Linhagens celulares. Linhagens celulares e Diferenciação celular

Transcrição

1 Linhagens celulares Quimeras 1 Linhagens celulares e Diferenciação celular A organização dos meristemas apicais mostra, de uma maneira geral, que uma ou várias células iniciais estão na origem dos diferentes sistemas de tecidos. Em algumas raízes podem identificar-se iniciais i i i para o sistema dérmico, para o sistema fundamental e para o sistema vascular; no ápice caulinar a epiderme forma-se de um pequeno conjunto de células na camada superficial - L1. Noutros casos é mais difícil identificar as células iniciais, mas o padrão histológico produzido pelos meristemas sugere que os tecidos têm origem num pequeno grupo de células, algumas das quais serão iniciais. 2 1

2 Linhagens celulares No meristema apical caulinar das Angiospérmicas podem distinguir-se 3 estratos funcionais i (L1, L2, L3) que diferem no tipo de divisão celular e/ou no destino de desenvolvimento. A maioria das células de uma planta adulta formase por divisões nas camadas L3 do ápice caulinar A epiderme deriva exclusivamente da L1. As camadas L2 formam camadas subepidérmicas pluricelulares 3 É sabido que o plano segundo o qual uma célula se divide determina a posição das células filhas no corpo da planta e é esta posição que é primordial na definição do destino das células filhas. Deste modo, a melhor prova para a importância da posição das células advém da observação do destino de células que são deslocadas da sua posição normal e passam a ocupar uma posição noutra camada. Vimos que as divisões celulares nas camadas da túnica são de uma maneira geral anticlinais; contudo, podem ocorrer divisões periclinais de modo que uma derivada passa a estar incluída na camada adjacente na túnica. A derivada assume funções adequadas às células dessa camada. EX: Quimeras periclinais. 4 2

3 Quimeras Wikipédia Os tecidos quiméricos são constituídos por sectores ou camadas de células com composição genética diferente (de modo que é possível identificar estas células e as suas derivadas) Podem criar-se meristemas apicais quiméricos com radiações (Raios X) ou tratamentos com colquicina; algumas regiões ou camadas ficam poliploides como resultado do aumento no nº de cromossomas nas células que se dividiam aquando da aplicação do tratamento. 5 Tipos de Quimeras Periclinais a composição genética de uma ou mais camadas difere da das outras camadas. Sectoriais um conjunto, sector, de células em várias camadas difere geneticamente do resto. Mericlinais só um sector numa camada é afectado. 6 3

4 1. Quimeras periclinais Estas quimeras surgem ou podem ser induzidas nas Angiospérmicas porque o meristema apical caulinar é constituido por camadas concêntricas nas quais as divisões celulares ocorrem segundo um plano Quimeras periclinais (cont) A camada L2 origina parte dos tecidos internos. A camada L1 origina a epiderme; contudo, as derivadas da camada L1 ficam determinadas para originar células epidérmicas porque ocupam uma posição externa, por fora das camadas corticais. 8 4

5 2. Quimeras sectoriais Quando afectam a cor originam Plantas variegadas 9 3. Quimeras mericlinais Plantas variegadas Os sectores brancos ou amarelos resultam de células que não formam cloroplastos (genes mutantes para o desenvolvimento cloroplastidial). Os tecidos brancos surgem de uma região do meristema distinta da dos tecidos verdes. (Deste modo pode-se avaliar a linhagem celular de determinadas d estruturas). t As mutações que afectam o desenvolvimento dos cloroplastos são úteis porque permitem identificar visualmente as células brancas ou verdes. 10 5

6 Plantas variegadas Transparência Quimera periclinal Mutação nas células iniciais apicais da camada L2 da túnica de modo que as derivadas não formam cloroplastos. l Contudo, os cloroplastos l podem desenvolver-se em células provenientes das camadas L1 e L3. Admitindo que maioria das células de clorênquima tem origem na camada L2, as folhas desta quimera deveriam apresentar muito tecido branco; no entanto, não são totalmente brancas, mas variegadas, com porções verdes que só poderão ser provenientes das camadas L1 ou L3. Nas fases iniciais do desenvolvimento das folhas, divisões periclinais ocasionais nas camadas L1 ou L3 estabeleceram clones de células normais que se diferenciaram como células verdes do mesófilo. Pág. Sup. Distribuição clorênquima nas camadas do mesófilo Pág. Inf. 11 Plantas variegadas Pelargonium (Branco sobre verde) Quimera periclinal: L1 normal (origina a epiderme) L2 albina L3 normal ( verde) 12 6

7 Plantas variegadas Hedera helix Importância da posição celular na histogénese A análise das quimeras mostra que a diferenciação de uma célula não depende da sua linhagem; o seu destino é determinado pela posição que ocupa no corpo da planta. 13 Funcionamento do ápice caulinar Equilíbrio entre proliferação e diferenciação celular 7

8 Processos de Desenvolvimento Primeiro, as células têm de adquirir uma nova identidade - foliar em vez de meristemática Leaf primordia Depois a folha tem de adquirir polaridade: pag. superior vs pag. inferior Shoot apical meristem crescimento - padrões regulados de divisão celular e expansão celular e de diferenciação de células especializadas Poethig, R.S. and Sussex,I.M. (1985) The developmental morphology and growth dynamics of the tobacco leaf. Planta 165: ; Reprinted by permission from Macmillan Publishers, Ltd: Runions, J. (2003) Cell of the Month. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4: 603; Nadeau JA, Sack FD (2002) Stomatal Development in Arabidopsis: September 30, The Arabidopsis Book. Rockville, MD: ASPB. O desenvolvimento envolve Informação posicional A informação posicional pode surgir de dispersão de um sinal a partir da fonte (i.e. sinais produzidos pelo meristema ou por certas células diferenciadas). Deslocação directa de um sinal por distribuição assimétrica de proteínas de transporte (e.g. deslocação de auxina e deste modo os gradientes de auxina são regulados pelos transportadores de auxina) destruição selectiva de um sinal ( por ex. por degradação de mrnas por mirna) 8

9 O Desenvolvimento envolve Territórios Um limite difuso formado por um gradiente, pode ser reforçado num limite abrupto por mútuo antagonismo Se um efeito do vermelho é eliminar o amarelo e viceversa, então forma-se e é mantida uma fronteira bem definida Formam-se fronteiras entre o meristema apical caulinar e o primórdio foliar e entre a superfície superior e inferior da folha Shoot apical meristem O formação de um padrão celular na epiderme envolve também produção de sinais inibidores O Desenvolvimento envolve Reguladores - frequentemente factores de transcrição Uma vez estabelecidos os Domínios de desenvolvimento, os factores de transcrição regulam o crescimento e a diferenciação Padrões complementares de expressão de um gene específico do meristema (esquerda) e de um gene específico de primórdio foliar (direita) Padrões de expressão de factores de transcrição que regulam a diferenciação de células oclusivas (em cima) e de tricomas (em baixo) Jackson, D., Veit, B., and Hake, S. (1994) Expression of maize KNOTTED1 related homeobox genes in the shoot apical meristem predicts patterns of morphogenesis in the vegetative shoot. Development 120: ; Tsiantis, M., Schneeberger, R., Golz, J.F., Freeling, M. and Langdale, J.A. (1999). The maize rough sheath2 gene and leaf development programs in monocot and dicot plants. Science. 284: Reproduced with permission; Szymanski, D.B., Jilk, R.A., Pollock, S.M. and Marks, M.D. (1998). Control of GL2 expression in Arabidopsis leaves and trichomes. Development. 125: ; Ohashi-Ito, K. and Bergmann, D.C. (2006). Arabidopsis FAMA controls the final proliferation/differentiation switch during stomatal development. Plant Cell. 18:

10 Expressão de genes reguladores da actividade meristemática Num meristema em actividade expressam-se preferencialmente determinadas classes de genes, genes específicos de meristemas: 1. Genes envolvidos na proliferação celular (mitóticos) genes reguladores do ciclo celular (~ genes de ciclinas, CDKs...) genes necessários à duplicação do DNA genes necessários à formação do fuso mitótico. 2. Genes envolvidos na determinação do destino celular genes equivalentes a homeobox genes e outros reguladores de transcrição ç homeobox sequência de DNA conservada com cerca de 180bp que codifica para um motivo, sequência de a.a., que se liga ao DNA. 3. Genes cuja expressão está limitada a tecidos e órgãos específicos e cujos produtos intervêm na actividade dessas estruturas. Controlo genético da actividade do ápice caulinar Como é que um primórdio foliar se transforma numa folha em vez de fazer parte do meristema? Meristema Primórdio foliar Primórdio foliar Poethig, R.S. and Sussex,I.M. (1985) The developmental morphology and growth dynamics of the tobacco leaf. Planta 165: Figure 3 Copyright (1985) Planta. Reprinted with kind permission of Springer Science+Business Media. 10

11 No meristema as células são indeterminadas As células no meristema são funcionalmente distintas das células no primórdio foliar São indeterminadas e funcionam como população de células-mães (stem-cell) Poethig, R.S. and Sussex,I.M. (1985) The developmental morphology and growth dynamics of the tobacco leaf. Planta 165: Figure 3 Copyright (1985) Planta. Reprinted with kind permission of Springer Science+Business Media. Determinação (destino) celular num meristema activo Como é que um meristema apical caulinar indeterminado origina estruturas, como as folhas, com desenvolvimento determinado? Durante a formação dos primórdios as células do meristema têm de perder a sua identidade como células meristemáticas e assumir identidade de apêndices laterais. A determinação celular envolve, aparentemente, a perda da capacidade de se dividirem e a aquisição de novas funções que permitem às células especializar se. Inactivados genes envolvidos na divisão celular Activados genes intervenientes na diferenciação. Como é que um primórdio se transforma numa folha em vez de fazer parte do meristema? Contudo, no desenvolvimento de um tecido ou órgão a proliferação celular não é interrompida imediatamente; por outro lado, enquanto o tecido ou o órgão ocuparem a sua posição normal a capacidade proliferativa é limitada. 11

12 KNOTTED desenvolvimento indeterminado Certas proteínas (tipo KNOTTED 1) que actuam como factores de transcrição regulando a expressão de outros genes, estão envolvidas na manutenção do estado indeterminado do SAM - meristema apical caulinar. Milho mutante knotted (kn1) mutação dominante que afecta drasticamente a morfologia foliar. Divisões celulares anormais ao longo das nervuras nodosidades. Divisões que ocorrem depois de ter cessado a proliferação celular normal e, adicionalmente, segundo planos anormais. Estas divisões celulares tardias distorcem os tecidos vasculares e formam nodosidades proeminentes na superfície foliar. No mutante a diferenciação celular é relativamente normal excepto nas nodosidades que se assemelham a meristemas contêm células indiferenciadas que continuam a dividir-se depois de as circundantes maturarem e cessarem de se dividir. A mutação kn1 traduz-se numa aquisição de função o fenótipo mutante resulta de uma expressão incorrecta do gene e não na perda da sua expressão (o gene expressa-se na altura e no local errados durante o desenvolvimento). Genes KNOX1 mantêm o meristema num estado indeterminado Classe I de genes KNOX (KNOX1) g ( ) (KNOX significa Knotted-like homeobox) Codificam factores de transcrição Expressam-se no meristema Não se expressam nos primórdios incipientes Ajudam a manter o crescimento indeterminado 12

13 Expressão de KNOTTED Em Zea mays o mrna de KNOTTED (um gene KNOX1) acumula-se no meristema mas não nos primórdios foliares (setas) Jackson, D., Veit, B., and Hake, S. (1994) Expression of maize KNOTTED1 related homeobox genes in the shoot apical meristem predicts patterns of morphogenesis in the vegetative shoot. Development 120: Reproduced with permission. Mutantes SAM (Mutantes na formação do ápice caulinar) I. Mutantes que não mantêm a actividade proliferativa no ápice caulinar O estudo dos mutantes que afectam a formação dos meristemas do ápice caulinar é importante para compreender a actividade do ápice caulinar e o desenvolvimento do caule. shoot meristemless (stm1) durante a embriogénese não edifica um ápice caulinar reconhecível e no estado de plântula não forma folhas verdadeiras. Contudo, estes mutantes formam embriões aparentemente normais com cotilédones e hipocótilo, demonstrando que a edificação do ápice caulinar embrionário não é necessária para a formação daqueles órgãos. De facto, a análise de linhagens celulares de embriões de algodoeiro (Christianson, 1996) permitiu concluir que o SAM tem origem em células com uma linhagem diferente da das células que originam os cotilédones. 13

14 Estudos com stm 2 (mutante no qual o ápice só surge no estado de plântula, forma algumas folhas, mas não inflorescência) permitiram inferir que STM é necessário para manutenção da actividade proliferativa do SAM. A análise da série de alelos (mutações com diversos graus de severidade; stm1, stm2,...) mostra que o ápice em stm apresenta uma depleção das células proliferativas porque é incapaz de impedir a diferenciação das células no centro do ápice caulinar (SAM). Nas mutações severas a diferenciação celular esgota as células proliferativas nos estados iniciais do desenvolvimento do meristema apical caulinar (SAM); Nas mutações suaves a população de células proliferativas no centro do ápice caulinar dura mais tempo, mas por fim extingue-se diferenciando-se. A mutação stm consiste numa deficiência na manutenção do meristema e não na sua formação (embora nas mutações severas pareça não formar SAM). Genes como KN1 e SHOOTMERISTEMLESS (STM) são necessários para manter a identidade das células meristemáticas, mantendo-as num estado indeterminado. Locais de expressão de STM O gene STM foi clonado e usado em estudos de hibridação para detectar os locais da sua expressão durante o desenvolvimento embrionário de plantas silvestres. No estado inicial de embrião globular STM expressa-se em 1-2 células No estado de final de embrião globular a expressão de STM surge numa faixa de células na metade superior do embrião. Nos embriões cordiforme-torpedo o RNA STM surge na região entre os cotilédones onde se forma o SAM. 14

15 Marcadores moleculares iniciais do destino de células (a) Diversos genes como MERISTEM LAYER 1 (AtML1), WUSCHEL (WUS) e membros da família WOX (WUSCHELrelated homeodomain) mostram uma expressão dinâmica i em determinados d domínios, revelando no estado de embrião pré-globular, a emergência de novos destinos celulares em cada round de divisões. (b) No estado de embrião cordiforme reconhecem-se os primórdios da maioria dos tecidos e órgãos. O meristema radicular organiza-se à volta da célula lentiforme, progenitora do centro quiescente, e através das delimitações resultantes da divisão assimétrica do zigoto. O limite entre as camadas superiores e as camadas inferiores (linha azul superior) não coincide exactamente com a delimitação entre hipocótilo e cotilédones porque algumas células das camadas inferiores contribuem para os primórdios dos cotilédones. 29 Simetria radial - Simetria bilateral The breaking of radial symmetry. y (b) The CUP SHAPED COTYLEDON 3 (CUC3) gene is initially expressed throughout the upper tier but becomes constricted to a stripe covering the medial domain of the late globular embryo, presumably as a result of increased auxin flux to the future site of the cotyledon primordia. CUC genes promote expression of the KNOTTED related homeodomain (KNOX) gene SHOOTMERISTEMLESS (STM) in the incipient shoot meristem. STM, in turn, negatively regulates CUC transcription, such that by the late heart stage the expression of CUC genes has become confined to a narrow circle separating the incipient shoot apical meristem (SAM) from the cotyledon primordia (not shown). STM also represses ASYMMETRIC LEAVES 1 (AS1), one of the factors promoting differentiation in lateral organ primordia in the stem cells of the meristem. 15

16 Origem dos domínios central e periférico The origin of central versus peripheral p domains. (a) Class III homeodomain leucine zipper (HD ZIP III) ) genes, such as PHABULOSA (PHB), and KANADI (KAN) genes, such as KAN1, are initially expressed throughout the early embryo, but their expression soon becomes limited to the central (PHB) or peripheral (KAN1) domain. In adult plants, the HD ZIP III and KAN genes show mutually antagonistic interactions. In addition, the mir166 family of micrornas plays a role in delimiting HD ZIP III expression to the central/adaxial domain. KAN activity restricts expression of the auxin transporter PIN1 in the periphery of the hypocotyls, negatively regulating auxin responses. The YABBY (YAB) gene FILAMENTOUS FLOWER (FIL) is first expressed at the late globular stage, marking the abaxial side of cotyledon primordia. Studies of leaf development show that YAB genes primarily promote the outgrowth of leaf blades, perhaps by interpreting the juxtaposition of adaxial and abaxial cell fates at the leaf margin, and that the role of these genes in specifying abaxial fate is secondary. A formação do meristema apical caulinar no embrião depende de uma rede de interacção génica que regula a dorsiventralidade adaxial/abaxial 16

17 A formação do meristema apical caulinar no embrião depende de uma rede de interacção génica que regula a dorsiventralidade adaxial/abaxial (A) Estado de embrião globular de Arabidopsis. Expressão de genes de polaridade adaxial como HDZIPIII define um grupo central, adaxial de células. Expressão de genes de polaridade abaxial como KANADI define o domínio abaxial. O ápice caulinar desenvolve-se numa porção central apical do domínio adaxial (riscado negro). A união dos domínios adaxial e abaxial no primórdio cotiledonar define os locais de crescimento dos futuros cotilédones. (B) Estado de embrião cordiforme após emergência dos cotilédones. (C) Nos embriões com sobre expressão de KANADI ou sem função HD-ZIP III (triplos mutantes phabulosa, phavoluta, revoluta) não há edificação adaxial e não se forma ápice caulinar. (D) Plântulas silvestre (à esq.) e triplo mutante phb phv rev (à dir.). A plântula silvestre tem 2 cotilédones com dorsiventralidade adaxial /abaxial e produziu várias folhas a partir de um ápice caulinar activo. O triplo mutante phb phv rev formou dois cotilédones só com desenvolvimento abaxial, sem dorsiventralidade (a forma achatada lâmina - requer justaposição dos domínios adaxial e abaxial). Não se forma ou não há actividade de ápice caulinar. M.K. Barton (2010) Developmental Biology 341: Fig. 3. Os genes KNOX1 actuam em parte estimulando a síntese de citocinina Mutante stm1 Arabidopsis Mutante stm1 expressando IPT sob o promotor STM STM IPT CK O mutante shootmeristemless1 (stm1) não forma meristema apical caulinar. Este mutante pode ser recuperado pela aplicação de citocinina (CK) ou pela expressão de IPT, gene que codifica para uma enzima da biossíntese da citocinina no SAM. STM é um factor de transcrição que induz a expressão de um gene IPT Adenosine phosphate-isopentenyltransferase (IPT) Reprinted from Yanai, O., et al. (2005). Arabidopsis KNOXI Proteins activate cytokinin biosynthesis. Curr Biol. 15: , with permission from Elsevier. 17

18 Sobre-expressão de genes KNOX1 aumenta estado indeterminado e a complexidade foliar Ganho de Arabidopsis função no Tabaco Milho primórdio foliar KNOX-OE WT KNOX-OE (sobreexpresão) WT KNOX-OE WT KNOX-OE Chuck, G., Lincoln, C., and Hake, S. (1996) KNAT1 induces lobed leaves with ectopic meristems when overexpressed in Arabidopsis. Plant Cell 8: ; Reprinted by permission from Macmillan Publishers, Ltd: Hake, S., and Ori, N. (2002) Plant morphogenesis and KNOX genes. Nat. Genet. 31: As células no primórdio foliar ficam determinadas As células nos primórdios são funcionalmente distintas das do meristema Ficam determinadas Poethig, R.S. and Sussex,I.M. (1985) The developmental morphology and growth dynamics of the tobacco leaf. Planta 165: Figure 3 Copyright (1985) Planta. Reprinted with kind permission of Springer Science+Business Media. 18

19 Genes específicos dos primórdios promovem a diferenciação ARP ARP ARP genes ARP deriva de 3 genes, ASYMMETRIC LEAF1, ROUGH SHEATH2, and PHANTASTICA Os genes ARP codificam factores de transcrição MYB Expressam-se em células dos primórdios foliares Promovem crescimento determinado e diferenciação. MYB (myeloblastosis) family of transcription factors As actividades dos genes ARP e KNOX1 são mutuamente antagonistas As 2 classes de factores de transcrição são mutuamente repressivas e ajudam a estabelecer a identidade do primórdio emergente ARP KNOX1 19

20 O mrna de ASYMMETRIC LEAF1 (AS1) expressa-se nos cotilédones mas não no meristema ARP KNOX1 Reprinted by permission from Macmillan Publishers, Ltd:. Byrne, M.E., Barley, R., Curtis, M., Arroyo, J.M., Dunham, M., Hudson, A., and Martienssen, R.A. (2000) Asymmetric leaves1 mediates leaf patterning and stem cell function in Arabidopsis. Nature 408: Silvestre stm mutant No mutante stm, AS1 expressa-se no meristema (seta) ARP Reprinted by permission from Macmillan Publishers, Ltd:. Byrne, M.E., Barley, R., Curtis, M., Arroyo, J.M., Dunham, M., Hudson, A., and Martienssen, R.A. (2000) Asymmetric leaves1 mediates leaf patterning and stem cell function in Arabidopsis. Nature 408:

21 Perda das funções dos genes ARP assemelha-se à sobre-expressão de KNOX1 Ganho de função no primórdio foliar rs2 WT rs2 WT rs2 KNOX-OE OE Silvestre as1 Reprinted by permission from Macmillan Publishers, Ltd:. Byrne, M.E., Barley, R., Curtis, M., Arroyo, J.M., Dunham, M., Hudson, A., and Martienssen, R.A. (2000) Asymmetric leaves1 mediates leaf patterning and stem cell function in Arabidopsis. Nature 408: Reproduced with permission from Schneeberger, R., Tsiantis, M., Freeling, M., Langdale, J. Development (1998) 125: I. Mutantes que não mantêm a actividade proliferativa no ápice caulinar (Cont.) wuschel (wus) é um mutante de Arabidopsis que não mantem o ápice caulinar (SAM) funcional. Mutantes wus formam ápices deficientes que terminam prematuramente o crescimento após terem formado algumas folhas. Esta deficiência em wus é interpretada como uma depleção de células proliferativas no meristema. Posteriormente, surgem ectopicamente ápices caulinares secundários com primórdios foliares. A formação destes meristemas de segunda ordem, durante o desenvolvimento vegetativo, leva à produção de numerosas folhas em roseta. Durante o desenvolvimento de inflorescências os mutantes wus apresentam um crescimento anormal entrecortado com o aparecimento progressivo de escapos florais de entre conjuntos de folhas. 21

22 Mutantes wuschel Mutantes de Arabidopsis com SAM achatado. Formam flores com poucas peças. A flor de wuschel (dir.) só tem 1 estame e não tem pistilo. A flor silvestre (esq.) apresenta 6 estames e pistilo central. silvestre wuschel A depleção do SAM em wus parece ser o resultado de um forte contributo das células proliferativas para a formação de orgãos. Normalmente WUS deve impedir a diferenciação celular, mantendo a população de células proliferativas. Trabalhos com duplos mutantes stm / wus mostraram que STM é epistático relativamente a WUS. Os mutantes stm e wus têm efeitos semelhantes mas não estão no mesmo trajecto genético. Em Petunia hybrida também se identificaram mutantes que não formam ou Em Petunia hybrida também se identificaram mutantes que não formam ou não matêm o SAM nos embriões. Os mutantes no apical meristem (nam) não ultrapassam o estado de plântula e geralmente não produzem primeiras folhas. Nas plântulas nam o SAM é substituido por um grupo de células grandes e vacuolizadas. NAM foi clonado e não é semelhante a outros genes com funções conhecidas. O gene NAM expressa-se numa região anelar nos limites do meristema apical e dos primórdios; admite-se que NAM intervem na delimitação do SAM. 22

23 II. Mutantes com produção excessiva de células proliferativas no SAM Vimos que durante o crescimento apical do caule há um fluxo contínuo de células da zona periférica do ápice para a zona morfogénica (zona de formação de orgãos). As células que intervêm na formação dos órgãos são substituídas pelas células resultantes de divisões das iniciais na zona periférica. O funcionamento do ápice depende da manutenção desta população de células. Há mutantes de Arabidopsis com deficiência na manutenção equilibrada das populações de células naquelas regiões. clavata 1 mutante com um SAM maior durante o crescimento vegetativo e reprodutivo. Vários alelos meristemas grandes com muitos orgãos em vários verticilos, fasciação proliferação excessiva do ápice caulinar (cl 1 não afecta o ápice radicular, sugerindo que não é uma deficiência no controlo da divisão celular). silvestre clavata 1 Mutantes clavata Contrariamente aos mutantes shoot meristemless e wuschel, os mutantes clavata têm um àpice caulinar maior do que o das plantas silvestres devido a uma proliferação excessiva de células. Imagens de seccionamento óptico de ápices corados com iodeto de propídio para marcar os núcleos. O embrião do mutante clavata1 (clv1-4) tem um SAM maior, com mais células do que o das plantas silvestres. Os mutantes clavata formam peças florais adicionais a partir dos meristemas florais silvestre Clavata 3, c/ pétalas e estames adicionais e um pistilo muito largo 23

24 Os padrões filtácticos são alterados nos mutantes com meristemas sobre-dimensionados Mutantes de Arabidopsis e Zea mays com meristemas sobre-dimensionados Wild-type helicoidal clavata1 aleatória Wild-type alterna abphpyl1 oposta Reproduced with permission from Clark, S.E., Running, M.P., and Meyerowitz, E.M. (1993). CLAVATA1, a regulator of meristem and flower development in Arabidopsis. Development 119: Jackson, D., and Hake, S. (1999). Control of phyllotaxy in maize by the abphyl1 gene. Development 126: Mutante stm (não mantém a actividade proliferativa) STM mantém as células no estado indeterminado i d Mutante wus (depleção de células proliferativas) WUS mantém a população de células proliferativas/indiferenciadas Mutante clv (ápice muito desenvolvido, excesso de células proliferativas) 24

25 Manutenção do SAM Interacção de CLV1, CLV3 e WUS As células que expressam WUS produzem um sinal que confere identidade à zona central - mantém as células no estado indiferenciado - e promove a expressão de CLV3 na túnica do SAM. CLV3 transportada para as camadas mais profundas, liga-se à proteína CLV1 e inibe a expressão de WUS - deste modo as células diferenciam-se -. Esta regulação mantém o tamanho da zona central. Trajecto de sinalização CLAVATA Os produtos dos 3 loci CLAVATA (CLV1, CLV2 e CLV3) codificam componentes de um trajecto de sinalização que regula a expressão de WUSCHEL (WUS codifica um factor de transcrição c/ um homeodomínio) CLV3 expressa-se predominantemente nas células da L1 e L2 da zona central, enquanto que CLV1 se expressa nas células da L3 da zona central. A expressão de WUS está confinada a algumas células da zona central células-mães. Estas células formam um centro de organização que promove a identidade das células-mães através de um sinal para as camadas celulares adjacentes. Este sinal promove também a expressão de CLV3, o qual subsequentemente activa o trajecto de sinalização CLV1, conduzindo à repressão da expressão WUS. Este feedback negativo limita o tamanho da população de células-mães regulando o tamanho do centro organizador. 25

26 Trajecto de sinalização CLAVATA CLV1 codifica um receptor tipo cinase (RLK) de serina/treonina (Ser/Thr) com domínio extracelular com repetições ricas em Leu (LRRs) CLV2 codifica uma proteína tipo receptor (RLP) semelhante a CLV1, mas sem domínio cinase intracelular CVL1 forma de um heterodímero com CLV2 para actividade cínase o complexo requer um péptido codificado por CLV3 CLV3 origina um péptido de 96 aa que é secretado interage com o complexo receptor CLV1/CLV2 Bases moleculares da retroacção CLV-WUS Os receptores CLV1 (cinase) e CLV2 (proteína) formam um heterodímero inactivo (185 kda), na membrana das células da zona central, através de ligações dissulfito (S) entre pares de sisteínas conservadas ladeando repetições ricas em leucina (LRR). CLV1 deve formar também dímeros com outros receptores. Interacções entre o ligando CLV3 e o domínio externo LRR do heterodímero originam autofosforilação de CLV1 e o subsequentemente recrutamento de outras proteínas intracelulares. O complexo activado (450 kda) associa-se com uma GTPase semelhante a Rho (ROP), que deve estar envolvida na transdução de sinal. ROP pode ligar-se ao complexo activado através de uma pequena proteína de ligação. Outro componente do complexo activo é a proteína fosfatase (KAPP) que modulará a actividade CLV1. Não são conhecidos os componentes a jusante no trajecto de sinalização CLV, mas parece que incluem MAPKs. É ambíguo o papel da fosfatase 2C POLTERGEIST (POL) no trajecto de sinalização CLV. Pode actuar como regulador negativo do trajecto de sinalização CLV, ou como regulador positivo de WUS. O sinal inibe a expressão de WUS com consequente diferenciação celular (diminuição da actividade meristemática) na ausência de CLV3 o gene WUS está activo, levando à expressão de CLV3 o reconhecimento de CLV3 conduz à diminuição da expressão de WUS 26

27 Manutenção do SAM Proliferação celular/diferenciação celular STM inibe a expressão de ASYMMETRIC LEAF1 (AS1); Por sua vez AS1 inibe a expressão de KNAT1 e KNAT2. Assim, no meristema a expressão de STM ao inibir a expressão de AS1 possibilita a expressão de KNAT1 e KNAT2. proliferação celular Nos locais de formação dos primórdios foliares desaparece a expressão de STM Nestes locais de iniciação foliar a inibição (sub-regulação) de STM (por diminuição da sensibilidade/receptores a STM), permite a sobre-regulação da expressão de AS1; Deste modo, AS1 expressa-se nos primórdios foliares e bloqueia a expressão de KNAT1 e KNAT2. diferenciação celular M.K. Barton / Developmental Biology 341 (2010) O controlo da actividade das célulasmães (estaminais) no SAM depende de sinais provenientes do meristema bem como de sinais das folhas. A actividade das células-mães que especificam o tamanho da zona central - é reprimida pelo péptido CLAVATA3. CLAVATA3 limita o tamanho da zona de expressão de WUSCHEL (limitando talvez a transcrição de WUSCHEL). WUSCHEL promove a atividade das células-mães e regula positivamente a atividade CLAVATA3, gerando assim um feedback que estabiliza a atividade das células-mães na planta. WUSCHEL determina uma região de elevada sensibilidade à citoquinina. Por sua vez, os níveis WUSCHEL, são aumentados pela citocinina. A biossíntese de Citocinina é aumentada pela expressão de genes KNOX no meristema, por sua a expressão destes é aumentada por níveis elevados de citocininas. Note-se que as regiões de elevada atividade de auxina (primórdios foliares) e elevada atividade de citocinina (meristema central) estão claramente separadas no meristema. As fronteiras (roxo escuro) entre meristema e primórdios foliares adjacentes ficam estabelecidas num determinado momento entre os estados P0 e P1 e são marcadas pela expressão dos genes CUPSHAPED COTYLEDON e LATERAL SUPRESSOR (LAS). À medida que as folhas maturam, as fronteiras continuam a expressar estes genes e adicionam outros reguladores, como BLADE-ON PETIOLE (BOP, roxo claro). YABBY expressa-se no domínio abaxial da folha. Actua não autonomamente, através do produto gene LATERAL SUPPRESSOR, para promover o destino adaxial e promover a atividade das célulasmães no meristema. À medida que LATERAL SUPRESSOR é expresso na fronteira adaxial da folha e o meristema, o efeito de YABBY sobre a expressão de LATERAL SUPRESSOR poderia ser através do papel de YABBY na promoção do desenvolvimento adaxial. YABBY é mostrado a actuar numa folha relativamente madura, mas poderia actuar numa folha mais próxima do meristema, por exemplo, numa folha na fase P1. Uma vez a folha separada fisicamente do meristema BOP expressa-se na fronteira folha- meristema; contudo, também afecta a atividade das células-mães no meristema. Ainda, em mais um caso de sinalização folha - meristema, produtos génicos de SQUAMOSA BINCING PROTEIN-LIKE (SPL) sintetizados na folha diminuem a taxa de produção de folhas dentro do meristema. 27