Norma Técnica SABESP NTS 014

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1 Norma Técnica SABESP NTS 014 Coliformes Totais e Termotolerantes - Método de membrana filtrante Procedimento São Paulo Dezembro

2 NTS 014 : 2005 Norma Técnica SABESP S U M Á R I O 1 OBJETIVO PRINCÍPIO DO MÉTODO DEFINIÇÕES MATERIAIS UTILIZADOS E EQUIPAMENTOS REAGENTES Reagentes primários Reagentes elaborados LIMPEZA, PREPARO E ESTERILIZAÇÃO DE MATERIAIS USADOS EM BACTERIOLOGIA Procedimento Teste de eficiência de esterilização dos frascos de coleta AMOSTRAGEM Embalagem para amostragem Técnica de coleta Preservação da amostra INTERFERENTES PROCEDIMENTO ANALÍTICO Diluição ou divisão de amostras Preparação da sala de filtração Procedimento básico Confirmação de colônias típicas e atípicas de coliformes totais e termotolerantes RESULTADOS Ensaio presuntivo Ensaio confirmativo para coliforme total PRESENÇA/AUSÊNCIA Ensaio confirmativo para coliforme total QUANTIFICAÇÃO Ensaio confirmativo para coliforme termotolerante PRESENÇA/AUSÊNCIA BIBLIOGRAFIA /12/2005

3 Norma Técnica SABESP NTS 014 : 2005 Coliformes Totais e Termotolerantes - Método de membrana filtrante 1 OBJETIVO Prescrever o método para determinação de coliformes totais e termotolerantes em águas naturais e tratadas pela técnica de filtração seguida de inoculação e incubação. 2 PRINCÍPIO DO MÉTODO Este método é baseado na inoculação da amostra, em meios de cultura específicos para o desenvolvimento de bactérias do grupo coliformes. Uma vez que haja o desenvolvimento de colônias, confirma-se a presença dos coliformes, a qual dependendo do procedimento adotado, o resultado pode ser expresso como: presença/ausência por 100 ml ou a quantificação dos mesmos em coliformes/100 ml. Em todas as etapas que se seguem quando o resultado for negativo, considerar como ausência de coliformes na amostra. A metodologia possui três etapas distintas: 1) Filtração: A primeira é uma retenção dos possíveis microorganismos presentes na amostra, através da filtração de 100 ml de amostra ou uma porção diluída da mesma através de uma membrana filtrante específica de 0,45µm de porosidade. A membrana é colocada em uma placa de Petri contendo meio de cultura m-endo agar les e segue para incubação em estufa de cultura a 35±0,5 C por 22 a 24h. Resultado positivo: colônias vermelhas com brilho verde metálico superficial. 2) Ensaio presuntivo: Os resultados positivos suspeitos para coliformes totais na etapa anterior são repicados para o meio de cultura caldo lactosado (ou lauril triptose) com púrpura de bromocresol e submetidos à incubação em estufa de cultura a 35±0,5 C por 24/48h. O resultado positivo nesta etapa é a alteração de cor do meio de cultura de púrpura para amarelo em função da alteração de ph pelo desenvolvimento bacteriano fermentador de lactose ou presença de gás no tubo de Durhan. 3) Ensaio confirmativo: Coliformes totais: Os resultados positivos no ensaio presuntivo são repicados para o meio de cultura caldo lactosado verde brilhante bile 2% e submetidos à incubação em estufa de cultura a 35±0,5 C por 24/48h. O resultado positivo nesta etapa é a presença de CO 2 e H 2 (gases) no tubo de Durhan. Coliformes termotolerantes: Os resultados positivos no ensaio presuntivo são também repicados para o meio de cultura caldo EC (EC broth) e submetidos à incubação em banho térmico a 44,5±0,2 C por 24±2h. O resultado positivo nesta etapa é a presença de CO 2 e H 2 (gases) no tubo de Durhan. 3 DEFINIÇÕES Coliformes totais são bactérias capazes de crescer na presença de sais biliares ou agentes tensoativos (como lauril sulfato de sódio) e de fermentar a lactose a 35-37ºC, com produção de ácido, gás e aldeído, em 24/48 horas. Coliformes termotolerantes é um subgrupo de coliformes totais que tem a propriedade de se desenvolver a 44,5±0,2ºC em meio de cultura EC em 24 horas. Exemplos: Escherichia coli, Klebsiella. Colônias típicas Colônias vermelhas com brilho verde metálico superficial total ou parcial. Colônias atípicas Colônias vermelhas sem brilho. 13/12/2005 1

4 NTS 014 : 2005 Norma Técnica SABESP C.L. - Caldo Lactosado. C.L.V.B.B. - Caldo Lactosado verde brilhante e bile a 2% (meio de cultura para coliformes totais). EC - Meio de cultura para coliformes termotolerantes. Crescimento confluente - Todo crescimento excessivo sem colônias bem definidas na superfície da membrana, tanto para colônias típicas como atípicas. 4 MATERIAIS UTILIZADOS E EQUIPAMENTOS Alça para repique, Banho térmico com agitador, Estufa de cultura, Frasco de diluição para leite, com ou sem graduação, Membranas filtrantes de éster de celulose com 47 mm de diâmetro e 0,45 µm de porosidade, quadriculada, na cor branca, Microscópio estereoscópico, com aumento de 10 a 15 vezes e fonte de luz fluorescente, Pinças sem ponta, Pissete autoclavável, Placas de Petri de plástico atóxico, estéril, de aproximadamente 49 mm de diâmetro e 9 mm de altura, Sistema de filtração, Tubo de Durhan, Tubo de ensaio de vidro neutro ou de borossilicato com dimensões de aproximadamente 12x120 mm com ou sem tampa de rosca, Tubo de ensaio de vidro neutro ou de borossilicato com dimensões mínimas de 16x150 mm com ou sem tampa de rosca. 5 REAGENTES 5.1 Reagentes primários Ácido Clorídrico p.a. - HCl Álcool Etílico comercial (96ºGL) - C 2 H 5 OH Álcool Etílico p.a. C 2 H 5 OH Cloreto de Magnésio hexahidratado p.a. - MgCl 2.6H 2 O EDTA (Ácido etileno diamino tetracético sal dissódico) - C 10 H 14 N 2 O 8 Na 2.2H 2 O Fosfato de Potássio monobásico p.a. - KH 2 PO 4 Hidróxido de Sódio p.a. - NaOH Meio de cultura Caldo Lactosado desidratado ou Caldo Lauril Triptose desidratado Meio de cultura Caldo Lactosado verde brilhante e Bile 2% desidratado Meio de cultura caldo EC desidratado Meio de cultura M-Endo Agar Les (Bacto) desidratado Púrpura de Bromocresol p.a. Tiossulfato de Sódio pentahidratado p.a. - Na 2 S 2 O 3.5H 2 O 2 13/12/2005

5 Norma Técnica SABESP NTS 014 : Reagentes elaborados Solução alcoólica 70% Medir 700 ml de álcool etílico comercial 96% (alterar quantidades de álcool e água deionizada se utilizar álcool com outra concentração); Adicionar 260 ml de água deionizada; Homogeneizar Soluções para preparação do tampão Solução estoque A: Dissolver 34 g de Fosfato de Potássio monobásico em 500 ml de água deionizada e ajustar o ph para 7,2±0,5 com Hidróxido de Sódio 1 mol/l. Completar para 1000 ml com água deionizada; Solução estoque B: Dissolver 81,1 g de Cloreto de Magnésio hexahidratado em 1000 ml de água deionizada; Autoclavar as soluções a 121ºC por 15 minutos antes de usá-las. Armazenar em frasco com tampa protegido da luz e guardar em geladeira Solução de EDTA 15% Água de diluição (Tampão) Solução de uso 1 Juntar 1,25 ml de solução estoque A com 5 ml de solução estoque B, completar o volume para 1000 ml com água deionizada; Colocar cerca de 92 ml dessa solução em um frasco de diluição de leite; Autoclavar a 121ºC por 15 minutos; O volume do líquido no frasco deve ser de 90±2mL. Solução de uso 2 Juntar 1,25 ml de solução estoque A, com 5 ml de solução estoque B, em um erlenmeyer e completar para 1000 ml com água deionizada; Tampar com algodão; Autoclavar a 121 C por 15 minutos Preparação do meio de cultura M-Endo Agar Les Fazer assepsia da bancada com Álcool Etílico 70%, aguardando a secagem da mesma; Acender o bico de Bünsen; Em um béquer estéril pesar 51 g do meio M-Endo Agar Les (ou valor indicado pelo fabricante); Adicionar no béquer com o meio, com auxílio de uma pipeta estéril, 20 ml de Álcool Etílico p.a. Misturar com um bastão de vidro estéril até que todo meio fique umedecido; Retirar uma alíquota do balão volumétrico contendo 1000 ml de água deionizada estéril e acrescentar no béquer com o meio; Homogeneizar com auxílio do bastão esterilizado; Colocar a mistura no balão com o restante da água, tampar e homogeneizar; Deixar em repouso protegido da luz por 15 minutos, à temperatura ambiente, homogeneizando algumas vezes; Aquecer em banho de água fervente, agitando freqüentemente até completa dissolução do meio, tomando o cuidado para que não seja atingida a temperatura de ebulição; Acender os outros bicos de Bünsen; Fazer a assepsia do local de trabalho; 13/12/2005 3

6 NTS 014 : 2005 Norma Técnica SABESP Após a dissolução do meio, separar em um tubo de ensaio uma pequena amostra do meio, aguardar até que fique à temperatura ambiente e medir o ph, que deve estar na faixa de 7,2±0,2; Nota 1: Caso o ph não esteja na faixa desejada, desprezar o lote e preparar novo lote. Colocar as bases das placas de Petri previamente esterilizadas sobre a bancada e distribuir com auxílio de uma pipeta esterilizada, cerca de 3 a 4 ml do meio em cada uma; Aguardar alguns minutos e tampá-las; Aguardar esfriar completamente até solidificar; Acondicioná-las em uma caixa plástica com as placas na posição invertida; Refrigerar (2º a 10ºC) por até duas semanas Preparação do meio de cultura caldo EC Em um béquer com capacidade de 250 ml, pesar 3,7 g do meio de cultura EC; Acrescentar 100 ml de água deionizada e homogeneizar com um bastão de vidro até dissolver completamente; Ajustar o ph, se necessário, com NaOH 1 mol/l ou HCl 1 mol/l; Distribuir cerca de 5 ml do meio em tubos de ensaio de 12x120 mm tendo em seu interior tubos de Durhan invertidos; Tampar os tubos e autoclavar por 15 minutos a 121ºC; Após autoclavação e à temperatura ambiente, medir o ph final que deve ser de 6,9±0,2; Nota 2: Caso o ph não esteja na faixa desejada, desprezar o lote e preparar novo lote. Armazenar em temperatura de 2 a 6ºC por até duas semanas ou manter em temperatura menor que 30ºC por até uma semana Preparação do meio de cultura caldo lactosado (CL) com púrpura de bromocresol Pesar 13,0 g do meio de cultura caldo lactosado e 0,01 g de púrpura de bromocresol; Transferir o meio e a púrpura de bromocresol para um balão de fundo chato de 2000 ml contendo aproximadamente 500 ml de água deionizada; Homogeneizar e completar o volume para 1000 ml com água deionizada e homogeneizar novamente; Aquecer, se necessário, agitando freqüentemente, até completa dissolução do meio, tomando o cuidado para não atingir a temperatura de ebulição; Ajustar o ph, se necessário, com NaOH 1 mol/l ou HCl 1 mol/l que deve estar em 6,9±0,2; Após completa dissolução do meio, colocar cerca de 10 ml em tubos de ensaio de 16mmx150mm com tampa de rosca, contendo em seu interior tubos de Durhan invertidos; Fechar os tubos; Autoclavar por 15 minutos a 121 C; Após autoclavação e à temperatura ambiente, medir o ph final que deve ser de 6,9±0,1; Nota 3: Caso o ph não esteja na faixa desejada, desprezar o lote e preparar novo lote. Armazenar em temperatura de 2 a 6ºC por até duas semanas ou manter em temperatura menor que 30ºC por até uma semana Preparação do meio de cultura caldo lauril triptose com púrpura de bromocresol Pesar 35,6 g do meio de cultura caldo lauril triptose e 0,01 g de púrpura de bromocresol; 4 13/12/2005

7 Norma Técnica SABESP NTS 014 : 2005 Transferir o meio e a púrpura de bromocresol para um balão de fundo chato de 1000 ml contendo aproximadamente 500 ml de água deionizada; Homogeneizar e completar o volume para 1000 ml com água deionizada e homogeneizar novamente; Aquecer, se necessário, agitando freqüentemente, até completa dissolução do meio, tomando o cuidado para não atingir a temperatura de ebulição; Ajustar o ph, se necessário, com NaOH 1 mol/l ou HCl 1 mol/l que deve estar em 6,8±0,2; Após completa dissolução do meio, colocar cerca de 10 ml em tubos de ensaio de 16mmx150mm com tampa de rosca, contendo em seu interior tubo de Durhan invertido; Fechar os tubos; Autoclavar por 15 minutos a 121 C; Após autoclavação e à temperatura ambiente, medir o ph final que deve ser de 6,8±0,2; Nota 4: Caso o ph não esteja na faixa desejada, desprezar o lote e preparar novo lote. Armazenar em temperatura de 2 a 6ºC por até duas semanas ou manter em temperatura menor que 30ºC por até uma semana Preparação do meio de cultura caldo lactosado verde brilhante e bile 2% Pesar 40,0 g do meio caldo lactosado verde brilhante desidratado; Transferir o meio para um balão de fundo chato de 2000 ml contendo aproximadamente 500 ml de água deionizada; Homogeneizar e completar o volume para 1000 ml com água deionizada e homogeneizar novamente; Aquecer, se necessário, agitando freqüentemente, até completa dissolução do meio, tomando o cuidado para que não seja atingida a temperatura de ebulição; Ajustar o ph, se necessário, com NaOH 1 mol/l ou HCl 1 mol/l; Após a dissolução do meio, colocar cerca de 10 ml em tubos de ensaio de 16 mm x 150mm com tampa de rosca, contendo em seu interior tubos de Durhan invertidos; Fechar os tubos; Autoclavar por 15 minutos a 121 C; Após autoclavação e à temperatura ambiente, medir o ph final que deve ser de 7,2±0,2; Nota 5: Caso o ph não esteja na faixa desejada, desprezar o lote e preparar novo lote. Armazenar em temperatura de 2 a 6ºC por até duas semanas ou manter em temperatura menor que 30ºC por até uma semana Solução de Tiossulfato de Sódio pentahidratado 3% m/v Ácido Clorídrico 1 mol/l Hidróxido de Sódio 1 mol/l 6 LIMPEZA, PREPARO E ESTERILIZAÇÃO DE MATERIAIS USADOS EM BACTERIOLOGIA 6.1 Procedimento Vidrarias em geral Fazer a descontaminação prévia de toda a vidraria utilizada nos ensaios microbiológicos, onde houver água de diluição ou meios de cultura, em autoclave a 121ºC por 30 minutos. - Desprezar o conteúdo das vidrarias; - Colocar de molho em água contendo detergente neutro, por no mínimo 2 horas; 13/12/2005 5

8 NTS 014 : 2005 Norma Técnica SABESP - Lavar a parte externa com uma esponja e a parte interna com escovas (tipo gaspilhão) embebidas em água e detergente neutro 2 a 5%; - Enxaguar em água corrente várias vezes; - Enxaguar em água deionizada ou destilada; - Secar em estufa de secagem; - Quando utilizar vidraria aberta, fechar com papel alumínio, cobrindo inclusive as bordas externas Materiais especiais Tubos de Durhan Fazer a descontaminação prévia esterilizando em autoclave a 121ºC por 30 minutos; Após descontaminação, colocá-los em um béquer com água e detergente neutro e ferver por 15 minutos, para remoção dos resíduos internos. Pipetas - Colocar as pipetas de molho em água e detergente neutro num recipiente por no mínimo uma hora; - Enxaguar com água pelo menos 10 vezes; - Enxaguar com água deionizada; - Deixar escorrer; - Colocar as pipetas dentro do porta-pipetas de aço inoxidável ou embalar em papel kraft; - Esterilizar em estufa de secagem a 170ºC por duas horas. Sistema de filtração - Lavar as duas partes do sistema com uma esponja embebida em água e detergente neutro; - Enxaguar em água corrente por várias vezes; - Enxaguar em água deionizada; - Secar à temperatura ambiente ou estufa de secagem em temperatura inferior a 50ºC; Para esterilização em autoclave, embrulhar o conjunto em papel kraft ou similar, e autoclavar por 15 minutos a 121ºC. Para esterilização em forno de microondas, colocar em uma caixa plástica, tampá-la, colocar no forno de microondas e ligar por 1 minuto em potência máxima (100%) e por 2 minutos em potência fraca (30%), repetindo a operação por duas vezes e deixando um pequeno intervalo entre cada operação. Nota 6: Não utilizar forno de microondas para sistemas que contenham ímã. Placas de Petri plásticas - Destampar a placa; - Retirar o meio e a membrana da base da placa com auxílio de uma espátula; - Embalar o meio com a membrana em papel alumínio e colocar dentro de um saco plástico autoclavável; - Descontaminar o material esterilizando em autoclave a 121ºC por 30 minutos; - Desprezar material descontaminado no lixo; - Colocar, separadamente, as tampas e os fundos de molho em álcool etílico comercial a 70% por no mínimo 12 horas, enxaguar com água corrente e deixar de molho em detergente neutro a 2% cerca de 12 horas; - Enxaguar em água corrente 10 vezes; - Enxaguar em água deionizada; 6 13/12/2005

9 Norma Técnica SABESP NTS 014 : Imergir em solução de Álcool Etílico a 70% por no mínimo 2 horas; - Secar em estufa com temperatura inferior a 50ºC; - Colocar em caixas plásticas, desinfetar em luz ultravioleta por cinco minutos ou esterilizar no forno de microondas, ligando por um minuto na potência máxima (100%) e por dois minutos na potência média baixa (30%), repetindo a operação por duas vezes e deixando um pequeno intervalo entre cada operação; - Tampar a caixa e guardar. Frascos de coleta - Retirar o papel alumínio que protege a tampa e a boca do frasco; - Desprezar o restante da amostra; - Retirar as etiquetas e caso haja algum código marcado no frasco, retirar com Álcool Etílico comercial e algodão; - Colocar os frascos e as tampas em solução de detergente neutro de 2 a 5 % por um mínimo de duas horas; - Lavar a parte externa dos frascos e as tampas com esponja e sabão neutro e as partes internas com escovas (tipo gaspilhão); - Enxaguar em água corrente várias vezes; - Enxaguar em água deionizada ou destilada; - Secar os frascos; - Colocar 3 gotas de Tiossulfato de Sódio pentahidratado a 3% em cada frasco; Nota 7: Esta quantidade de Tiossulfato de Sódio neutraliza até 5 mg/l de cloro residual livre em 100mL de amostra. - Tampar o frasco sem rosquear completamente a tampa para permitir a entrada e saída do vapor; - Envolver as tampas dos frascos de coleta com papel alumínio; - Autoclavar por 15 minutos a 121ºC; - Após esfriar, retirar da autoclave e fechá-los por completo; - Fixar o papel alumínio com elástico em volta do frasco Materiais novos PROCEDIMENTOS COMPLEMENTARES PRÉ-TRATAMENT0 PARA ELIMINAÇÃO DE FENOL E SUBSTÂNCIAS TÓXICAS EM TAMPAS PLÁSTICAS E VEDAÇÕES DE BORRACHA NOVAS Vedações de borracha e tampas plásticas novas podem conter resíduos tóxicos que se não forem removidos podem alterar a composição de soluções e meios de cultura. Eliminação de fenol 1) processo simplificado: - Imergir tampas ou vedações em água destilada em um recipiente adequado; - Autoclavar a 121 C, durante 30 minutos; - Repetir esta operação 6 vezes consecutivas (ou mais), efetuando a troca de água destilada a cada autoclavação. Para comprovar a eliminação dos resíduos tóxicos, realizar a prova de adequabilidade biológica e determinação de fenol da água destilada proveniente da última autoclavação. As tampas e vedações só estarão em condições de uso quando a prova de adequabilidade apresentar resultados da razão B/A compreendidos num intervalo de 0,8 a 3,0 e a análise de fenol apresentar resultado negativo. 13/12/2005 7

10 NTS 014 : 2005 Norma Técnica SABESP 2) processo alternativo: - Imergir tampas e vedações de borracha em soluções de Hidróxido de Sódio 3N contida em recipiente adequado e deixar em contato durante 24 horas; - Remover a solução de Hidróxido de Sódio após 24 horas; - Neutralizar com solução de Ácido Clorídrico 1N; - Colocar os materiais em local adequado e proceder como o descrito no processo simplificado. Eliminação de gordura e outros resíduos - Imergir a vidraria em solução de Ácido Clorídrico a 1%, em recipiente adequado deixando em repouso durante 12 horas; - Retirar a vidraria desta solução e enxaguar cuidadosamente em água corrente; - Imergir a vidraria em solução de detergente em concentração adequada e proceder a sua lavagem normal. 6.2 Teste de eficiência de esterilização dos frascos de coleta - Preparação do meio: Pesar 4,5 g de meio TSB (Tryptic Soy Broth) e dissolver em 150mL de água deionizada. Nota 8: Preparar sempre momentos antes do uso; - Após a dissolução do meio, separar uma pequena quantidade de amostra e medir o ph que deve estar na faixa de 7,3±0,2 C, caso necessário ajustar com NaOH 1 mol/l ou HCl 1 mol/l; - Adicionar ±20 ml do meio de cultura em cinco frascos de coleta recém preparados para esterilização e fechá-los; - Esterilizar 4 frascos em autoclave, mantendo um frasco (nº 5) fora da mesma como controle positivo; - Após a autoclavação, em temperatura ambiente, medir o ph final que deve ser de 7,3±0,2 C; - Apertar a tampa dos frascos (rosquear) e levá-los para estufa, inclusive nº 5, por 72 horas a 35±0,5 C; - Retirar da estufa e observar se houve alteração de cor. Resultados Caso a esterilização seja eficiente não haverá alteração de cor; Caso a esterilização não seja eficiente, o meio passa de amarelo para branco leitoso. Neste caso deve ser repetido o teste após confirmação da ineficiência da esterilização. 7 AMOSTRAGEM 7.1 Embalagem para amostragem Coletar as amostras em frascos de volume mínimo de 100 ml, limpos, esterilizados em autoclave a 121ºC durante 15 minutos, contendo 3 gotas de solução de Tiossulfato de Sódio 3% (para eliminar a possível presença de cloro residual livre da amostra). Deve existir uma proteção de papel alumínio na tampa do frasco, que deve ser mantida desde o final da esterilização do frasco até o instante do ensaio. O frasco deve ter uma vedação perfeita, para não permitir qualquer vazamento durante o transporte da amostra. Nota 9: Para água bruta contendo metais pesados adicionar 0,3 ml de EDTA a 15% para cada 100 ml da amostra, antes da autoclavação do frasco. 8 13/12/2005

11 Norma Técnica SABESP NTS 014 : Técnica de coleta Coletar a amostra sem enxaguar o frasco, tomando cuidado para não encostar qualquer objeto na boca do mesmo. Evitar conversar ou respirar diretamente no ato de enchimento do frasco. Não enchê-lo até a boca visando a homogeneização da amostra. Amostras coletadas em torneiras: Abrir a torneira, aguardar aproximadamente um minuto e coletar a amostra. Amostras coletadas em superfícies: Amostras em canais, córregos ou corredeiras devem ser coletadas colocando a boca do frasco no sentido contrário da correnteza; Amostras de superfície ou reservatórios, quando não for possível amostragem diretamente com o frasco de amostra, podem ser coletadas com auxílio de um frasco auxiliar amarrado em um cordão previamente higienizado ou esterilizado. Amostras coletadas em bicas ou ausência de torneiras: Limpar a área onde será feita a coleta. Coletar a amostra. 7.3 Preservação da amostra As amostras devem ser preservadas a uma temperatura de 2 a 10ºC, sendo que o tempo máximo decorrido entre a coleta e o ensaio deve ser de 24 horas, podendo no caso de água tratada atingir 30 horas. 8 INTERFERENTES Amostra com turbidez elevada pode inviabilizar o ensaio devido ao entupimento da membrana. Excesso de bactérias heterotróficas. Presença de cloro residual na amostra. 9 PROCEDIMENTO ANALÍTICO 9.1 Diluição ou divisão de amostras A diluição de amostras deve ser feita com o tampão, definida de acordo com sua procedência: Águas tratadas para consumo humano ou águas minerais ou águas de poços profundos não necessitam de diluições em uma primeira avaliação; Águas de superfície ou contaminadas: Quando se tratar de amostras analisadas com freqüência é esperado que o técnico de laboratório saiba o valor da diluição. Caso contrário deve optar por várias proporções de diluição da amostra. Técnicas de diluição Baixas concentrações de coliformes Com auxílio de uma proveta estéril de 100 ml fazer as diluições conforme tabela abaixo (usar uma proveta para cada diluição realizada): Diluição Volume da amostra ml Volume de tampão ml Fator de multiplicação nos resultados (f) 20% % ,33 50% % ,67 80% ,25 13/12/2005 9

12 NTS 014 : 2005 Norma Técnica SABESP Altas concentrações de coliformes: diluições exponenciais de base 10; Utilizar frascos de diluição contendo 90±2 ml de tampão, e pipeta graduada esterilizada de 10 ml; Homogeneizar a amostra; Com auxílio da pipeta graduada, transferir 10 ml da amostra para o frasco de diluição com 90 ml de tampão; Agitar a mistura, esta diluição será conhecida como 10-1 ; Com auxílio da pipeta graduada, transferir 10 ml da diluição 10-1 para outro frasco de diluição com 90 ml de tampão; após agitação esta diluição será 10-2 ; Fazer o mesmo procedimento anterior até obter a diluição desejada. Nos resultados, utilizar a tabela a seguir para corrigir o resultado final da análise. Diluição Fator de multiplicação nos resultados f Técnica de divisão de amostra: Utilizar quando a concentração bacteriana esperada for baixa, mas maior que 80 coliformes/100ml. Filtrar porções da amostra em membranas diferentes e inocular em placas distintas. O volume final de amostra filtrada deve ser 100 ml. Nota 10: Por exemplo: Filtrar porções de 5, 10, 15, 20 e 50 ml. Realizar a leitura de todas as placas considerando a quantidade de coliformes totais típicos e atípicos como sendo a soma das contagens inferiores a 80 coliformes em cada uma das placas (p). 9.2 Preparação da sala de filtração Todos os materiais utilizados neste ensaio devem ser previamente esterilizados de acordo com o item 6; Fazer assepsia da bancada e das mãos com Álcool Etílico 70%, aguardando a secagem; Acender o bico de Bünsen sobre a bancada onde for realizar o ensaio. 9.3 Procedimento básico Verificar a esterilização do tampão, meio de cultura e conjunto de filtração antes e durante o processo de filtração de amostra, filtrando 100 ml do tampão simulando uma amostra. Preparar o sistema de filtração com a membrana de 0,45µm. Homogeneizar a amostra. Medir a porção predeterminada da amostra e filtrar. Lavar com o tampão as paredes do copo do sistema de filtração. Remover a membrana do sistema de filtração com auxílio da pinça flambada e esfriada e colocá-la na placa de Petri contendo o meio endo agar les. Tampar a placa e colocá-la em posição invertida em uma bandeja /12/2005

13 Norma Técnica SABESP NTS 014 : 2005 Caso continue com outras filtrações de amostras, com o auxílio da pissete contendo tampão, lavar as paredes internas do conjunto de filtração e repetir desde o início do item 9.3. Após a filtração de todas as amostras, incubar as placas em posição invertida, em estufa de cultura a 35±0,5 o C por 22 a 24 horas. Aguardar o prazo de incubação e retirar as placas da estufa. Observar se houve formação de colônias típicas de coliformes totais (vermelhas com brilho verde metálico) e/ou colônias atípicas (vermelhas escuras ou colônias nucleadas sem brilho). Com o auxílio de um microscópio estereoscópico com aumento de 10 a 15 vezes e fonte de luz fluorescente, contar o número de colônias típicas e/ou atípicas. Realizar a confirmação de colônias de coliformes totais conforme item Confirmação de colônias típicas e atípicas de coliformes totais e termotolerantes Confirmação de colônias típicas e atípicas de coliformes totais PRESENÇA/ AUSÊNCIA Selecionar as placas que contenham colônias típicas e/ou atípicas de coliformes totais; Repicar todas as colônias para um único tubo de ensaio contendo caldo lactosado Confirmação de colônias típicas e atípicas de coliformes totais QUANTIFICAÇÃO Selecionar as placas que forneceram contagem de colônias típicas de coliformes totais (colônias vermelhas com brilho verde metálico) e/ou atípicas de coliformes totais (vermelhas escuras ou colônias nucleadas sem brilho metálico) entre 1 e 80 coliformes/100ml; Utilizar o critério descrito abaixo para proceder o ensaio presuntivo: Repicar todas as colônias quando a contagem total for inferior a 10 colônias; Repicar 10 colônias, quando a contagem total for igual ou superior a 10 colônias, sendo quando possível, 5 colônias típicas e 5 colônias atípicas; Raspar toda a placa quando a contagem de colônias típicas e atípicas de coliformes totais for superior a 80 coliformes/100ml e/ou quando o total de colônias de bactérias for superior a 200 coliformes/100ml ou ainda, quando houver crescimento confluente inviabilizando a contagem Ensaio presuntivo Transferir cada colônia ou raspar toda a placa utilizando alça de repique seguindo critério estabelecido em e para um tubo contendo o meio de cultura caldo lactosado com púrpura de bromocresol, de tal forma que cada colônia corresponda a um tubo, previamente identificado; Homogeneizar os tubos; Incubar todos os tubos a 35±0,5ºC, por 24±2 horas e mais 24±2 horas para tubos com resultados negativos; Após o período de incubação, realizar leitura e confirmar os tubos positivos no caldo lactosado (mudança de coloração de roxa para amarela) seguindo item Ensaio confirmativo para coliformes totais Inocular cada tubo com resultado positivo no Caldo Lactosado (CL) com auxílio da alça de repique para cada tubo contendo meio de cultura Caldo Lactosado Verde Brilhante e 13/12/

14 NTS 014 : 2005 Norma Técnica SABESP Bile 2% (CLVBB), de tal forma que cada tubo de CL corresponda a um tubo de CLVBB, previamente identificado; Incubar todos os tubos contendo meio de cultura CLVBB a 35±0,5ºC, por 24±2 horas e mais 24±2 horas para tubos com resultados negativos; Após o período de incubação, fazer leitura Ensaio confirmativo para coliformes termotolerantes Inocular todos os tubos com resultados positivos no Caldo Lactosado (CL) para um único tubo contendo meio de cultura Caldo EC, previamente identificado; Incubar o tubo com o meio Caldo EC em banho térmico, a 44,5±0,2ºC por 24±2 horas. Após o período de incubação, fazer leitura. 10 RESULTADOS 10.1 Ensaio presuntivo Aguardar o período de incubação e retirar os tubos com o meio CL e efetuar a leitura da seguinte maneira: - Resultado positivo: acidificação do meio evidenciada pela mudança de coloração do mesmo de roxa para amarela; - Resultado negativo: não acidificação do meio evidenciada pela não alteração da cor do mesmo (roxa) Ensaio confirmativo para coliforme total PRESENÇA/AUSÊNCIA Aguardar o período de incubação e retirar os tubos com o meio CLVBB e efetuar a leitura da seguinte maneira: - Se não houver gás no tubo de Durhan o resultado será dado como AUSÊNCIA de coliformes totais; - Se houver gás no tubo de Durhan o resultado será dado como PRESENÇA de coliformes totais Ensaio confirmativo para coliforme total QUANTIFICAÇÃO Aguardar o período de incubação e retirar os tubos com o meio CLVBB e efetuar a leitura da seguinte maneira: - Resultado positivo: presença de gás no tubo de Durhan; - Resultado negativo: ausência de gás no tubo de Durhan. Efetuar o cálculo do resultado final de coliformes totais quando houver diluição ou não, conforme descrito abaixo: Resultado final = N x P x f (coliformes/100ml) R Onde: N é o nº de colônias confirmadas de coliformes totais no CLVBB; P é nº total de colônias (típicas+atípicas) presentes na placa contendo m-endo agar les; R é nº de colônias submetidas à confirmação; f é o fator de diluição (quando houver) encontrado no item 9.1. Efetuar o cálculo do resultado final de coliformes totais quando houver DIVISÃO da amostra, conforme descrito abaixo: 12 13/12/2005

15 Norma Técnica SABESP NTS 014 : 2005 Resultado final = N x p x F (coliformes/100ml) R Onde: N é o nº de colônias confirmadas de coliformes totais no CLVBB; p é nº total de colônias (típicas+atípicas) presentes nas placas com quantidade inferior a 80 coliformes; F é o fator de divisão = 100 ml/v; R é nº de colônias submetidas à confirmação. Nota 11: O resultado final de coliformes totais (típicos e atípicos) poderá ser superior a 80 COLIFORMES tanto na técnica de diluição como de divisão. NOTA 12: Quando a contagem de colônias típicas e/ou atípicas de coliformes totais for superior a 80 coliformes/100ml ou quando houver crescimento confluente inviabilizando a contagem, expressar o resultado como maior que 80 coliformes/100 ml Ensaio confirmativo para coliforme termotolerante PRESENÇA/AUSÊNCIA Aguardar o período de incubação da amostra no tubo com meio de cultura Caldo EC e efetuar a leitura da seguinte maneira: Se não houver gás no tubo de Durhan o resultado será dado como AUSÊNCIA de coliformes termotolerantes; Se houver gás no tubo de Durhan o resultado será dado como PRESENÇA de coliformes termotolerantes. 11 BIBLIOGRAFIA Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater - 20ª edição /12/

16 NTS 014 : 2005 Norma Técnica SABESP Página em branco 14 13/12/2005

17 Norma Técnica SABESP NTS 014 : 2005 Coliformes Totais e Termotolerantes - Método de membrana filtrante Considerações finais: 1) Esta norma técnica, como qualquer outra, é um documento dinâmico, podendo ser alterada ou ampliada sempre que for necessário. Sugestões e comentários devem ser enviados à Assessoria para Desenvolvimento Tecnológico TVV. 2) Esta norma técnica seguiu as orientações dadas na NTS ) Tomaram parte na elaboração desta Norma: ÁREA UNIDADE DE TRABALHO M MCEC Maria Teresa Berardis NOME M MOEC Patrícia da Silva Franco M MSOC Márcia Cecília G. S. da Costa M MTO Moacir Francisco Brito R RAOC Anna Cristina Kira R RBOC Amélia Yoshie Ossugui R RGOC Luís Antônio Salomão R RMOC Denise de Oliveira R RMOC Marina R. de Moura Kaneno R ROA Mauro Ignácio R RSOC Lúcia Rodrigues de Ávila R RVOC José Aparecido Oliveira Lemes T TCCL Elvira Antonieta Simi T TCCL Ely Yamamura T TCCL José Borge Umbelino T TCCL Lígia Marino T TCCL Maria Célia Goulart 13/12/2005

18 NTS 014 : 2005 Norma Técnica SABESP Sabesp - Companhia de Saneamento Básico do Estado de São Paulo Diretoria de Tecnologia e Planejamento - T Assessoria para Desenvolvimento Tecnológico - TVV Rua Costa Carvalho, CEP São Paulo - SP - Brasil Telefone: (0xx11) / FAX: (0xx11) marcoabarbosa@sabesp.com.br - Palavras-chave: coliformes, determinação, contagem - 13 páginas 13/12/2005