentuado na temperatura de desnaturação, em relação ao grupo controle. O extrato de açaí comercial apresentou um pico único de desnaturação em 82,7 o C, enquanto a proantocianidina comercial proporcionou o aparecimento de vários eventos em temperaturas acima de 70 o C. A presença de vários picos endotérmicos pode ser um sinal de diferentes níveis ou tipos de ligações cruzadas, ou de diferentes formas de enovelamento da tripla-hélice do colágeno, o que pode ser atribuído à distribuição heterogênea das ligações cruzadas, causada pela difusão lenta dos reagentes no tecido [7]. Fig 2. Curva DSC de córnea de coelho de abatedouro submetida ao procedimento de crosslinking por 2 h com: ( ) solução 4 % de proantocianidina comercial e ( ) solução 4% de extrato de açaí comercial. Conclusão A técnica de DSC permitiu a caracterização do perfil de desnaturação das córneas de coelho de abatedouro e a análise da eficiência de extratos vegetais na formação de ligações cruzadas entre as fibrilas de colágeno. Os resultados mostraram um aumento de entalpia de desnaturação, após o crosslinking. Na continuidade dos estudos será analisado o efeito de outros extratos como barbatimão, jambolão, uva e cacau e também será realizado o fracionamento por cromatografia em coluna dos

6 extratos que apresentarem os melhores resultados, a fim de se identificar os compostos promotores das ligações cruzadas observadas. Agradecimentos Os autores agradecem a Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (Processo 2013/ ). Conflitos de interesse Os autores não possuem nenhum conflito de interesse. Referências 1. Spoerl E, Huhle M, Seiler T. Induction of cross-links in corneal tissue. Exp Eye Res. 1998; 66(1): Spoerl E, Mrochen M, Sliney D, Trokel S, Seiler T. Safety of UVA riboflavin cross-linking of the cornea. Cornea. 2007; 26(4): Han B, Jaurequi J, Tang BW, Nimni ME. Proanthocyanidin: a natural crosslinking reagent for stabilizing collagen matrices. J Biomed Mater Res A. 2003; 65(1): Bottós KM, Dreyfuss JL, Regatieri CV, Lima-Filho AA, Schor P, Nader HB, Chamon W. Immunofluorescence confocal microscopy of porcine corneas following collagen cross-linking treatment with riboflavin and ultraviolet A. J Refract Surg. 2008; 24(7):S Miles CA, Avery NC, Rodin VV, Bailey AJ. The increase in denaturation temperature following cross-linking of collagen is caused by dehydration of the fibres. J Mol Biol. 2005; 346(2): Bedran-Russo AK, Castellan CS, Shinohara MS, Hassan L, Antunes A. Characterization of biomodified dentin matrices for potential preventive and reparative therapies. Acta Biomater. 2011; 7(4): Danilov NA, Ignatieva NYU, Iomdina EM, Semenova AS, Rudenskaya GN, Grokhovskaya TE, Lunin VV. Stabilization of scleral collagen by glycerol aldehyde cross-linking. Biochim Biophys Acta. 2008; 1780(5):