ELIANA DE ALMEIDA MIRA DE BONA

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1 UNIVERSIDADE ESTADUAL DO OESTE DO PARANÁ CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU EM CONSERVAÇÃO E MANEJO DE RECURSOS NATURAIS NÍVEL MESTRADO ELIANA DE ALMEIDA MIRA DE BONA COMPARAÇÃO DE MÉTODOS DE AVALIAÇÃO E ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE EXTRATOS VEGETAIS SOBRE SOROVARES DE Salmonella spp. DE ORIGEM AVÍCOLA CASCAVEL-PR Junho/2012

2 ELIANA DE ALMEIDA MIRA DE BONA COMPARAÇÃO DE MÉTODOS DE AVALIAÇÃO E ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE EXTRATOS VEGETAIS SOBRE SOROVARES DE Salmonella spp. DE ORIGEM AVÍCOLA Dissertação apresentada ao Programa de Pósgraduação Stricto Sensu em Conservação e Manejo de Recursos Naturais Nível Mestrado, do Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, da Universidade estadual do Oeste do Paraná, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Conservação e Manejo de Recursos Naturais Área de Concentração: Conservação e Manejo de Recursos Naturais CASCAVEL-PR Junho/2012 iii

3 Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP) Biblioteca Central do Campus de Cascavel Unioeste Ficha catalográfica elaborada por Jeanine da Silva Barros CRB-9/1362 D339c De Bona, Eliana de Almeida Mira Comparação de métodos de avaliação e atividade antimicrobiana de extratos vegetais sobre sorovares de Salmonella spp. de origem avícola. / Eliana de Almeida Mira De Bona Cascavel, PR: UNIOESTE, p. Orientadora: Profa. Dra. Fabiana Gisele da Silva Pinto Dissertação (Mestrado) Universidade Estadual do Oeste do Paraná. Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Conservação e Manejo de Recursos Naturais, Centro de Ciências Biológicas e da Saúde. Bibliografia. 1. Extratos vegetais Atividade antimicrobiana. 2. Salmonella spp. (Avicultura). I. Universidade Estadual do Oeste do Paraná. II. Título. CDD 21.ed. 576 iii

4 FOLHA DE APROVAÇÃO ii iv

5 Dedicatória Aos meus familiares e ao meu esposo, por todo amor, dedicação, companheirismo e constante incentivo, com gratidão e amor, dedico. vv

6 AGRADECIMENTOS A Deus por iluminar meu caminho e permitir que eu realizasse essa conquista. A minha mãe pela fé, carinho, amor e incentivo, serei eternamente grata. Ao meu esposo Vanderlei pela paciência, compreensão, incentivo e amor dedicado. A minha irmã Cristiane pelo amor e incentivo. Aos meu tios Lauri e Luci, pelo amor, incentivo e disponibilidade durante a minha trajetória. A minha orientadora Professora Fabiana Gisele da Silva Pinto por sua disponibilidade, empenho, apoio e confiança. Serei eternamente grata por oportunizar esse trabalho. Ao Professor Luis Francisco Angeli Alves, pelo apoio e sugestões recebidos na elaboração deste trabalho. A Professora Tereza Cristina Marinho Jorge, por ceder o Laboratório de Farmacognosia e apoiar o desenvolvimento desta pesquisa. A professora Lívia Godinho Temponi pela disponibilização do Herbário (UNOP) e identificação de todas as plantas. Aos colegas do laboratório de Biotecnologia Agrícola, pela amizade e pelo apoio durante esses anos. A Universidade Estadual do Oeste do Paraná, pela oportunidade de realização desta pesquisa. A CAPES pela disponibilidade da bolsa de mestrado. Enfim, obrigado a todos, mesmo àqueles que não tenham sido citados, mas que de alguma forma colaboraram para o desenvolvimento desta pesquisa. viv

7 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO...p.1 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...p Cadeia avícola no Brasil...p Salmonelose aviária...p Uso de antimicrobianos sintéticos, resistência antimicrobiana e a contaminação ambiental...p Antimicrobianos alternativos...p Métodos para avaliação da atividade antimicrobiana...p.9 3. CAPÍTULO 1: Incidência e resistência antimicrobiana de sorovares de Salmonella de aviários do oeste do Paraná...p CAPÍTULO 2: Potencial Antimicrobiano de Extratos de Plantas Nativas Brasileiras sobre Sorovares de Salmonella de Origem Aviária...p CAPÍTULO 3: Comparação de Métodos para determinação da Atividade Antimicrobiana de Extratos Vegetais Aquosos e Etanólicos...p REFERÊNCIAS...p ANEXOS...p.64 Anexo 1 Nomas revista Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia...p.65 Anexo 2 Nomas Revista Arquivos do Instituto Biológico...p.70 vii v

8 RESUMO: Parte deste estudo foi realizado para determinar a incidência e resistência antimicrobiana de sorovares de Salmonella isolados a partir de fezes, ração e camas em aviários de frangos de corte na região oeste do Paraná entre os anos de 2003 a Foram confirmadas 118 amostras de Salmonella spp., pertencentes a 38 diferentes sorovares sendo os mais prevalentes: S. Enteritidis, S. Heidelberg e S. Typhimurium. Todos os sorovares de Salmonella spp. também foram examinados quanto a resistência a 13 antimicrobianos segundo o método de difusão em disco, verificando-se 82 amostras resistentes em 26 diferentes padrões. Em maior incidência, encontraram-se os multirresistentes a estreptomicina, ácido nalidíxico e tetraciclina. Em outro estudo, voltado à pesquisa de plantas como fonte natural e alternativa de substâncias antimicrobianas, realizou-se testes in vitro para testar diferentes métodos de ensaio para avaliar a atividade antimicrobiana de extratos vegetais. As metodologias empregadas para a determinação da atividade antimicrobiana de extratos vegetais da família Myrtacea foram os métodos de microdiluição em caldo e de difusão em ágar por poço e por disco, sendo o método de microdiluição em caldo considerado o melhor por ter apresentado maior reprodutibilidade, relação linear entre a concentração do extrato e a atividade inibitória e maior economia de materiais e espaço. Como última etapa da pesquisa utilizou-se, portanto, o método de microdiluição em caldo seguido de repique em placas de ágar, para verificar in vitro a inibição bacteriana e a inativação bacteriana determinando-se a Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida Mínima (CBM) de diferentes extratos, aquosos ou etanólicos de folhas de 6 plantas nativas encontradas na região Oeste do Paraná, sendo elas: Maytenus aquifolium (espinheira-santa), Myrciaria cauliflora (jabuticabeira), Ocotea spixiana (canela-branca), Psidium guajava (goiabeira), e Ricinus communis (mamona) e Schinus molle (aroeira-branca) frente a 36 Salmonella spp., de origem aviária e S. Typhimurium ATCC Todas as plantas apresentaram alguma atividade seletiva sobre Salmonella spp., e os extratos etanólicos apresentaram maior atividade antimicrobiana comparado aos extratos aquosos. Os extratos etanólicos de Myrciaria cauliflora (Mart.) O. Berg e Psidium guajava L., apresentaram os melhores resultados. As CIMs variaram entre 1, mg.ml -1 e a CBM entre 3, mg.ml -1. Palavras-chave: Salmonella spp., frangos de corte, resistência/multiresistência, Atividade inibitória, métodos, plantas nativas. viii v

9 1 1. Introdução Devido à intensiva demanda de produção na avicultura e apesar do investimento existente em tecnologias que permitiram o melhoramento da qualidade da carne de frango, esta ainda é passível de contaminação bacteriana, especialmente por micro-organismos do gênero Salmonella, uma vez que esse gênero faz parte da microbiota desses animais. A ocorrência e a quantidade de Salmonella presente na carne variam de acordo com as condições de manejo durante a criação e com os cuidados higiênicos nas operações de abate dos animais e posterior manipulação das carcaças (CARVALHO & CORTEZ, 2005). A introdução de antimicrobianos para tratar infecções bacterianas há quase 50 anos levou a uma melhoria significativa na produção animal. Porém, com a busca constante por um método eficiente para combater a salmonelose e outras doenças de origem avícola, o uso indiscriminado de antimicrobianos gerou outro problema: a seleção de bactérias resistentes (BUTAYE et al., 2003). Com isso, muitas agroindústrias acatam a proibição ao uso de antimicrobianos que vigoram em países como na União Européia. O Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA, 2004) proibiu a utilização de diversos antimicrobianos visando manter a exportação de frango aos países da UE. O surgimento de micro-organismos resistentes a antimicrobianos demonstra que o tratamento de infecções bacterianas não pode se basear no uso de antimicrobianos sem alguma reflexão crítica. Especial atenção tem sido dada ao uso de antimicrobianos em animais, incluindo promotores de crescimento, porque estes antimicrobianos podem contribuir para os problemas com a resistência aos antimicrobianos em seres humanos bem como, a presença de resíduos destes na carne e derivados que podem causar problemas ambientais e à saúde (FULLER, 1989). Isto tem enfatizado a necessidade de introduzir outros métodos de prevenção e tratamento de doenças em aves. Apesar do empenho da ciência nas buscas de novas formas de controle microbiano, a situação é preocupante principalmente nos países em desenvolvimento, nos quais poucos recursos são empregados no monitoramento de ações sobre o uso racional de antimicrobianos. Dentre os métodos seguros e saudáveis de produção agrícola/agropecuária, está o desenvolvimento de pesquisas por produtos sanitários alternativos, baseados em princípios ativos

10 2 vegetais, plantas e minerais no controle de pragas e doenças (DUARTE, 2004; UTIYAMA, 2004). O uso de preparações a base de plantas é antigo e tem se intensificado nas últimas décadas devido a resultados negativos na medicina convencional, prejuízo causado pelo uso abusivo de medicamentos de origem sintética, falta de acesso aos medicamentos por grande parte da população, pelo crescimento da consciência ecológica e pela crença popular de que o natural é inofensivo (RATES, 2001). No Brasil, foi observado que sorovares de S. enterica, isolados de carcaças de aves, apresentaram variações significativas de suscetibilidade aos extratos vegetais de orégano e tomilho (SANTÚRIO et al., 2007). Já pôde ser evidenciado que algumas plantas produzem, em seu metabolismo secundário, substâncias com a capacidade de inibir a atividade de bactérias e outros micro-organismos (DUARTE et al., 2004). Baseados neste contexto e, tendo em vista a crescente demanda de consumo de carne de frango, a alta incidência de surtos relacionados à salmonelose e a preocupação com a resistência a antimicrobianos, torna-se de grande valia a realização deste estudo para a avaliação da atividade antimicrobiana dos extratos vegetais sobre Salmonella, visando garantir a qualidade de vida da população que consome a carne de frango, bem como a exigência do mercado externo.

11 3 2. Revisão Bibliográfica 2.1. Cadeia avícola no Brasil O consumo de carne de aves tem aumentado notoriamente em todo o mundo, sendo que em 2010 a produção de frango no Brasil foi de 11,36 milhões de toneladas alcançando o ranking das exportações com 3,81 milhões de toneladas exportadas no mesmo ano. O Paraná foi o estado brasileiro com a maior produção de aves em 2010 responsável por 27,8% do abate de frangos e responsável por 26,2% da exportação de frangos do Brasil no mesmo ano equivalente a mais de 1 milhão de toneladas de carne de frango exportada obtendo a liderança nas exportações a partir de julho de 2011 o que torna a avicultura o segundo item mais forte nas exportações do Paraná, ficando atrás somente do complexo soja. Em muitas cidades a produção de frangos é a principal atividade econômica. Essa posição demonstra o papel cada vez mais fundamental do setor quando inserido na economia do estado (UBABEF, 2011; SINDIAVIAPAR, 2011). No Brasil, a avicultura emprega mais de 4,5 milhões de pessoas, direta e indiretamente, com dezenas de milhares de produtores integrados, centenas de empresas beneficiadoras e dezenas de empresas exportadoras. A importância social da avicultura no Brasil se verifica também pela presença maciça no interior do país, principalmente nos estados do Sul e Sudeste. A avicultura possui um papel determinante à economia do Paraná: gera empregos, renda e cria postos de trabalho por todas as áreas do estado, desenvolvendo as regiões do interior e mantendo o trabalhador no campo (SINDIAVIAPAR, 2011). Fatores como qualidade, sanidade e preço contribuíram para aperfeiçoar a produtividade no setor avícola. O Brasil buscou modernização e empregou instrumentos como o manejo adequado do aviário, sanidade, alimentação balanceada, melhoramento genético e produção integrada. A parceria entre indústria e avicultores também contribuiu para a excelência técnica em todas as etapas da cadeia produtiva, reduzindo custos na produção e melhorando a qualidade, que atende às demandas de todo o mundo.

12 Salmonelose aviária Dentre as bactérias comumente encontradas em carne de frango, as do gênero Salmonella spp., apresentam maior importância na avicultura por representarem risco de contaminação alimentar em seres humanos, uma vez que geralmente as pessoas são infectadas pelo consumo ou contato com alimentos contaminados (DAI PRA, 2009). Para que os produtos de origem alimentar sejam considerados aptos para consumo humano, a resolução da RDC nº 12, de 2 de janeiro de 2001 estabelece como padrão de qualidade de alimentos a ausência de Salmonella sp e Listeria monocytogenes em 25g de alimentos (BRASIL, 2001). Salmonella, porém, faz parte da flora normal do intestino das aves; assim, durante o abate, quando não são obedecidos os critérios higiênicos sanitários, esses micro-organismos podem contaminar a carcaça e outras partes com relativa facilidade (SILVA et al., 2001). O termo salmonelose é utilizado para definir um grupo de doenças causadas por qualquer membro do gênero Salmonella que é formado por mais de 2500 sorovares de Salmonella capazes de infectar o homem e uma grande variedade de espécies animais (AARESTRUP et al., 2003). No Brasil, dados epidemiológicos da ANVISA sobre surtos ocorridos entre os anos de 1999 a 2008, relataram 1275 casos de surtos causados por Salmonella spp., sendo Salmonella Enteritidis o sorovar mais isolado. No Paraná entre 1999 e 2008, dos 399 municípios que compõe o estado, 52 (13,0%) notificaram surtos de salmonelose. Os alimentos mais freqüentes nos surtos de intoxicação alimentar são os ovos crus ou mal cozidos, alimentos mistos e carnes vermelhas (BRASIL, 2008). Salmonella é um gênero da família Enterobacteriaceae, definido como bastonetes Gram negativos não esporogênicos, anaeróbios facultativos e oxidase negativos. De acordo com a decisão do Comitê Internacional sobre a Sistemática de Procariotos, o gênero Salmonella é composto por duas espécies, Salmonella bongori e enterica. Este último inclui seis subespécies, arizonae, diarizonae, enterica, houtenae, indica e salamae (TINDALL et al., 2005). Nas aves, Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Pullorum (Pulorose) e Salmonella Gallinarum (Tifo aviário) determinam doença clínica

13 5 característica que pode produzir grandes prejuízos à avicultura. Estas duas salmonelas, assim como Salmonella Typhi e Salmonella Paratyphi em humanos, são hospedeiro-específicas. Já a Salmonella Typhimurium e Salmonella Enteritidis são exceções, como não são espécies específicas podem colonizar o trato gastrointestinal de diferentes espécies. Nas aves, as salmonelas persistem no intestino, sem sinais clínicos, invadem a corrente sanguínea e chegam a diferentes órgãos internos, favorecendo a contaminação de carcaças e ovos (TURNER et al., 1998). O monitoramento e observação da granja são extremamente importantes para a prevenção da Salmonella aviária. De acordo com o Programa Nacional de Sanidade Avícola (PNSA) do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, instrução normativa/das nº 3 de 9/01/2002, toda granja de reprodutoras de aves deve ser sorológica e bacteriologicamente monitorada para detecção dos sorovares da doença. Amostra de órgãos, sangue, suabe cloacal, fezes e mecônio devem ser submetidos a exame laboratorial periodicamente para tentativa de isolamento durante o crescimento e durante a produção das aves (BRASIL, 1994). Dados epidemiológicos da ANVISA relatam que a S. Enteritidis é o sorovar com maior taxa de prevalência nos surtos de salmonelose no Brasil nos últimos anos (BRASIL, 2008), sendo o mesmo reportado pelo Centers for Disease Control and Prevention (CDC) em Atlanta e pelo Centro de Referência Robert Koch Institute na Alemanha (RABSCH et al., 2001). Ressalta-se que a salmonelose é uma doença de monitoramento e vigilância oficial dentro do Programa Nacional de Sanidade Avícola (PNSA) da Portaria Ministerial nº 193/1994 que preconiza o controle para Salmonella Gallinarum, Salmonella Pullorum, Salmonella Enteritidis e Salmonella Typhimurium (BRASIL, 1994). A prevenção da salmonelose continua sendo pauta em vários debates do setor avícola. O foco da prevenção da doença por parte dos responsáveis pela criação e abate de aves é recorrente devido ao aumento constante do consumo de carne de frango no Brasil e no mundo. Por este motivo, a preocupação com a salmonelose existe mesmo que bactérias como a S. Pullorum e a S. Galinarum, específicas de aves, estejam controladas. Outros sorovares, inclusive os que têm

14 6 envolvimento com saúde pública, devem ser constantemente monitorados e controlados. Técnicos de diferentes países concordam que é praticamente impossível erradicar a Salmonella dos plantéis e que se faz necessário uso de novas tecnologias e adoção de medidas de controle, para combater o problema (SINDIAVIAPAR, 2011) Uso de antimicrobianos sintéticos, resistência antimicrobiana e a contaminação ambiental O tratamento da salmonelose em aves é convencionalmente realizado por antibióticoterapia. A produção de aves convencionais atualmente está pautada na intensa utilização de produtos sanitários, antimicrobianos, probióticos, vacinas e diversos produtos químicos sintéticos. Os promotores de crescimento, responsáveis pelo rápido desenvolvimento de frangos de corte, agem por seu efeito antibacteriano, provavelmente pelas seguintes hipóteses: os nutrientes são protegidos da destruição de bactérias, a absorção de nutrientes é melhorada por causa de um afinamento da barreira intestinal, os antimicrobianos diminuem a produção de toxinas pelas bactérias intestinais, ou ainda, pode haver redução na incidência de infecções subclínicas intestinal (BUTAYE et al., 2003). Entretanto o uso intensivo e inadequado provoca o desenvolvimento de população bacteriana resistentes a diversos princípios ativos, bem como, causam diversos problemas ambientais e à saúde dos produtores e consumidores pela presença de resíduos destes na carne e derivados (FULLER, 1989; BILA & DEZOTTI, 2003; SAKARIDIS et al., 2011). Além da utilização de antimicrobianos na nutrição animal, uma série de práticas humanas tem levado as bactérias à resistência a antimicrobianos, como o uso extensivo, errôneo e indiscriminado de antimicrobianos pelos médicos; o uso de antimicrobianos em pacientes imunodeprimidos para prevenir infecções; a dificuldade dos pacientes em seguir o tratamento prescrito; o transporte de bactérias resistentes a novas áreas em função das viagens no mundo (TORTORA et al., 2000). Elevadas taxas de resistência aos antimicrobianos são registradas em estudos realizados no mundo todo e na medicina humana e veterinária (MANIE et

15 7 al., 1997; MOTA et al., 2005). Para Salmonella, também, há registros de alta resistência aos princípios antimicrobianos normalmente utilizados em avicultura (CORTEZ et al., 2006; RIBEIRO et al., 2008). Genes resistentes, adquiridos por micro-organismos, podem ser facilmente transferidos para organismos de diferentes ecossistemas, sendo levados da água para o solo e vice-versa (BILA & DEZOTTI, 2003). No meio aquático, o contato físico entre as bactérias possibilita alta freqüência de troca de plasmídeos codificadores de resistência aos antimicrobianos (RHODES et al., 2000). A resistência a antimicrobianos pode ocorrer pela inativação do composto por enzimas desintoxicantes, redução da permeabilidade celular ou expulsão da droga por bombas específicas ou não-específicas e modificação dos alvos dos antimicrobianos. Além disso, as bactérias podem adquirir um fenótipo de resistência via reguladores transcricionais globais ou específicos. Estes mecanismos podem ser induzidos pelo antibiótico em si ou por sinais ambientais (BARBOSA & LEVY, 2000; BOERLIN & REID-SMITH, 2008). Além do fator de resistência, Barbosa e Levy (2000) mencionam que resíduos de antimicrobianos excretados nas fezes em uma área particular podem ter impacto sobre os ecossistemas geograficamente distantes, bem como eles podem ser facilmente dispersos em solo e águas através de esgoto, estrume, etc. Ressalta-se a importância de compreender o mecanismo de resistência microbiana, bem como na busca de novos compostos antimicrobianos, sintéticos ou naturais, no intuito de controlar a ação de micro-organismos patogênicos (CASTRO et al., 2002) Antimicrobianos alternativos Os extratos vegetais podem ser uma importante alternativa em substituição aos antimicrobianos promotores de crescimento nas rações. Estudos adicionais são fundamentais para o rápido desenvolvimento desta questão, de significativo impacto sobre a avicultura brasileira (SANTURIO et al., 2007). A forma de ação dos princípios ativos de extratos vegetais sobre as células bacterianas são muito similares ao dos antimicrobianos convencionais. Pesquisas já comprovaram que algumas plantas produzem em seu metabolismo secundário,

16 8 substâncias com a capacidade de inibir a atividade de bactérias e de outros micro-organismos (DUARTE, 2004). A diversidade química associada à diversidade biológica encontrada em ecossistemas terrestres e aquáticos é um importante aspecto a ser considerado em processos e diretrizes de desenvolvimento de novos biofármacos. Como característica geral, os compostos vegetais mostram um padrão de ocorrência restrito a alguns grupos taxonômicos, não sendo considerados essenciais ao metabolismo basal da célula vegetal, donde surge a denominação metabólitos secundários (MARASCHIN e VERPOORTE, 1999). Segundo Ferronatto et al. (2007), deve-se enfatizar a busca por antimicrobianos de origem vegetal, uma vez que o Brasil apresenta a maior biodiversidade do planeta e que muitas plantas já vêm sendo vastamente testadas e utilizadas há dezenas de anos com as mais diversas finalidades por populações do mundo inteiro. O cultivo e produção de extratos por pequenos produtores é uma alternativa agroecológica, baseada em um cultivo sustentável, que respeita o meio ambiente, em oposição ao modelo agrícola convencional, centrado na exploração e uso de agroquímicos. A Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos, aprovada por meio do Decreto Nº 5.813, de 22 de junho de 2006, estabelece diretrizes para o desenvolvimento de ações voltadas ao desenvolvimento de tecnologias e inovações, ao fortalecimento das cadeias e dos arranjos produtivos, ao uso sustentável da biodiversidade brasileira entre outras providências (BRASIL, 2007). Além dos extratos desempenharem um importante papel, garantindo a sobrevivência das espécies no ecossistema, metabólitos secundários são utilizados em escala industrial para a produção de inseticidas, corantes, flavorizantes, aromatizantes e medicamentos (MARASCHIN e VERPOORTE, 1999). Entre os trabalhos já realizados sobre a atividade inibitória de extratos vegetais frente a Salmonella spp., encontra-se o realizado por Wiest et al. (2009), que constataram entre 86 plantas, em extratos aquosos ou alcoólicos/hidroalcoólicos, 58% apresentaram alguma inibição ou inativação sobre Salmonella sp.

17 9 Com esta perspectiva, é fundamental avaliar, a partir de técnicas microbiológicas modernas e padronizadas, a atividade de extratos vegetais sobre diferentes sorovares de Salmonella. 2.5 Métodos para avaliação da atividade antimicrobiana Atualmente, existem vários métodos para avaliar a atividade antibacteriana e antifúngica dos extratos vegetais, sendo que os mais conhecidos incluem: método de difusão em ágar, método de macrodiluição e microdiluição que são realizados em caldo (OSTROSKY et al., 2008). Os métodos de diluição em caldo ou difusão em ágar são técnicas usualmente aceitas internacionalmente para medir quantitativamente a atividade in vitro de um agente antimicrobiano contra um determinado isolado bacteriano, sendo estas técnicas padronizadas para o uso de antimicrobianos comerciais (CLSI, 2003; CLSI, 2006). Pesquisas realizadas anteriormente por diversos autores com o objetivo de avaliar métodos de avaliação de extratos vegetais, sugerem uso de diferentes metodologias para que os resultados possam ser comparados com estudos de diferentes grupos de pesquisas (ZGODA & PORTER, 2001; OSTROSKY et al., 2008; OTHMAN et al., 2011). Contudo, ainda não existe uma padronização para a utilização das técnicas.

18 CAPÍTULO 1: Incidência e resistência antimicrobiana de sorovares de Salmonella de aviários do oeste do Paraná Revista Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia Incidência e resistência antimicrobiana de sorovares de Salmonella de aviários do oeste do Paraná Incidence and antimicrobial resistance of Salmonella serovars of aviaries the West of Parana RESUMO Este estudo foi realizado para determinar a incidência e resistência antimicrobiana de sorovares de Salmonella isolados a partir de fezes, ração e camas em aviários de frangos de corte na região oeste do Paraná entre os anos de 2003 a Foram confirmadas 118 amostras de Salmonella spp., pertencentes a 38 diferentes sorovares sendo os mais prevalentes: S. Enteritidis (16,1%), S. Heidelberg (5,9%), S. Typhimurium (5,9%), S. Hadar (5,0%), S. Albany (4,2%), S. Enterica (4,2%) e S. Saintpaul (4,2%). Todos os sorovares de Salmonella spp. também foram examinados quanto a resistência a 13 antimicrobianos segundo o método de difusão em disco. Trinta e seis amostras (30,5 %) foram suscetíveis a todos os antimicrobianos e entre as 82 amostras resistentes foram verificados 26 diferentes padrões. Em maior incidência, encontraram-se os multirresistentes a estreptomicina, ácido nalidíxico e tetraciclina (20,7%), a ácido nalidíxico (13,4%) e a ácido nalidíxico e tetraciclina (11,0%). Os resultados deste estudo demonstram uma elevada incidência de Salmonella spp. em ambiente de criação de frangos e uma grande porcentagem de amostras resistentes aos antimicrobianos convencionais. PALAVRAS-CHAVE: Salmonella spp., incidência, frangos de corte, resistência/multiresistência, Paraná ABSTRACT This study was conducted to determine the prevalence and antimicrobial resistance of Salmonella serovars isolated from feces, feed and bedding in broiler chicken farms in western Paraná between the years 2003 to There were 118 confirmed Salmonella spp., belonging to 38 different serovars were the most prevalent: S. Enteritidis (16,1%), S. Heidelberg (5,9%), S. Typhimurium (5,9%), S. Hadar (5,0%), S. Albany (4,2%), S. Enterica (4,2%) and S. Saintpaul (4,2%). All serovars of Salmonella spp. were also examined for resistance to 13 antimicrobials according to the disk diffusion method. Thirty-six samples

19 (30.5%) were susceptible to all antimicrobials and between the 82 strains resistant 26 different patterns were observed. In the highest prevalence, we found the multiresistant streptomycin, nalidixic acid and tetracycline (20.7%), nalidixic acid (13.4%) and nalidixic acid and tetracycline (11.0%). The results of this study demonstrate high prevalence of Salmonella spp. environment of chicken and a large percentage of strains resistant to conventional antibiotics. KEY-WORDS: Salmonella spp., incidence, Resistance/multidrug resistance, broilers, Parana. INTRODUÇÃO O Paraná, no ano de 2010, foi responsável por 27 % do abate e 26 % da exportação de frangos no Brasil alcançando destaque no setor (UBABEF, 2011). A qualidade, sanidade e preço foram os principais fatores que contribuíram para melhorar a produtividade. Contudo, as aves ainda são passíveis de contaminação por patógenos, como pelas bactérias do gênero Salmonella, que são responsáveis por prejuízos à indústria avícola (SINDIAVIPAR, 2011). Segundo a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), entre os anos de 1999 a 2008, 42,9% dos surtos de intoxicações alimentares ocorridos no Brasil atribui-se a salmonelose, sendo notificada no Paraná em 13% dos municípios. Os ovos, carnes e derivados são os alimentos mais freqüentes relacionados aos surtos (Brasil, 2008). Técnicos de diferentes países concordam que é praticamente impossível erradicar a Salmonella dos plantéis e controlar a sua transmissão em virtude de sua capacidade de colonizar o trato digestório dos animais e por apresentar grande número de reservatórios envolvidos na excreção fecal e contaminação ambiental. Todos os sorovares, inclusive os que têm envolvimento com saúde pública, devem ser constantemente monitorados e controlados (Andreatti-Filho et al., 2009; SINDIAVIPAR, 2011). O uso de antimicrobianos contribuiu para melhorar a sanidade avícola e reduzir o tempo de criação, porém seu uso indiscriminado proporcionou a seleção e incidência de diferentes sorovares de Salmonella e outros micro-organismos resistentes a antimicrobianos, reduzindo sua efetividade em casos clínicos além de contribuir para a presença de resíduos destes na carne e derivados (Bila e Dezotti, 2003; Sakaridis et al., 2011). Em diversas partes do mundo, foram isolados sorovares de Salmonella de origem aviária, com resistência a distintos grupos de antimicrobianos. Nesse sentido, destacam-se estudos em que foram encontrados isolados de Salmonella spp. com altas taxas de resistência, no Brasil (Cardoso et al., 2006; Ribeiro et al., 2006; Duarte et al., 2009; Souza et al., 2011), assim como

20 na Espanha (Carramiñana et al., 2004), Holanda (Hasman et al., 2005), Lituânia (Ruzauskas et al., 2005), Nigéria (Okoli et al., 2006), Estados Unidos (Alali et al., 2010) e Grécia (Sakaridis et al., 2011). Estes estudos afirmam que as salmonelas de origem aviária são resistentes a uma grande gama dos antimicrobianos mais comumente usados e confirmam que as aves são um importante reservatório de Salmonella multirresistentes. Além disso, tem-se observado também nas últimas décadas a propagação da resistência através de toda a população bacteriana e nichos ecológicos (Boerlin e Reid-Smith, 2008). Assim, este estudo busca ampliar o conhecimento sobre a incidência e a resistência antimicrobiana de Salmonella isoladas de granjas de frango de corte no Paraná, visto que não há informações sobre incidência de Salmonella no Estado, em aviários de frango de corte, que é fonte de contaminação e origem dos sorovares envolvidos. O objetivo do trabalho foi determinar a incidência e resistência antimicrobiana de sorovares de Salmonella isolados a partir de aviários de criação de frangos de corte no Oeste do Paraná dos últimos oito anos. MATERIAL E MÉTODOS Foram analisadas 118 amostras de Salmonella isoladas de fezes (suabe de cloaca), cama (suabe de arrasto) e rações (farinhas/insumos de rações) de frango de corte entre 2003 e 2010, provenientes de diferentes aviários da região Oeste do Paraná, Brasil, fornecidas pelo Laboratório Veterinário MercoLab, Cascavel, PR Brasil, sendo sua caracterização antigênica completa e identificação de sorovar realizadas pelo Instituto Adolfo Lutz, São Paulo, Brasil. As amostras foram recuperadas em caldo Brain-Heart Infusion (BHI) (HIMEDIA ) a 37ºC por 18h antes do teste. Avaliou-se a suscetibilidade antimicrobiana de acordo com as recomendações do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (CLSI, 2007). Os agentes antimicrobianos testados foram (LABORCLIN ): ácido nalidíxico (30 µg), ampicilina (10 µg), cloranfenicol (30 µg), cefalotina (30 µg), ciprofloxacina (5 µg), enrofloxacina (10 µg), estreptomicina (10 µg), imipenem (10 µg), gentamicina (10 µg), norfloxacina (10 µg), sulfazotrin (25 µg), tetraciclina (30 µg) e tobramicina (10 µg). Todas as amostras que apresentaram resistência intermediária foram agrupadas com as amostras sensíveis para evitar superestimação da resistência. Utilizaram-se como cepas referência, Salmonella Typhimurium ATCC (American Type Culture Collection) e Escherichia coli ATCC Os resultados obtidos foram comparados com os dados da Tabela 2A, do documento M100-S17 do CLSI (2007). Foram consideradas multirresistentes as amostras resistentes a 3 ou mais antimicrobianos.

21 RESULTADOS E DISCUSSÃO Verificou-se que as 118 amostras analisadas pertenciam a 38 diferentes sorovares, sendo os mais prevalentes S. Enteritidis, S. Heidelberg, S. Typhimurium, S. Hadar, S. Albany, S. Enterica e S. Saintpaul (Tab.1). Os resultados se encontram de acordo com estudos prévios realizados por outros pesquisadores, que confirmam a prevalência de S. Enteritidis em diversas regiões do Brasil, incluindo o estado do Paraná (Souza et al., 2011), São Paulo (Hofer et al., 1998; Lima et al., 2009), os Estados da Bahia, Ceará, Goiás, Paraná, Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Santa Catarina (Kanashiro et al., 2005), Rio Grande do Sul (Ribeiro et al., 2007), e Nordeste (Duarte et al., 2009). Da mesma forma, em outros países foi igualmente observada a prevalência de S. Enteritidis, nos isolados de aves de corte em Portugal (Antunes et al., 2003), na Espanha (Carramiñana et al., 2004) e na Lituânia (Ruzauskas et al., 2005). Todas as salmonelas podem causar infecções extra-intestinais, sendo que os sorovares mais prevalentes como S. Typhimurium, S. Enteritidis e S. Heidelberg estão normalmente associados a casos de infecções em humanos por estarem em um número elevado dentre a população de Salmonella (Su e Chiu, 2007). Quanto à origem das amostras de Salmonella spp., foram observadas 73 isolados de cama de aviários (61,9 %), 23 de rações/insumos de aves (19,5%) e 22 de fezes de aves (18,6%) (Tab. 1). Ressalta-se que há poucos estudos realizados sobre a incidência de Salmonella em camas, fezes e rações de frango no Brasil, sendo um dos poucos estudos realizados em fezes e carcaça de aves de corte no estado do Ceará, Brasil, mostrou que apenas as amostras isoladas de carcaças estavam contaminadas, constatando que os aviários analisados estavam livres de infecção por Salmonella, diferentemente dos aviários analisados no atual estudo (Oliveira et al., 2006).

22 Tabela 1. Distribuição de 118 amostras de Salmonella spp. isoladas de granjas de frangos de corte, de acordo com a incidência e fonte de isolamento no período entre 2003 a 2010, na região Oeste do Paraná, Brasil. Sorovar N (%) fezes cama ração/insumos Enteritidis 19 (16,1) Heidelberg 7 (5,9) Typhimurium 7 (5,9) Hadar 6 (5,0) Albany 5 (4,2) Enterica 5 (4,2) Saintpaul 5 (4,2) Derby 4 (3,4) Mbandaka 4 (3,4) Newport 3 (2,5) Infantis 3 (2,5) Tennesse 3 (2,5) Livingstone 3 (2,5) Kentucky 3 (2,5) Give 2 (1,7) Anatum 2 (1,7) Panamá 2 (1,7) Schwarzengrund 2 (1,7) Corvallis 2 (1,7) Gallinarium 2 (1,7) Brandenburg 2 (1,7) Cerro 2 (1,7) Braenderup 2 (1,7) Montevideo 2 (1,7) Ohio 2 (1,7) Agona 2 (1,7) Senftenberg 2 (1,7) Gafsa 2 (1,7) Cubana 2 (1,7) Lexigton 2 (1,7) Minnesota 2 (1,7) Pullorum 1 (0,8) Muenchen 1 (0,8) Rissen 1 (0,8) Morehead 1 (0,8) Worthington 1 (0,8) Grumpensis 1 (0,8) Orion 1 (0,8) Total 118 (100) 22 (18,6) 73 (61,9) 23 (19,5) A incidência de Salmonella spp. também foi relatada em isolados de fezes por Kottwitz et al. (2008), no Paraná, com prevalência do sorovar S. Enterica e, ao contrário desta pesquisa, não isolaram nenhuma S. Enteritidis. Quanto às amostras de cama observou-se no atual estudo, 33 diferentes sorovares de amostras de cama, sendo S. Enteritidis o sorovar mais frequente, seguido de S. Typhimurium, S. Hadar, S. Heidelberg, S. Enterica, S. Derby, S. Mbandaka, S. Infantis, S. Livingstone e S. Kentucky (Tab.1). Corroborando os resultados, Andreatti Filho et al. (2009) reportaram no Estado de

23 São Paulo, Brasil, isolados como S. Enteritidis, S. Infantis e S. Kentuky presentes em cama de aviários. A contaminação da cama de aviário torna-se um problema para a cadeia avícola, visto que, ao estar infestada por Salmonella, há a propensão de se transmitir às aves e posteriormente, aos seres humanos através do consumo da carne e derivados, de forma que o controle da disseminação de Salmonella é dependente do controle das fontes de transmissão (Frederick e Huda, 2011). Em relação à ração, 23 sorovares foram isolados sendo os mais frequentes S. Enteritidis, S. Heidelberg, S. Panamá, S. Corvallis, S. Senftenberg e S. Gafsa (Tab. 1). No entanto, Hofer et al. (1998) verificaram diferentes sorovares isolados de matérias-primas e de ração em sete regiões distintas do Brasil, sendo os mais frequentes: S. Montevideo, S. Senftenberg, S. Havana, S. Mbandaka, S. Tennessee, S. Infantis e S. Agona. Os autores mencionam que o elevado número de sorovares reconhecidos, provavelmente, decorre da mistura de um grande número de insumos de diferentes origens no preparo da ração. Observou-se que apenas 36 amostras (30,5 %) foram suscetíveis a todos os antimicrobianos, sendo aquelas que apresentaram maior sensibilidade: oriundas da ração (13/23), amostras de cama (20/73) e fezes (3/22), ou seja, as amostras isoladas de fezes e cama apresentam-se resistentes a um número maior de antimicrobianos por amostra (Tab. 2). Tabela 2. Origem, suscetibilidade e resistência a antimicrobianos de 118 amostras de Salmonella spp. isoladas de aviários de frango de corte no Oeste do Paraná no período de 2003 a N de antimicrobianos Origem e N de amostras (Resistência) Fezes Cama Ração/Insumo Nº Total (%) Suscetível (30,5) (12,7) (18,6) (25,4) (11,9) (0,8) Observou-se que 35 amostras apresentaram multirresistência, sendo que, 25,2% do total de amostras apresentaram multirresistência a 3 antimicrobianos, 11,9% a 4 antimicrobianos e 0,8% a 5 antimicrobianos (Tab. 2). Em relação as 82 amostras que apresentaram resistência, 54,2% são reportadas a tetraciclina, 44,9% ao ácido nalidíxico, 37,2% a estreptomicina, 11,9% a ampicilina, 6,8% ao cloranfenicol, 5,9% a gentamicina e 3,4% a cefalotina (Tab. 3). Nenhum sorovar apresentou resistência à tobramicina e as menores taxas de resistência se atribuíram à imipenem e sulfazotrin, juntamente com enrofloxacina, ciprofloxacina e norfloxacina (três fluoroquinolonas), ao contrário do ácido nalidíxico (1 a geração de

24 quinolonas). Estes dados concordam com Sakaridis et al. (2011), que verificaram a suscetibilidade de amostras de Salmonella frente aos antimicrobianos enrofloxacina e ciprofloxacina e altas taxas de resistência a tetraciclina, ácido nalidíxico e estreptomicina. No atual estudo, foram verificados 26 diferentes padrões de resistência antimicrobiana, embora, nenhuma das amostras testadas apresentou 100% de resistência aos antimicrobianos utilizados (Tab. 3). Observou-se ainda que 11 padrões foram associados a somente um sorovar, enquanto os outros padrões foram associados a dois ou mais sorovares. Em maior incidência encontraramse os multirresistentes a estreptomicina, ácido nalidíxico e tetraciclina (20,7%), os que apresentaram resistência somente ao ácido nalidíxico (13,4%) e os que apresentaram resistência a ácido nalidíxico e tetraciclina (11,0%). Contudo, nos Estados Unidos foi observado que nenhuma das salmonelas isoladas de amostras de fezes e ração de aves foi resistente ao ácido nalidíxico ou ciprofloxacina (Alali et al., 2010). O acido nalidíxico foi a primeira quinolona produzida com atividade antimicrobiana em enterobactérias e amplamente utilizada no Brasil (Silva e Hollenbach, 2010). Exceto uma amostra, S. Lexington, todos os sorovares resistentes a ampicilina também apresentaram resistência a tetraciclina, sendo que apenas duas amostras resistentes a estreptomicina não apresentaram resistência a tetraciclina. Nos sorovares que podem produzir grandes prejuízos à avicultura como S. Gallinarum, que determina uma doença clínica conhecida como febre tifóide e S. Pullorum, causador da pulorose, foi observado resistência a tetraciclina e ácido nalidíxico. Em trabalho realizado por Lima et al.(2009) quanto a suscetibilidade antimicrobiana de amostras isoladas de produtos avícolas, os mesmos sorovares apresentaram resistência ao ácido nalidíxico, porém, sensibilidade a tetraciclina. Uma amostra de S. Mbandaka apresentou resistência a 5 diferentes antimicrobianos e duas S. Newport a 4 antimicrobianos. Okoli et al. (2006), na Nigéria, avaliaram amostras de ração de aves comerciais para determinar a freqüência de isolamento de Salmonella sp. e os seus perfis de resistência frente a 14 antimicrobianos e verificaram 8 diferentes padrões de resistência variando de 3 a 8 antimicrobianos. As taxas de resistência aos mesmos antimicrobianos foram maiores às aqui obtidas, sendo registrado alta taxa de resistência à ampicilina e tetraciclina, moderada á cloranfenicol e baixa resistência para a ciprofloxacina. Por outro lado, difere desta pesquisa por apresentar todas as amostras sensíveis à gentamicina, estreptomicina e ácido nalidíxico. Tais diferenças podem estar relacionadas a incidência de determinadas amostras em distintas regiões geográficas, visto que os autores não descreveram os sorovares, mas

25 também pode ser atribuído a diferença na sucetibilidade das aves aos antimicrobianos ou ao controle sanitário local deficiente. Tabela 3. Distribuição dos padrões de resistência de 82 amostras de Salmonella spp isoladas de fezes, rações/farinhas para aves e cama de aviários no Oeste do Paraná. Padrão de resistência* N (%) Sorovares Tet 4 (4,9) Enterica (1), Mbandaka (1), Cubana (1), Derby (1) Nal 11 (13,4) Enteritidis (7), Heidelberg (1), Kentucky (1), Minnesota (2) Amp, Cef 1 (1,2) Lexington (1) Gen, Nal 4 (4,9) Typhimurium (3), Infantis (1) Tet, Amp 1 (1,2) Agona (1) Tet, Str 7 (8,5) Hadar (1), Derby (3), Corvalis (1), Enterica (1), Panama (1) Tet, Nal 9 (11,0) Enteritidis (1), Hadar (3), Muenchen (1), Gallinarium (1), Pullorum (1), Infantis (1), Cubana (1) Amp, Cef, Tet 2 (2,4) Livingstone (2) Tet, Cef, Imi 1 (1,2) Give (1) Str, Nal, Tet 17 (20,7) Typhimurium (3), Enteritidis (6), Hadar (2), Kentucky (1), Enterica (2), Infantis (1), Tennnesee (2) Tet, Nal, Enr 2 (2,4) Enteritidis (2) Nal, Str, Clo 1 (1,2) Saintpaul (1) Amp, Str, Tet 5 (6,1) Heidelberg (5) Amp, Nal, Tet 2 (2,4) Albany (2) Amp, Str, Tet, Nor 1 (1,2) Mbandaka (1) Amp, Str, Tet, Clo 1 (1,2) Mbandaka (1) Nal, Str, Enr, Nor 1 (1,2) Newport (1) Nal, Str, Tet, Gen 1 (1,2) Typhimurium (1) Nal, Str, Tet, Clo 3 (3,6) Saintpaul (1), Schwarzengrund (1), Enterica (1) Nal, Str, Tet, Enr 1 (1,2) Anatum (1) Nal, Str, Enr, Cip 1 (1,2) Newport (1) Nal, Str, Tet, Sul 2 (2,4) Saintpaul (1), Anatum (1) Str, Tet, Gen, Clo 2 (2,4) Albany (2) Str, Tet, Clo, Sul 1 (1,2) Montevideo (1) Str, Tet, Amp, Nor, Cip 1 (1,2) Mbandaka (1) *36 amostras foram sensíveis aos antimicrobianos testados; Tob: Tobramicina; Imi: Imipenem; Gen: gentamicina; Nal: ácido nalidíxico; Sul:sulfazotrin; Tet: tetraciclina; Cef: cefalotina; Str: estreptomicina; Enr: enrofloxacina; Amp: ampicilina; Cip: ciprofloxacina; Clo: cloranfenicol; Nor: norfloxacin. Entre os 18 sorovares de S. Enteritidis isolados, 16 (88,9%) apresentaram resistência a tetraciclina e/ou ácido nalidixíco e 6 (33,3%) a estreptomicina (Tab. 3). Estes resultados concordam com Vaz et al. (2010), que isolaram S. Enteritidis de surtos de salmonelose e produtos relacionados a aves e reportaram menores taxas de resistência a ácido nalidíxico, estreptomicina e tetraciclina. Além disso, semelhantemente ao presente trabalho, todos os sorovares foram suscetíveis à ampicilina, ciprofloxacina e cloranfenicol. Também, Cardoso et al. (2006) mencionam, além de ciprofloxacina, suscetibilidade a gentamicina, norfloxacin e sulfazotrin, semelhante aos nossos resultados. Ressalta-se que S. Enteritidis emergiu como um grande problema avícola e de saúde pública no Brasil a partir de 1993, introduzido, provavelmente, pela importação, no final da década de 80, de ovos férteis de galinha e pintos de um dia contaminados. Além disso, a rápida expansão da avicultura brasileira na década de 1990, concomitante com o uso indiscriminado

26 de antimicrobianos em aves criou condições favoráveis para a manutenção e proliferação da S. Enteritidis, bem como induziu a manutenção de lotes positivos para S. Enteritidis (Peresi, 1998; Silva e Duarte, 2002). Os seis sorovares de S. Hadar apresentaram resistência a três diferentes padrões de multirresistência, tetraciclina-ácido nalidíxico, estreptomicina-ácido nalidíxico-tetraciclina e tetraciclina-estreptomicina. Os resultados desta pesquisa corroboram com os valores anteriormente relatados por Antunes et al. (2003) e Ribeiro et al. (2006), que embora tenham realizados trabalhos com carcaças e outros produtos de aves, verificaram que todos os isolados de S. Hadar (100%) apresentavam resistência aos antimicrobianos testados, com elevadas taxas de resistência a tetraciclina, ácido nalidíxico, enrofloxacina e estreptomicina. Assim como S. Hadar, todos os sorovares de S. Typhimurium apresentaram três diferentes padrões de multirresistência sendo: gentamicina-ácido nalidíxico, estreptomicina-ácido nalidíxico-tetraciclina e ácido nalidíxico-estreptomicina-tetraciclina-gentamicina. Bauer- Garland et al. (2006) verificaram a transmissão de S. Typhimurium multirresistente e sensível, observando que salmonelas multirresistentes são mais virulentas sob pressão de seleção permitindo que elas se espalhem mais rapidamente de animal para animal e também respondem mal ao tratamento antimicrobiano. Já, o sorovar S. Heidelberg apresentou uma amostra com resistência a somente ácido nalidíxico e 5 sorovares com multirresistência a ampicilina-estrptomicina-tetraciclina. Assim, verifica-se a clara necessidade de se aplicar restrições sobre o uso de antimicrobianos na avicultura, e nesse sentido, nas últimas décadas, tem-se visto evolução significativa na preocupação do consumidor na compra de produtos cuja produção garanta a segurança ambiental e alimentar, como os alimentos orgânicos. Além disso, a elevada taxa de resistência aos antimicrobianos testados ressalta, também, a importância da busca de novos compostos, sintéticos ou naturais, no intuito de controlar a ação de micro-organismos patogênicos por métodos seguros e saudáveis de produção agrícola/agropecuária. CONCLUSÕES Os sorovares de Salmonella compõem diferentes padrões de resistência apresentando grande variação na sensibilidade e elevada resistência aos antimicrobianos testados, principalmente a tetraciclina e ao ácido nalidíxico. Os dados obtidos enfatizam a importância do controle de Salmonella nos produtos avícolas e sugerem a necessidade de uso responsável dos antimicrobianos visando manter a biosseguridade.

27 AGRADECIMENTOS Os autores agradecem ao Dr. Alberto Bach pela doação das amostras de Salmonella, ao Instituto Adolfo Lutz pela sorotipagem da Salmonella, ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo financiamento a F.G.S.P (Proc /2010) e a L.F.A.A. pela bolsa de produtividade, bem como, a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela bolsa de pós-graduação de E.A.M.B. e financiamento da pesquisa. REFERÊNCIAS ALALI, W.Q.; THAKUR, S.; BERGHAUS, R. D. et al. Prevalence and distribution of Salmonella in organic and conventional broiler poultry farms. Foodborne pathog. Dis., v.7, p , ANDREATTI-FILHO, R.L.; LIMA, E.T.; MENCONI, A. et al. Pesquisa de Salmonella spp. em suabes de arrasto provenientes de granjas avícolas. Vet. e Zootec., v.16, p , ANTUNES, P.; REU, C.; SOUSA, J.C. et al. Incidence of Salmonella from poultry products and their susceptibility to antimicrobial agents. Inter. J. Food Microbiol., v.82, p , BAUER-GARLAND, J.; FRYE, J.G.; GRAY, J.T. et al. Transmission of Salmonella enterica serotype Typhimuriumin poultry with or without antimicrobial selective pressure. J. Appl Microbiol. v.101, p , BILA, D.M.; DEZOTTI, M. Fármacos no meio ambiente. Quim. Nova, v.26, p , BOERLIN, P.; REID-SMITH, R.J. Antimicrobial resistance: its emergence and transmission. Anim. Health Res. Rev., v.9, p , BRASIL. Secretaria de Vigilância em Saúde. Coordenação de Vigilância das Doenças de Transmissão Hídrica e Alimentar. Analise Epidemiológica de Surtos de Doenças Transmitidas por Alimentos no Brasil, Disponível em: < arquivos/pdf/dta.pdf>. Acessado em: 22 set CARDOSO, M.O.; RIBEIRO, A.R.; SANTOS, L.R. et al. Antibiotic resistance in Salmonella Enteritidis isolated from broiler carcasses. Braz. J. Microbiol., v.37, p , 2006.

28 CARRAMIÑANA, J.J.; ROTA, C.; AGUSTÍN, I. et al. High prevalence of multiple resistance to antibiotics in Salmonella serovars isolated from a poultry slaughterhouse in Spain. Vet. Microbiol., v.104, p , CLSI. Clinical Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing: Seventh Informational Supplement M100-S FREDERICK, A.; HUDA, N. Salmonellas, Poultry House Environments and Feeds: A Review. J. Anim. Vet. Adv., v.10, p , HASMAN, H.; MEVIUS, D.; VELDMAN, K. et al. Beta-Lactamases among extendedspectrum beta-lactamase (ESBL)-resistant Salmonella from poultry, poultry products and human patients in The Netherlands. J. Antimicrob. Chemother., v.56, p , HOFER, E.; SILVA FILHO S.J.; REIS, E.M.F. Sorovares de Salmonella isolados de matériaprima e de ração para aves no Brasil. Pesq. Vet. Bras., v.18, p.21-27, KANASHIRO, A.M.I.; STOPPA, G.F.Z.; CARDOSO, A.L.S.P. et al. Serovars of Salmonella spp. isolated from broiler chickens and commercial breeders in diverse regions in Brazil from July 1997 to December Rev. Bras. Cienc. Avic., v.7, p , KOTTWITZ, L.B.M.; BACK, A.; LEÃO, J.A. et al. Contaminação por Salmonella spp. em uma cadeia de produção de ovos de uma integração de postura comercial. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.60, p , LIMA, E.T.; ANDREATTI FILHO, R.L.; PINTO, J.P.A.N. Perfil de susceptibilidade antimicrobiana de sorotipos de Salmonella isolados de produtos avícolas. Vet. Zoot., v.16, p , OKOLI, I.C.; NDUJIHE, G.E.; OGBUEWU, I.P. Frequency of isolation of Salmonella from commercial poultry feeds and their anti-microbial resistance profiles, Imo State, Nigeria. Online J. Health Allied Scs., v.5, p.1-10, OLIVEIRA, W.F.; CARDOSO, W.M.; SALLES, R.P.R. et al. Initial identification and sensitivity to antimicrobial agents of Salmonella sp. isolated from poultry products in the state of Ceara, Brazil. Rev. Bras. Cienc. Avic., v.8, p , PERESI, J.T.M.; ALMEIDA, I.A.Z.C; LIMA, S.I. et al. Surtos de enfermidades transmitidas por alimentos causados por Salmonella Enteritidis. Rev. Saúde Públ., v.32, p , RIBEIRO, A.R.; KELLERMANN, A.; SANTOS, L.R. et al. Resistência antimicrobiana em Salmonella enterica subsp enterica sorovar Hadar isoladas de carcaças de frango. Arq. Inst. Biol., v.73, p , 2006.