CROMATOGRAFIA GASOSA - ANÁLISE DE ÁLCOOIS EM VINHOS
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- Daniel Bardini Abreu
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1 1 CROMATOGRAFIA GASOSA - ANÁLISE DE ÁLCOOIS EM VINHOS 1 - Objectivos Identificação e quantificação de constituintes maioritários em amostras de vinhos de mesa e de outras bebidas alcoólicas NOTA: Esta técnica não está completa pois o trabalho não vai ser realizado experimentalmente. 2 - Introdução A vinicultura destaca-se como das importantes actividades do nosso país. Embora desde sempre tenha havido meios de apreciação das qualidades das diferentes bebidas alcoólicas, até há alguns anos apenas se recorria a ensaios experimentais rudimentares e a opiniões de provadores experimentados. Actualmente, porém, a qualidade das bebidas tem de obedecer a rigorosos parâmetros determináveis por métodos bem definidos e objectivos, tornando crescente a necessidade de desenvolvimento de técnicas analíticas destinadas a controlar os vários constituintes característicos dos vinhos. A cromatografia em fase gasosa (CFG ou CG) é geralmente a técnica mais adequada para análise de amostras gasosas ou voláteis. Dado que muitas das subtâncias a analisar (diversos álcoois, ésteres e aldeídos) são facilmente volatilizáveis, não se alterando nas condições normais de trabalho de CG, esta técnica revela-se muito útil. Neste trabalho analisa-se etanol em diversas bebidas alcoólicas, pretendendose ainda identificar outros álcoois eventualmente presentes em algumas destas. Na figura seguinte, representa-se esquematicamente um equipamento de CG. Figura 1 - Representação esquemática de um cromatógrafo gasoso.
2 2 Usando uma seringa, introduz-se a amostra no injector que se encontra a uma temperatura previamente seleccionada de modo a que a amostra seja aí "instantaneamente" vaporizada e misturada com o gás arrastador (ou gás de arrastamento). O gás arrastador, designado por fase móvel, transporta os vapores da amostra através de uma coluna aquecida contendo uma fase estacionária. A configuração da fase estacionária poderá ser a de um enchimento contendo partículas - colunas de enchimento, ou a de colunas capilares. Nas colunas de enchimento as partículas poderão ser (i) ou de um sólido adsorvente, (ii) ou de um suporte sólido inerte recoberto de uma fase líquida não volátil (geralmente um polímero de elevado peso molecular). Este enchimento está contido no interior de uma coluna, normalmente de aço inoxidável ou vidro, com 2 a 6 m de comprimento e 3 a 5 mm de diâmetro interno. Se os constituintes da amostra tiverem alguma afinidade pela fase estacionária vão ser nesta retidos. A separação dos vários constituintes da amostra é feita na coluna: consoante são mais ou menos adsorvidos ou absorvidos na fase estacionária, levarão mais ou menos tempo a percorrer a coluna. A velocidade de progressão de um dado constituinte dependerá do caudal do gás de arrastamento, da temperatura a que se encontra a coluna e da natureza da fase estacionária. À saída da coluna encontra-se um detector. O tipo de detector mais usual em cromatografia gasosa, que é o utilizado neste trabalho, é o de ionização de chama (FID). Neste detector, o gás que sai da coluna é misturado com uma quantidade aproximadamente igual de hidrogénio e queimado numa atmosfera de ar (figura 2). Normalmente, os compostos orgânicos ao serem queimados nestas condições produzem iões, dando origem à passagem de corrente entre dois eléctrodos situados na zona da chama. O sinal assim obtido é amplificado e transmitido a um registador onde vai ser traçado o cromatograma, que poderá ser do tipo representado na figura 3. Cada pico corresponde a uma dada substância se a separação se estiver a realizar em condições adequadas; caso isso não suceda, os picos podem sobrepor-se parcialmente ou mesmo confundir-se. Em GC há uma tendência crescente para a utilização de colunas de diâmetro interno muito pequeno, que se designam por colunas capilares, que têm a vantagem de poder operar com quantidades de amostra muito pequenas, têm uma eficiência de separação elevada (número elevado de pratos - N) e permitem realizar as análises em tempos relativamente curtos. As colunas capilares são constituídas por tubos abertos (daí a designação de "open tubular") com diâmetros internos < 0,4 mm. Neste trabalho utilizar-se-á uma coluna coluna WCOT (do inglês "Wall Coated Open Tubular"), em que a "fase líquida" estacionária está aderende à parede interna da coluna (vd. figura 4) por forças de adsorção. As fases estacionárias utilizadas nas colunas capilares são do mesmo tipo das utilizadas nas colunas de enchimento. Utilizando-se uma coluna capilar é conveniente usar hidrogénio ou hélio como gás de arrastamento. O cromatógrafo a utilizar tem essencialmente as mesmas unidades do utilizado com colunas de enchimento mas (i) o regulador de caudal, (ii) o injector, (iii) a estufa termostatizada ("forno"), (iv) o detector e (v) o
3 3 amplificador terão de ser os adequados para o funcionamento com colunas capilares, em que a quantidade de amostra a introduzir é muito mais pequena. Figura 2 - Representação esquemática de um detector de ionização de chama. Figura 3 - Exemplo do que poderá ser um cromatograma. O uso da presente técnica em análise quantitativa baseia-se em que, em princípio, a área de cada pico detectado deverá ser proporcional à quantidade do composto correspondente presente na amostra injectada.
4 4 Figura 4 - Representação esquemática de uma coluna WCOT. Utilizando o detector FID, o grau de ionização de compostos distintos durante a queima é diferente, pelo que o factor de resposta do detector normalmente difere de componente para componente. Assim, para se fazer a quantificação têm de se determinar curvas de calibração para cada componente, o que é feito por injecções sucessivas de soluções padrão de composição e concentrações conhecidas. Além disso, como com os sistemas de injecção disponíveis não é possível fazer injecções de amostras líquidas com volumes rigorosamente controlados, tem de se introduzir nas amostras e nos padrões um padrão interno (ver apêndice). Doseamento de álcoois nos vinhos O teor em etanol de um vinho, depende da riqueza em açúcares das uvas e o seu conhecimento é de grande importância, pois faz parte de um conjunto de características que ajudam a definir um determinado tipo de vinho. A presença do acetaldeído, produto da oxidação do etanol, está relacionada com fenómenos de oxidação e de envelhecimento dos vinhos. Nos vinhos novos, o acetaldeído encontrase geralmente em concentrações que vão de 5 a 50 mg/l; parte do acetaldeído encontra-se livre e este é fundamental para o sabor e aroma próprio dos vinhos velhos. A determinação da concentração de metanol no vinho, assim como noutras bebidas alcoólicas, é importante em virtude deste álcool, pela sua toxicidade, ser muito possivelmente um dos mais responsáveis por certas formas crónicas de intoxicação alcoólica. A principal origem da presença deste álcool no vinho, encontra-se relacionada com a transformação das matérias péctidas das uvas. As doses encontradas nos vinhos variam entre 36 a 350 mg/l. Pretende-se, com este trabalho, determinar a concentração de etanol existente num vinho, assim como a concentração de metanol eventualmente presente em quantidade muito pequena. Deve ter-se cuidado para não confundir as bandas correspondentes ao metanol e acetaldeído. Em amostras de whisky e aguardentes pretende-se verificar a presença de álcoois C 3, C 4 e C 5. Utiliza-se uma coluna capilar com Carbowax (polietilenoglicol) como fase líquida estacionária.
5 5 Pretende-se ainda determinar a quantidade de alcóois num resíduo de destilação de uma aguardente. Para a determinação quantitativa usa-se o método do padrão interno, neste caso o isobutanol. Preparam-se padrões adicionando em todos a mesma quantidade de isobutanol e quantidades diferentes e adequadas dos outros constituintes. 3 Parte experimental Material e reagentes Crómatografo Fisons GC 8130 Coluna capilar WCOT (L = 30 m, f interno = 0,25 mm, filme líquido de 0,25 mm de espessura) Pipetas e balões volumétricos Seringa de 1 ml Condições operatórias Os caudais dos diversos gases são ajustados de acordo com as marcações nos manómetros do aparelho. Poderá ser necessário ajustar as razões de split do injector. A temperatura da coluna poderá manter-se constante (eluição isotérmica) podendo iniciar-se com uma temperatura de 50 ºC. Conforme a retenção e separações observadas poder-se-á alterar as condições do cromatograma. 5 - Questionário ATENÇÃO : PARA A DISCUSSÃO, OS ALUNOS DEVERÃO PENSAR EM COMO RESPONDER ÀS SEGUINTES QUESTÕES : 1) - Discuta a possibilidade de substituição do hidrogénio como gás de arrastamento por azoto, nomeadamente no que respeita à forma da curva de Van Deemter. Considere separadamente a utilização de uma coluna capilar e de uma coluna de enchimento. 2) - Justifique porque razão é vulgar utilizar, para colunas capilares, uma velocidade para o gás de arrastamento diferente do valor óptimo (correspondente ao mínimo na curva de Van Deemter). 3) - Quais as vantagens da utilização de colunas capilares relativamente a colunas de enchimento com o mesmo tipo de fase estacionária? E quais os inconvenientes? 6- Bibliografia
6 6 1) G.W. Ewing, Instrumental Methods of Chemical Analysis, McGraw-Hill Book Co., New York, 5ª ed., 1985, p ) J.H. Harris, Analyst, 1970, 95, ) D.A. Skoog e J.J. Leary, Principles of Instrumental Analysis, Saunders Coll. Publ., 4ª ed., Fort Worth, 1992, p ) D.A. Skoog, D.M. West e F. J. Holler, Fundamentals of Analytical Chemistry, 6ª ed., Saunders Co. Publ., Fort Worth, 1992, p ) H. Willard, L.L. Merrit, Jr., J.A. Dean e F.A. Settle, Instrumental Methods of Analysis, Wadsworth Publ. Co., Belmont, 1988, p ) J.E. Willet, Gas Chromatography, ed. ACOL, John Wiley & Sons, Chichester, ) I. A. Fowlis, Gas Chromatography, ed. ACOL, John Wiley & Sons, Chichester, ) K. Grob, Anal. Chem., 1994, 66, 1009A-1017A. 9) J.V. Hinshaw, LC-GC Intern., 1993, 6, ) J.V. Hinshaw, LC-GC Europe, 2002, February, Na biblioteca do DEQ está disponível a revista LC-GC Europe, que tem diversos artigos com interesse em GC de carácter didáctico. APÊNDICE I - Método do padrão interno De uma maneira geral recorre-se a esta técnica sempre que num método analitíco é difícil manter inalteráveis as condições operatórias, ou quando a amostra a analisar é sujeita a pré-tratamentos e existir o risco de o(s) componente(s) a analisar sofrerem perdas parciais ou transformações. No caso da Cromatografia Gasosa a necessidade de recorrer ao método do padrão interno deve-se principalmente ao erro cometido na medição e injecção de pequenos volumes de amostra. Na verdade, a injecção faz-se por meio de microseringas que nem sempre funcionam perfeitamente, ao que se juntam os erros do operador no que respeita à dificuldade de visualização do líquido e à velocidade de accionamento do êmbolo, que influencia também o modo como a amostra vai atingir a coluna. Variações do caudal de gás de arrastamento ou alterações nas temperaturas programadas são factores que, embora em menor grau, também contribuem para que seja mais conveniente usar o método do padrão interno. Na utilização de injectores com divisores de fluxo as incertezas na quantidade de amostra que é introduzida na coluna dependem ainda de outros factores (ver aulas de Análise Química I e consultar bibliografia). Neste método escolhe-se uma substância para padrão interno a qual é adicionada na mesma proporção a todas as soluções a ensaiar, quer padrões quer amostras problema. A escolha do padrão interno depende da composição da mistura em ensaio. Terá de ser diferente de qualquer dos constituintes
7 7 da mistura, não reactivo com estes e a resolução entre o respectivo pico e os picos dos constituintes da amostra deverá ser boa. Se as condições operatórias se mantiverem inalteradas, os picos correspondentes ao padrão interno teriam exactamente a mesma área em todos os cromatogramas. Na realidade isto não se verifica e há sempre maiores ou menores diferenças nas áreas destes picos para injecções diferentes; no entanto, admite-se que estas variações são proporcionais às que afectam os picos referentes aos outros constituintes. Se isto for válido, as razões entre as áreas dos picos dos diversos constituintes e as dos picos correspondentes ao padrão interno, (A soluto /A padrão ), manter-se-ão aproximadamente proporcionais às concentrações do soluto a determinar. Traduzindo de uma forma quantitativa o que se acabou de referir, tem-se que, como a área sob o pico do etanol é proporcional à quantidade de composto eluído: A i et = f et m i et = f et d et v i et = f et d et c i et V em que: A i et - área sob o pico do etanol do padrão i f et - factor de resposta do detector para o etanol m i et - massa de etanol eluído correspondente ao padrão i d et - densidade do etanol v i et - Volume correspondente ao etanol no padrão i C i et - concentração do etanol, expressa em % volumétrica no padrão i V - volume total de solução do padrão injectada. Pode escrever-se uma relação idêntica para o isobutanol (padrão interno - pr) na qual as letras têm significado semelhante às do caso anterior: A i pr = f pr d pr c i pr V Calculando agora a razão das áreas: em que: A i et f et d et c i et V c i et = = K A i pr f pr d pr c i pr V c i pr f et d et K = f pr d pr
8 8 padrões. Verifica-se portanto que A i et /A i pr é proporcional a c i et, se c i pr se mantiver o mesmo em todos os Traçam-se as curvas de calibração tomando para ordenadas estas razões de áreas e para abcissas as várias concentrações do constituinte respectivo. Na prática estas curvas de calibração são a recta mais provável que passa pelos pontos experimentais. Se a(s) amostra(s) a analisar tiver(em) sido preparada(s) de modo idêntico aos padrões, em particular se a concentração de padrão interno for a mesma, determinando as razões das áreas, por simples interpolação pode obter-se a concentração do constituinte a determinar. As áreas das bandas obtidas podem determinar-se multiplicando a altura pela largura a meia altura, admitindo-se para isso que as bandas têm a forma de uma curva de Gauss. Quando estas são muito estreitas, a determinação da largura de banda a meia altura dá erros excessivos e é preferível determinar apenas a razão das alturas das bandas.
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