CAMILA ESPINDOLA FRANCIELLE KARIME SALEH ZANETTI ANÁLISE MORFOLÓGICA DA PAPILA DENTAL TRANSPLANTADA EM BOLSAS RECEPTORAS NA ORELHA DE RATOS

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1 1 CAMILA ESPINDOLA FRANCIELLE KARIME SALEH ZANETTI ANÁLISE MORFOLÓGICA DA PAPILA DENTAL TRANSPLANTADA EM BOLSAS RECEPTORAS NA ORELHA DE RATOS Trabalho de Conclusão de Curso apresentado como requisito parcial para obtenção do título de cirurgião-dentista do Curso de Odontologia da Universidade do Vale do Itajaí. Orientador: Prof. David Rivero Tames. Itajaí (SC), 2011

2 1 CAMILA ESPINDOLA FRANCIELLE KARIME SALEH ZANETTI ANÁLISE MORFOLÓGICA DA PAPILA DENTAL TRANSPLANTADA EM BOLSAS RECEPTORAS NA ORELHA DE RATOS O presente Trabalho de Conclusão de Curso apresentado como requisito parcial para obtenção do título de cirurgião-dentista do Curso de Odontologia da Universidade do Vale do Itajaí, aos 20 dias do mês de outubro do ano de dois mil e onze, é considerado aprovado. 1. Prof. Davi Rivero Tames Curso de Odontologia da Universidade do Vale do Itajaí (UNIVALI) 2. Prof. Telmo J. Mezadri Curso de Odontologia da Universidade do Vale do Itajaí (UNIVALI) 3. Prof. Francisco C. S. Aranha Curso de Odontologia da Universidade do Interior (UNIVALI)

3 2 ANÁLISE MORFOLÓGICA DA PAPILA DENTAL TRANSPLANTADA EM BOLSAS RECEPTORAS NA ORELHA DE RATOS. Camila ESPINDOLA e Francielle Karime Saleh ZANETTI Orientador: Prof. David Rivero TAMES Data da defesa: outubro de 2011 Resumo: Esta pesquisa tem por objetivo analisar a evolução das diferenciações celulares e a síntese e secreção de matrizes relacionadas com a estruturação do dente em transplantes autólogos de papila dental de incisivos de ratos em bolsas receptoras na derme da orelha. Com esta finalidade foram utilizados 10 ratos (Rattus Norvegicus Albinus) machos com 45 dias de idade e sob anestesia foram preparadas bolsas subcutâneas em ambas as orelhas, após obtenção da papila apical do incisivo, a metade lingual foi transplantada na bolsa receptora da orelha esquerda e a vestibular na direita. Sete dias após os locais de transplante foram removidos e processados para análise em microscopia de luz transmitida, a morfologia do tecido embrionário. Os resultados obtidos sugerem que o implante da região vestibular da papila promove reação inflamatória mais intensa que o implante da papila lingual; esta inflamação, presente em ambos os implantes não elimina a sobrevivência das células embrionárias e que em ambos implantes ocorre a diferenciação celular originando um tecido mineralizado semelhante à dentina terciária de reparo. Palavras-chave: Dentinogênese, odontoblasto, papila dental, transplante.

4 3 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA MATERIAIS E MÉTODOS APRESENTAÇÃO DOS RESULTADOS DISCUSSÃO CONCLUSÃO REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...40

5 4 1 INTRODUÇÃO A engenharia tecidual, no reparo da perda estrutural de órgãos, avançou de tal forma que já faz parte de um campo do conhecimento multidisciplinar, onde se integram a biologia, ciências médicas e várias da engenharia. Neste contexto os procedimentos de transplantes autólogos (materiais obtidos do mesmo indivíduo em quem será realizado o transplante) visam eliminar a necessidade da imunoterapia permitindo um retorno mais adequado da normalidade funcional, e por isso são os mais indicados nos procedimentos de reparo. A necessidade de desenvolver técnicas de substituição tecidual é particularmente importante nos procedimentos bucomaxilofaciais devido à complexidade fisiológica das estruturas orofaciais como a expressão facial, articulação das palavras, mastigação, deglutição, etc. que requerem a participação integrada de tecidos moles (como a pele, mucosa, músculos, nervos) e tecidos duros (como o osso e dentes). Já está demonstrado que as células tronco dentais têm potencialidade de reparo estrutural do complexo polpa-dentina (células tronco da papila dental) e do periodonto de inserção (células tronco do ligamento periodontal). A papila apical do incisivo do rato é importante nos estudos de reparo tecidual por três motivos: 1) permitem transplantes autólogos em animais adultos, 2) tem uma região contendo células tronco semelhantes aos da papila dental, por ser uma área que também induz a formação de esmalte dental e 3) tem uma região contendo células tronco semelhantes ao da papila apical, contendo uma área de formação de cemento e ligamento periodontal. Sabe-se que a papila dental, devido à sua interação molecular com o epitélio, tem potencial de induzir a odontogênese em transplantes numa grande variedade de órgãos. Embora seja conhecido que as estruturas conjuntivas da cabeça tenham origem ectomesenquimal, não há dados indicando a possibilidade e a dinâmica da continuidade do mecanismo de odontogênese de papila transplantada na orelha de rato. Neste estudo pretendemos obter dados sobre o comportamento de transplantes em tecido subcutâneo de amostras de papila apical do incisivo do rato, das regiões vestibular e lingual, onde já é conhecida a existência de células tronco que ao interagir com o epitélio da alça cervical elabora dentina revestida por esmalte

6 5 na região vestibular e dentina revestida por cemento com inclusões de fibras de Sharpey do ligamento periodontal na região lingual, fatos estes que a assemelham as formações de coroa e raiz dental dos molares do rato; pretendemos assim, fornecer dados sobre o comportamento biológico das células embrionárias destas regiões em transplantes autólogos.

7 6 2. REVISÃO DE LITERATURA Weiss, Stock e Zhao (1998) afirmaram que a dentição dos mamíferos constitui um sistema de órgãos segmentado e periodicamente distribuído em número e localizações diferentes no eixo da mandíbula e maxila. A autonomia do desenvolvimento dos germes dentários mostra que a padronização dental básica é determinada nos primeiros períodos da embriogênese. As naturezas periódicas de sua localização, número e estrutura morfológica do dente sugerem o envolvimento de mecanismos que promovem interações quantitativas de fatores de sinalização difusíveis. Assim, já foram identificadas moléculas sinalizadoras extracelulares e suas interações que podem ser responsáveis pela localização dos dentes ao longo da maxila e mandíbula, bem como para a formação da região dos incisivos. Da mesma forma, ondas de expressão de fatores de sinalização dentro do embrião dental sugerem uma interação dinâmica entre esses fatores para padronizar a morfologia coronária. Esses fatores parecem ser similares entre os diferentes tipos de dentes, porém as diferenças das formas coronárias podem ser explicadas somente em termos de variações nos parâmetros de interação entre os mesmos genes. Existem evidencias de que combinações de expressão intracelular de fatores de transcrição, incluindo a família de genes homeobox, podem estabelecer domínios dentro da arcada dental nos quais diferentes tipos de dentes podem se desenvolver. Nakashima et al. (2002) afirmaram que o fator de crescimento de diferenciação celular (Gdf11) é um membro da família de fatores de crescimento já conhecidos: BMP (proteína morfogenética óssea) e TGF-beta (fator transformador de crescimento-beta) e é expressado no odontoblasto na fase terminal de sua diferenciação, indicando sua participação na diferenciação das células tronco pulpares em odontoblastos. Neste estudo os autores investigaram se a transferência do gene responsável pela síntese de Gdf11 pode estimular a diferenciação de odontoblastos e a formação de dentina terciária de reparo em cultura de células e in vivo. O vetor contendo o gene para Gdf11 foi um plasmídio (para evitar efeitos colaterais que os vetores virais ocasionam como a resposta imune e outros) e para resolver a baixa capacidade que os plasmídios têm em liberar o gene, utilizaram a eletroporação (eletroporation) que consiste no uso de pulsos de campos elétricos que é um potente estimulante da transferência de DNA. A diferenciação de

8 7 odontoblastos formando dentina foi monitorada evidenciando três marcadores diferentes: Proteína de matriz dentinaria1 (Dmp1), sialoproteína dentinária (DSP) e Osteocalcina. A evidenciação destes marcadores in vitro sugeriu que o Gdf11 tem um papel importante na diferenciação terminal do odontoblasto. Após terem observado que Gdf11 é expresso na fase terminal da diferenciação do odontoblasto, os autores observaram, in vitro, que quando micro-esferas embebidas com Gdf11 recombinante humano, entraram em contato com mesênquima da papila de embrião dental de camundongo com 17,5 dias de pós-fecundação, as células vizinhas as micro-esferas expressam RNAm para a síntese de sialoproteína dentinária (DSP), sugerindo que GDF11 estimula a diferenciação de células tronco em odontoblastos. A eletroporação de Gdf11 em polpas amputadas de dentes de cão mostrou a diferenciação de células odontoblasticas e formação de dentina terciária de reparo com aparência óssea (osteodentina semelhante ao promovido com BMP2 e 4) um mês após a cirurgia. Com estes resultados, os autores sugerem implicações importantes da terapia gênica na odontologia. Nakashima et al. (2004) com a finalidade de desenvolver uma terapia gênica capaz de induzir formação rápida e efetiva de dentina reparadora, desenvolveram um sistema de cultura em pellet tridimencional de células pulpares eletrotransferidas com fator de crescimento estimulante de diferenciação celular-11 (Gdf11). Os testes de viabilidade celular após a eletrotransferência foi maior a 85%. 10 dias após a cultura a quantidade de colágeno tipo I e III foi 3 vezes maior no pellet contendo Gdf11. As análises com PCR demonstraram que a expressão de marcadores da diferenciação de odontoblastos: fosfatase alcalina, proteína de matriz dentinária1 (DMP1), sialofosfoproteína dentinária (Dspp), enamelisina, gene regulador de fosfato homologo de endoperoxidase, foram aumentadas no pellet com eletrotansferência de Gdf11 14 dias após. Com base nestes resultados in vitro, foi realizado um experimento in vivo transplantando o pellet de células cultivadas transferidas de Gdf11 sobre polpas amputadas de cães que resultou no estímulo da formação de dentina de reparo, com esses resultados os autores concluíram que a terapia gênica tem um potencial de uso na terapêutica endodôntica. Sonoyama et al. (2006) tiveram como finalidade, avaliar o potencial indutor de dentinogênese, para isso foram transplantados em tecido subcutâneo de camundongos um complexo de hidroxiapatita/fosfato tricálcico revestido com células tronco da papila apical, e 8 semanas após obtiveram a formação de uma camada de

9 8 dentina e cemento com fibras de Sharpey, caracterizadas histologicamente na superfície do complexo carregador, sugerindo que as células tronco da papila apical humana, promoveram a dentinogênese e a gênese do periodonto de inserção. Utilizando o mesmo protocolo e com a finalidade de preparar células tronco autólogas, para gerar uma função dental normal em mini-porcos, células tronco da papila apical e do ligamento periodontal foram isoladas e transplantadas em camundongos, obtendo a formação de dentina e cemento dental equivalente ao que é observado em humanos. Para avaliar a possibilidade de gerar uma prótese dental funcional, foi extraído o incisivo de mini-porco, e neste alvéolo foi implantado uma raiz artificial de hidroxiapatita e fosfato tricálcico contendo na sua massa interna (microporos) células tronco autólogas da papila apical e coberto externamente com um gel, contendo células tronco autólogas do ligamento periodontal. Três meses após, observou-se a formação de periodonto de inserção e sobre o complexo hidroxiapatita/fosfato tricálcico foi inserida uma coroa, pré fabricada, de porcelana, imitando o formato anatômico do incisivo do mini-porco e submetido ao processo da função dental durante 4 semanas. As análises de tomografia computadorizada e histológica comprovaram a regeneração da raiz e do periodonto de inserção. Ye et al. (2006) sabendo que as amelogeninas constituem as principais proteínas da matriz extracelular da fase de secreção da amelogênese, caracterizadas pela sua heterogeneidade durante a formação dental e que também tem sido observadas em odontoblastos, sem a existência dados sobre o padrão de sua expressão no complexo polpa-dentina e nem sobre sua função na formação e reparo do complexo polpa-dentina, os autores se propuseram estudar a sua expressão e função neste complexo. Em embriões dentários de fetos humanos com aproximadamente 22 semanas, utilizando métodos de imuno-histoquímica em cortes obtidos por criomicrotomia; hibridização in situ para marcação do RNA mensageiro para amelogenina. Também foi observada a proliferação, ciclo e diferenciação celular em cultura de tecidos. Os resultados mostraram que as amelogeninas são expressas tanto na papila dental de embriões dentários antes da fase de secreção da matriz da amelogênese, bem como na camada de odontoblastos de polpas adultas humanas; o RNAm para amelogenina foi localizado na matriz dentinária e nos ameloblastos secretores. Com estes dados, os autores concluem que a transcrição do RNAm para amelogenina e a síntese da proteína amelogenina, estão presentes durante o desenvolvimento da matriz da dentina humana, entretanto

10 9 advertem que a função da amelogenina na formação da matriz da dentina ainda não é conhecida, estimula a proliferação das células da polpa dental sugerindo que estas proteínas possam ser utilizadas na indução de proliferação do tecido pulpar com o resultado de formação da dentina de reparo. Wang et al. (2007) afirmaram que o incisivo de camundongo cresce continuamente através de toda sua vida e contem células tronco na sua extremidade proximal na região denominada de alça cervical. Experimentos com camundongos mutantes, cultura de órgãos e expressão gênica permitiram estudar sinalizadores moleculares importantes que regulam a proliferação das células tronco epiteliais na região da alça cervical, e permitiram mostrar que sinalizações do tecido mesenquimal adjacentes regulam as células tronco epiteliais e formam uma rede complexa reguladora com sinalizadores epiteliais. Assim, o FGF3 (fator de crescimento de fibroblastos) estimula a proliferação das células tronco epiteliais, o BMP4 (proteína morfogenética óssea) reprime a expressão do FGF3, ativina inibe o efeito do BMP4 e a folistatina antagoniza a atividade da ativina; as diferenças nos níveis de ativina e a expressão da folistatina contribuem para a assimetria característica do incisivo de roedores, que é coberto por esmalte somente na sua superfície vestibular. É sugerido neste estudo, que variações nas redes moleculares reguladoras possam explicar as diferenças nas capacidades regenerativas e assimetrias de desenvolvimento de vários órgãos e espécies animais. Huang et al. (2008) revisam os dados encontrados na literatura sobre o isolamento e caracterização das células tronco pulpares e discutem sua contribuição na continuidade da maturação radicular em dentes imaturos endodonticamente tratados e seu potencial na sua utilização para regeneração do complexo polpadentina e na engenharia bioradicular. A papila dental localizada no ápice de um dente permanente humano é denominada de papila apical, é um tecido fracamente fixado ao ápice da raiz em desenvolvimento e pode ser facilmente removido com um par de pinças. Comunicam a existência de dados que demonstram a presença de células tronco tanto na polpa dental como na papila apical e que ambas tem algumas características diferenciais e que devido a sua localização a papila apical pode se beneficiar de uma circulação colateral que lhe permite sobreviver durante processos de necrose pulpar. A importância da biologia das células tronco mesenquimais tem por base duas propriedades: a capacidade de renovação própria e que as células oriundas de sua divisão mitótica podem permanecer como células

11 10 fonte ou originar células diferenciadas incluído osteogênicas, condrogênicas, adipogênicas, miogênicas e neurogênicas. Informam que as células tronco mesenquimais foram inicialmente, nos anos 1860, identificadas como células fibroblasto semelhantes, uma década mais tarde foram observadas como unidades fibroblasticas formadoras de colônias com a capacidade de promover diferenciação osteogênica, e mais tarde foi descoberta sua diferenciação condrogênica e adipogênica em resposta a diferentes sinais bioquímicos. Entre as células tronco mesenquimais as mais estudadas são as de origem da medula óssea com grande capacidade de diferenciar vários tipos celulares, porém não existe referencias sobre sua capacidade de diferenciação dentinogênica. O primeiro tipo de célula tronco dental humano foi isolado da polpa de terceiros molares extraídos e caracterizados por comparação com células mesenquimais da medula óssea, foram denominadas de células tronco da polpa dental, principalmente por sua capacidade de diferenciar células semelhantes à odontoblastos formando complexos semelhantes ao da polpadentina quando implantadas no tecido subcutâneo. Subseqüentemente foram isoladas células tronco de dentes decíduos esfoliados, do ligamento periodontal e da papila apical. Nesta revisão os autores encontraram dados que caracterizam a papila apical contendo uma população única de células tronco pós natais que podem constituir a melhor fonte de células para a regeneração tecidual e que além de diferenciar células dentinogênicas entre outras, tem o diferencial de ter maior capacidade neurogênica do que as células tronco da medula óssea. Observem que na literatura existem dados mostrando que as células tronco da papila dental tem potencial de dar continuidade a formação da raiz, regeneração e reparo pulpar, manutenção estrutural e funcional nos reimplantes e transplantes, eficácia na engenharia tecidual para regenerar e reparar o complexo polpa-dentina e regeneração do periodonto de inserção em implantes de raízes artificiais; salientam que estes dados caracterizam a papila dental como uma fonte de alta qualidade para a regeneração pulpar, quando comparados com as células tronco da polpa dental e da polpa de dentes decíduos (fonte de odontoblastos secundários), porque são fonte em atividade para a diferenciação de odontoblastos primários. Os autores concluem salientando que o uso destas células junto com um sistema de matriz que aperfeiçoe sua proliferação e diferenciação poderá um dia ser utilizado para ser inserido dentro de canais de dentes imaturos e permitir a regeneração da polpa e dentina. Salientem que o entendimento da biologia das células tronco dentais e os princípios

12 11 de engenharia tecidual e regeneração proporcionam uma base sólida sobre a qual os planos de tratamento clínico poderão ser formulados, como por exemplo, no tratamento de dentes imaturos com infecção endodôntica. Embora sejam necessárias muitas pesquisas para conhecer o papel das células tronco da papila apical na continuidade da formação da raiz após endodontia, as observações clínicas do alto potencial reparador em dentes imaturos favorecem a possibilidade do seu uso nos processos de regeneração. Prescott et al. (2008) tiveram como objetivo estudar a terapia endodôntica regenerativa de perfurações de canal radicular, para isso foi estudado a organização e diferenciação de células tronco pulpares obtidos de terceiros molares inclusos humanos em um modelo de simulação de perfuração de furca. Como fator de crescimento foi usado Proteína de matriz dentinária 1 e como carregador uma rede de colágeno. Discos de dentina, com 2mm de espessura, contendo o assoalho da câmara pulpar de terceiros molares inclusos foram preparados e neles realizados perfurações de assoalho com 1mm de diâmetro, estes foram divididos em 5 grupos (4 por grupo). As células tronco foram cultivadas e misturadas com colágeno obtido da matriz de osso e transplantados nos discos de dentina, dos grupos experimentais, para posterior implantação no tecido subcutâneo da região dorsal de camundongos imunodeficientes. No grupo 1 as perfurações foram preenchidas somente com MTA, no grupo 2 com matriz de colágeno misturada com cerâmica, no grupo 3 matriz de colágeno impregnada com proteína de matriz dentinária, no grupo 4 com colágeno impregnado com células tronco de polpa dental e proteína de matriz dentinária e no grupo 5 colágeno impregnado com células tronco de polpa dental. Seis semanas após o implante os camundongos foram sacrificados e os implantes fixados, desmineralizados e incluídos em parafina para exame histológico. Somente no grupo 4 que continha os 3 componentes básicos para a terapia regenerativa: células tronco, matriz carregadora e fator de crescimento, ocorreu sinais de regeneração mostrando degradação da matriz de colágeno carregadora, presença de células tipo fibroblastos, células endoteliais rodeadas de nova matriz, vasos sangüíneos e matriz de colágeno que foram visualizados dentro da local da perfuração. As regiões externas a perfuração mostraram proliferação celular indicando a progressão da regeneração tecidual. Concluem que existe potencialidade de regeneração tecidual com formação de tecido mineralizado no local da perfuração e sugerem a continuidade de estudos nesta linha.

13 12 Sonoyama et al. (2008) relatam que células tronco isoladas da papila apical (SCAP) de terceiros molares humanos impactados, com raiz imatura, células tronco da polpa dental (DPSC) obtidos de doadores voluntários com idade, entre 18 e 20 anos e células tronco de medula óssea obtidas de pacientes doadores com idade de 20 anos, submetidos a cirurgia ortopédica, foram cultivadas e subcultivadas a 1:3 até atingir 85% de confluência. Neste material foi estudado o estímulo para a diferenciação celular, adicionando aos meios de cultura indutores de Osteogênese, Dentinogênese, Adipogênese e Neurogênese. Os resultados mostraram que a papila apical tem características macroscópicas peculiares como o brilho superficial e que é facilmente destacada da polpa dental, no limite entre estas duas regiões, a microscopia mostrou a existência de uma zona rica em células e que a papila apical tem menos componentes vasculares e celulares do que a polpa. A potencialidade de diferenciar células para formar tecido ósseo ou dentinário, mensurado pela acumulação de cálcio nos meios de cultura, foi semelhante entre as células tronco da papila apical, polpa dental e medula óssea; porém a potencialidade de adipogênese foi maior nas culturas de células tronco da medula óssea. A análise de expressão gênica (imunofenotipo) mostrou que as células tronco da papila apical e da polpa dental, tem expressões similares para genes osteogênicos e dentinogênicos e para fatores de crescimento, Porém, nas culturas de células tronco da papila apical foi também observado marcação para neurogênese. Algumas amostras das raízes dos dentes extraídos, contendo polpa e papila apical foram cultivados e marcados com BrdU durante 3,5 e 18 horas, processados para incluir em parafina com a finalidade de analisar, imunohistiquimicamente, a proliferação celular in situ usando anticorpos antibrdu e foi observado que as células da papila apical tem entre 2 a 3 vezes mais marcas positivas que as células da polpa dental nos períodos de 3,5 e 18 horas sugerindo que as células da papila apical uma vez em contato com o meio de cultura iniciam seu ciclo de crescimento mais rápido do que as células da polpa dental. Com estes resultados concluem que as células tronco da papila apical, expressam vários marcadores semelhantes as das células da medula óssea e que são capazes de originar células tipo odontoblastos e produzir dentina, caracterizando-os como células fonte de odontoblastos primários, para a formação de dentina radicular e sugerem a realização de mais pesquisas para obtenção de dados sobre as inter-relações celulares entre si, com as células da

14 13 zona de condensação celular e da polpa dental verificando seus potenciais de diferenciar odontoblastos Catón e Tucker (2009) concentraram sua revisão na dentição do camundongo, por terem observado que uma grande quantidade de informações relacionada com a biologia molecular do desenvolvimento do dente foi obtida em investigações utilizando modelo animal de camundongo. Salientam que este modelo é excelente para estudos sobre o desenvolvimento (odontogenese) nos controles da morfologia dental e dos mecanismos de sinalização na interação epitéliomesenquimal que levam a formação de um molar ou de um incisivo, particularmente o incisivo do camundongo que por ser de crescimento contínuo proporciona possibilidades de estudo no campo das células tronco, nichos celulares de células tronco e engenharia tecidual; assim, foi descoberto que o fator de transcrição folistatina, induzido pela ativina do folículo dental é expressado fundamentalmente na região da alça cervical lingual e que por sua vez inibe a expressão de ativina na papila dental; a ausência de ativina nesta área permite a inibição do FGF (fator de crescimento de fibroblastos) pelo BMP4 (proteína morfogenêtica óssea) que dispara uma reação inibitória de várias moléculas em cascata na papila dental que culminam com a inibição da diferenciação do ameloblasto na alça cervical lingual, entretanto, observam que faltam dados num grande número de pesquisas recentes que permitam um melhor domínio dos conhecimentos sobre o desenvolvimento dental. D aquino et al. (2009) conhecendo a situação clínica e que a extração de terceiros molares impactados, frequentemente provoca defeitos na cortical do osso alveolar com perda media de 7mm na sua altura, colocando em risco o segundo molar ou a sua perda, em media cinco anos após e não ocorrendo reparo espontâneo nem com o uso das técnicas normais, estudaram o potencial reparador destes defeitos ósseos utilizando transplante autólogo de células tronco pulpares humanas. Para tanto, identificaram pacientes com risco de perda óssea pósextração de terceiros molares inferiores impactados, apresentando situações semelhantes bilateralmente para utilizar um lado como teste e o outro como controle. Antes de realizar as extrações dos dentes impactados, obtiveram células tronco pulpares, por isolamento em cultura celular de polpas dos seus terceiros molares superiores; após extração dos terceiros molares impactados, a loja óssea junto à raiz distal do segundo molar foi curetada e irrigada com salina para remover todos os restos necróticos; a seguir, as células tronco obtidas foram cuidadosamente

15 14 colocadas, com ajuda de uma seringa, dentro de uma esponja de colágeno e implantado dentro da loja cirúrgica no alvéolo experimental e somente a esponja no alvéolo controle e as bordas da gengiva suturadas para isolamento da ferida óssea. Sete dias após extração, as radiografias não evidenciaram diferenças entre os grupos e 3 meses após as radiografias dos alvéolos experimentais mostraram regeneração completa com a altura de suas corticais ósseas maiores que os dos alvéolos controle; neste período (3 meses) as colheitas de osso, com cirurgia miniinvasiva, processadas para observação microscópica, mostraram uma estruturação, no osso dos alvéolos experimentais, lamelar com sistemas de Havers bem organizado e vascularizada enquanto que as amostra controle exibiram osso imaturo, fibroso incluída entre lamelas novas, sistemas de Havers incompletos com canais centrais muito largos e evidencias de reabsorção. Em todos os casos a esponja de colágeno foi totalmente reabsorvida. Os autores concluíram que: as células tronco pulpares podem ser utilizadas para reparo de defeitos ósseos com impossibilidade de reparo espontâneo, que a esponja de colágeno reabsorvível contendo células tronco é um complexo eficiente e que as esponjas de colágeno podem ser consideradas um suporte ótimo para as células tronco na obtenção de uma regeneração guiada. Com a finalidade de discutir o isolamento e a caracterização das propriedades de diferentes populações de células tronco mesenquimais de tecidos dentários em comparação com as de outras células tronco mesenquimais como as da medula óssea HUANG, GRONTHOS e SHI (2009), realizaram uma revisão da literatura. Na caracterização das células tronco mesenquimais da medula óssea indicam que estas formam colônias fibroblásticas com a capacidade de diferenciar células osteogênicas, formam colônias de outras células tronco clonogênicas como as células hematopoiéticas, têm capacidade de auto-renovação e estão limitadas no seu potencial de crescimento de 30 a 50 duplicações populacionais, é uma população heterogênea de células, que podem ser caracterizadas pelos marcadores de superfície de membrana, indicando a existência de células em diferentes estágios de imaturidade na via de diferenciação celular dificultando a identificação exata do fenótipo. Na sua capacidade de diferenciação observa-se: osteogênese, condrogênese, adipogênese, mielogênese e neurogênese. Devido a dificuldades na obtenção das células tronco mesenquimais da medula óssea como dor, morbidade, e obtenção de número baixo de células, tem sido investigado fontes alternativas de

16 15 células tronco mesenquimais; neste contexto a polpa dental surge como alternativa viável que devido a sua interação inicial com a crista neural possibilitam características diferentes às de origem da medula óssea e a assemelham na sua potencialidade às células da crista neural. Até o presente momento cinco tipos diferentes de células tronco dentárias foram isoladas e caracterizadas do dente humano: Células tronco da polpa dental (DPSCs), de dentes decíduos esfoliados (SHED), de células do ligamento periodontal (PDLSCs), da papila apical (SCAP) e progenitoras do folículo dental (DFPCs). As células tronco derivadas de tecidos dentários são isoladas de tecidos especializados e tem potencial de diferenciação em células odontogênicas e também de originar outras linhagens similares, porém com diferente potencialidade, que as células tronco mesenquimais da medula óssea (BMMSCs). Os tecidos dentários são especializados e não tem mecanismo remodelador como o tecido ósseo; desta forma, as células tronco derivadas de tecido dental podem ter um potencial de diferenciação restrito em comparação com as da medula óssea; além disto, constituem o ectomesenquima devido a sua interação inicial com a crista neural. Desde esta perspectiva as células tronco derivadas do ectomesenquima podem possuir características que os assemelhe com as células da crista neural. Koussoulakou, Margaritis e Koussoulakos (2009) com a finalidade de proporcionar informações sobre a evolução, morfogênese e reparo biológico dos dentes, realizaram uma revisão da literatura, neste trabalho informam que nossos ancestrais, peixes ágnatas, tinham estruturas dermais, semelhantes aos dentes e que no transcurso de de anos não só migraram para a boca, como também ocorreu que o número de dentes por dentição geralmente diminuiu e a complexidade morfológica dental aumentou, em virtude das necessidades de dieta e mastigação que surgem como fatores principais na regulação da evolução dental e dos músculos mastigatórios para permitir o máximo aproveitamento da energia calórica dos alimentos. A diversidade morfológica dos dentes na sua localização na cavidade oral (incisivos molares), ocorre em conseqüência a interações entre grupos específicos de genes homeobox PAX, BARX, DLX nas células mesenquimais originadas na crista neural e fatores de crescimento como FGF e BMP no epitélio oral, sendo que as secreções epiteliais induzem as expressões mesenquimais, iniciando a formação e desenvolvimento de embriões dentários, específicos para cada região da boca, que passam pelos estágios de lâmina dental, botão dental,

17 16 capuz dental e campânula, a partir da qual se formam os tecidos dentários e peridentários. Assim, o dente, na cavidade oral, se forma em conseqüência a uma série de interações delicadas entre o epitélio e ectomesênquima odontogênicos. Estas interações envolvem expressões, espacialmente restritas, de numerosos genes e a secreção de vários fatores de transcrição e de sinalização; por outro lado, distúrbios congênitos na formação dental, doenças dentárias adquiridas e tumores odontogênicos, afetam milhões de pessoas fazendo que a patologia oral humana seja considerada o segundo problema clínico mais freqüente. Os dados experimentais e os avanços na bioengenharia obtidos condicionaram à necessidade de adquirir conhecimentos das inter relações de evolução e mecanismos celulares e moleculares que regulam a morfogênese de um determinado dente na sua posição natural, que in vivo será útil para uso na prevenção e tratamento de patologias dentárias e malformações bem como na regeneração dos tecidos dentários. Saber (2009) relatou nesta revisão da literatura sobre o corpo de conhecimentos relacionados com células tronco pulpares, fatores de crescimento mais comuns, matrizes utilizadas para controlar sua diferenciação e uma técnica clínica para manuseio de dentes imaturos não vitais. Salienta que apesar da técnica comum para tratamento de canal, oferece altos níveis de sucesso para muitas situações clínicas, uma forma ideal de terapia poderia consistir na aplicação de uma técnica na qual, a polpa doente ou necrótica seja removida e substituída por tecido pulpar sadio para revitalizar o dente. A possibilidade de obter um tecido novo para substituir a polpa doente, perdida ou traumatizada é referida como endodontia regenerativa. Para obter este propósito, indica que é necessário aplicar a engenharia tecidual, um campo emergente e multidisciplinar, que aplica os princípios da Engenharia e Biologia, para obter substitutos biológicos que possam restaurar manter ou proporcionar a sobrevivência tecidual, sendo que os tecidos de interesse na endodontia regenerativa incluem dentina, polpa, cemento e ligamento periodontal. A chave para esta engenharia tecidual é a utilização de células tronco, fatores de crescimento e uma matriz carregadora; as células tronco, tem a capacidade de se dividir para replicar a si próprias ou produzir células especializadas que possam diferenciar outros e vários tipos celulares. Entre as células tronco citadas na literatura, salienta as células tronco pulpares, que tem uma alta capacidade proliferativa, renovação própria e capacidade de diferenciação multipotencial (origina outros tipos de células) incluindo Osteoblastos, Adipócitos,

18 17 Mioblastos, Endoteliócitos, Melanócitos, Neurônios e células da glia; células tronco de dentes esfoliados com capacidade de diferenciar uma variedade maior de células do que as da polpa dental incluindo células neurais, adipócitos, osteoblastos e odontoblastos, sendo que a maior habilidade destas células é formar tecido mineralizado; células tronco da papila apical de dentes permanentes imaturos, expressam vários marcadores de células tronco mesenquimais, tem a capacidade de originar células semelhantes a odontoblastos com a produção de dentina in vivo e são células fonte de odontoblastos primários para produzir dentina da raiz; células tronco do ligamento periodontal, com a potencialidade de originar cementoblastos, adipócitos e células formadoras de colágeno, tem sido observado em roedores sua capacidade de reorganizar o periodonto de inserção. Entre os fatores de crescimento que aumentam o número destas células tronco, cita o Fator de crescimento derivado de plaquetas, fator de crescimento de fibroblastos, fator estimulante de colônias, fator de crescimento epidermal, fator de crescimento endotelial vascular, fator transformador do crescimento alfa e Proteínas morfogenéticas ósseas. Entre as matrizes artificiais utilizadas relata ácido polilático, ácido poliglicólico, polímeros de polietileno glicol e vários tipos de peptídeos modificados acomodados na superfície de carregadores. Salienta que o uso destas informações na construção de matrizes artificiais contendo células-tronco e fatores de crescimento podem permitir aplicação clínica nos diversos tratamentos como na apicificação. Yagyuu et al. (2009) tiveram como objetivo neste trabalho, investigar a existência de células-tronco progenitoras no tecido dental na fase de formação de coroa e comparar seu potencial, para a formação de tecido duro. Foram utilizadas células do folículo dental (DFC) e células da papila dental (CPDs) derivado de folículos e papilas dentais na fase de formação de coroa, onde foi comparado sua capacidade proliferativa e de formação de tecido duro in vitro e in vivo. Os resultados obtidos foi que ambos DFC e DPCs tinham capacidade de proliferação extensiva, expressando os antígenos de superfície celular semelhantes e com capacidade de formar tecido duro in vivo, bem como in vitro. No entanto, há duas diferenças entre o DFC e DPCs: O DPCs, teve um acúmulo mais significativo de cálcio, do que na DFC. Este por sua vez, expressou um marcador de cementoblastos. Com isto, foi possível concluir que as papilas dentais na fase da formação da coroa contém

19 18 diferentes tipos de células progenitoras e pode ter a capacidade de formação de tecido duro. Fraser et al. (2010) relataram que a odontogênese pode ocorrer em situações em que o epitélio é originário do ectoderma, endoderma ou de uma combinação de ambas. Por outro lado, as formações de dentes na boca ou na faringe ocorrem com programas de expressão gênica muito semelhante. Evolutivamente, a teoria clássica sugere que os dentículos anexos à pele evoluíram primeiro e que a superfície ectodermal indutora destes odontóides mergulhou dentro da cavidade oral para formar os dentes, ou que odontóides em forma de placas evoluíram inicialmente no endoderma da faringe antes de se exteriorizar na boca. Há uma proposta recente que observa as homologias moleculares na co-expressão de genes definindo um espessamento epitelial competente e uma colaboração de ectomesenquima derivado da crista neural; assim, os odontóides se desenvolvem em qualquer território epitelial sem que mudem as co-expressões gênicas. Huang et al. (2010) com a finalidade de verificar a formação de novo do complexo polpa dentina, células tronco da papila apical e polpa dental foram obtidos de terceiros molares inclusos com ou sem ápice maduro pertencentes a doadores humanos entre 16 e 20 anos e células tronco da medula óssea de ossos longos pertencentes a doadores humanos com idade entre 20 e 63 anos; inicialmente, em cultura de células, foram caracterizados comparando entre si as expressões moleculares e isoladas as células tronco. Uma matriz carregadora foi elaborada utilizando copolímeros polilactideos e poliglicólicos e nesta foram criadas poros com diâmetro de 250 a 425mm, utilizando um procedimento padronizado, com a finalidade de acomodar dentro delas as células tronco em cultura. Raízes de dentes humanos recentemente extraídos foram cortados horizontalmente para obter segmentos com 6 a 7mm de comprimento e seus canais alargados até um diâmetro entre 1 e 2,5mm, vedados numa extremidade do canal com MTA, lavados e esterilizados. Dentro dos canais radiculares foram colocadas as matrizes contendo as células tronco implantadas no tecido subcutâneo da região dorsal de camundongos com 6 a 8 semanas de idade. Cada camundongo recebeu 2 implantes um a cada lado da linha média; paralelamente, foram implantados fragmentos de raiz vazios constituindo o grupo controle. Meses após os animais foram sacrificados, removidos os fragmentos radiculares para posterior análise histológica. Nos

20 19 fragmentos controle, 3 meses após, o canal radicular foi preenchido com tecido conjuntivo subcutâneo em cerca de 2mm do seu comprimento, constituído principalmente por células adiposas e o restante estava vazio. Os fragmentos que receberam o preenchimento de matriz contendo células tronco da papila apical e da polpa dental mostraram preenchimento completo com tecido pulpar regenerado.; uma fina camada de cápsula fibrosa separou o tecido regenerado e o tecido conjuntivo subcutâneo. Um número representativo de amostras com canal preenchido com matriz contendo células tronco da papila apical mostrou uma camada contínua e de espessura uniforme, depositada sobre as paredes dentinárias e de MTA com características estruturais semelhantes à dentina; este tecido regenerado foi menos contínuo e menos espesso nas amostras com canais preenchidos com matriz contendo células tronco da polpa dental. Ocorreram também inclusões celulares dentro da dentina regenerada; tanto as células odontoblásticas quanto o tecido dentinário neoformado não mostraram uma organização uniforme. Os resultados obtidos indicam a possibilidade de regeneração doa complexo dentino-pulpar estimulado pelas células tronco da papila apical e da polpa dental. Devido aos avanços da engenharia tecidual, que com grande interesse está promovendo a formulação de novos materiais carregadores de compostos bioativos que influenciam diretamente o comportamento celular, Miezawska e Kaplan (2010) fizeram uma revisão da literatura para analisar os dados relacionados com o controle temporal e espacial de moléculas sinalizadoras, carregadas num biomaterial, na regulação da resposta celular, quando aplicadas em tecidos específicos. Salientam que a engenharia tecidual é um campo interdisciplinar avançado onde ocorre o design de materiais artificiais, para implante em tecido vivo com a finalidade de obter a regeneração tecidual, imitando à matriz extracelular normal, uma vez que esta suporta a morfologia e função de órgãos e tecidos e regula funções celulares básicas como proliferação, crescimento, migração, diferenciação e sobrevivência. Essas funções são controladas através de constituintes específicos dos tecidos como: colágeno, laminina, fibronectina, elastina, que servem de suporte para moléculas funcionais como fatores de crescimento, proteínas matricelulares entre outras. Assim, os novos biomateriais devem permitir o gradual remodelamento endógeno do tecido nativo levando à substituição do material implantado, manufaturado para substituir a estrutura biológica perdida, com a total

21 20 funcionabilidade da matriz extracelular e das células, que existia no sítio do implante antes do dano ocorrido. Assim, nesta revisão são citados hidrogel de polietilenoglicol revestido com Fator de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF) promovendo: angiogenese, com grande formação de novos vasos sanguíneos; invação de células endoteliais dentro do gel e em implantes subcutâneos de ratos, um remodelamento completo do implante. Fator de Crescimento Epidermal (EGF) acoplado a matrizes de polímeros sintéticos, carregando células tronco mesenquimais, aumentam sua sobrevivência indicando que o contacto das células tronco com o EGF do revestimento superficial do implante aumenta sua resistência à morte celular, promovida pelas citocinas proinflamatórias, demonstrando a modulação da proliferação e sobrevivência das cálulas tronco mesenquimais. O Fator de Crescimento Nervoso (NGF) covalentemente ligado a uma matriz de Polidimetil Siloxano, promove um significante aumento do comprimento axonal comparado com a ação do NGF solúvel. Proteínas clonadas da proteína bacteriana TolAIII funcionando como esqueleto transportador de Osteopontina (OPN) ou Proteína morfogenetica óssea (BMP-2) onde a fusão recombinante de proteínas com OPN promoveu a adesão de células osteoblasticas primárias e as recombinações com BMP-2 promoveu a formação de osso, in vitro em 28 dias, sem a adição de estímulo osteogénico externo. Os trabalhos discutidos nesta revisão representam a emergência de uma área de estudo que influencia o comportamento celular através do uso de moléculas sinalizadoras, fixadas em biomateriais com as características determinadas pela engenharia tecidual, permitindo o controle de dosagem e distribuição espacial de compostos bioativos. Volponi, Pang e Sharpe (2010) salientam a importância das propriedades biológicas das células tronco dentais relatadas na literatura pertinente, mostrando o progresso rápido que está ocorrendo no uso de células tronco para o reparo dental bem como as dificuldades a serem transpostas antes da viabilidade na pratica odontológica. Informam que as primeiras células tronco dentários humanos foram isoladas de terceiros molares permanentes e que exibiram alta capacidade de proliferação e alta freqüência de formação de colônias com a produção esporádica de nódulos densamente calcificados, além disso, transplantes in vivo, em camundongos imunocomprometidos demonstraram uma alta capacidade para gerar tecido dental funcional na forma de complexos polpa/dentina, bem como outras derivados celulares mesenquimais como adipócitos, condrócitos, osteoblastos,

22 21 neurônios e crescimento axonal. Células tronco isoladas de dentes esfoliados mostram capacidade proliferativa maior que as células tronco pulpares, bem como capacidade osteo-indutiva, formação de acúmulos esferoidais, diferenciação de odontoblastos funcionais, formação de dentina tubular, diferenciação de células endoteliais angiogênicas, em modelos com remoção pulpar devido a infecções, a substituição com células tronco de dentes esfoliados promove regeneração de tecido semelhante ao da polpa dental, também foi sugerido eficácia terapêutica no alívio da doença de Parkinson em ratos; estas células tem uma expressão razoável de genes que participam na via relacionada com proliferação celular e formação de matriz extracelular incluindo fatores de crescimento como Fator de Crescimento de Fibroblastos (FGF) e Fator Transformador do Crescimento beta (TGF-beta), este último é importante por estar relacionado com a diferenciação de odontoblastos; Células tronco do Ligamento Periodontal com a capacidade de diferenciar cementoblastos e tecido conjuntivo rico em colágeno I, Células tronco da papila apical que em modelo de estudo de alvéolo de mini-porcos mostrou a capacidade de regenerar o periodonto de inserção, sugerindo que estas células podem ser usadas de uma maneira similar aos implantes metálicos recobertos por uma coroa dental artificial, Células tronco do folículo dental que em transplantes em camundongos imunocomprometidos, mostram indícios de diferenciação de Cemento e Osso; representam, como as células tronco da papila apical, células de tecido em desenvolvimento e por isso podem exibir uma maior plasticidade que outras células tronco. Os autores salientam que os dados da literatura, indicam a possibilidade de da utilização destas células no reparo de tecidos dentários, regeneração periodontal, regeneração de novo de polpa dental, regeneração de um dente completo e que apesar dos progressos, permanecem grandes obstáculos na formulação segura, simples e reproduzível na terapia de base celular, para o reparo e a regeneração de tecidos dentários, que possa ser usado em pacientes; finalizam indicando que o uso das células tronco dentais em relação a outras fontes de células tronco mesenquimais para uso terapêutico, não somente dependem da facilidade de uso e acessibilidade mas também da eficiência e qualidade de reparo em relação ao custo. As células pulpares crescem bem em culturas e a proporção de células com propriedades de células tronco parecem aumentar com as passagens (replicações). O estudo das bases moleculares deste comportamento poderá proporcionar um paradigma para o aumento do número de células tronco em culturas de outros tipos

23 22 celulares. Para obter uma regeneração dental completa restam muitos estudos a serem realizados que levará um tempo relativamente grande; sendo um dos fatos mais imediatos a ser resolvido, a identificação das populações mesenquimais e epiteliais que possam ser mantidas e expandidas em culturas para proporcionar o grande número de células necessárias para desenvolver um dente, além disso terá que ser levado em consideração a fonte autóloga (caro porém seguro) ou alogênico (barato porém com problemas de rejeição). Wang et al. (2010a) com a finalidade de estudar a viabilidade de células tronco de polpas com pulpite irreversível, elaboraram um protocolo experimental que consistiu em obter polpas sadias de dentes permanentes de pacientes entre 6 e 40 anos, estas polpas saudáveis foram usadas como controle e obtidas de 8 pacientes com indicação de extração de molar com finalidade ortodôntica; polpas com pulpite irreversível foram obtidas de 8 pacientes com procedimento endodôntico indicado. As polpas obtidas foram processadas de acordo com técnica padronizada para cultura de células. Cada tecido controle ou com pulpite foram processadas cultivadas e avaliadas separadamente em todos os experimentos. Os resultados da avaliação de formação de colônias indicaram que as células tronco das polpas comprometidas com pulpite tem capacidade proliferativa, porém em um grau significantemente menor do que as célula de polpas normais. As células do grupo pulpite mostraram uma percentagem similar de marcadores de células tronco do que as da polpa normal indicando a existência de células tronco em tecido pulpar extremamente comprometido. As células com reação positiva para marcadores de células tronco, de ambos os grupos (sadio e com pulpite) mostraram capacidades semelhantes para formar tecido mineralizado. Em conclusão o estudo sugeriu a existência de células tronco funcionais em polpas dentais clinicamente comprometidas com pulpite irreversível e os autores recomendam mais estudos nesta linha, pois é de interesse uma fonte endógena de células multipotentes para a regeneração na terapia pulpar. Wang et al. (2010b) tiveram como objetivo, estudar a diferenciação odontogênica a partir de células tronco obtida da polpa de dentes humanos, para isso foram preparados discos de uma rede de fibras de ácido polilático, com 5mm de diâmetro e espessura de 1,5mm e esterilizados em óxido de etileno. As células tronco foram obtidas do Centro de Biologia Molecular Crânio-facial da Faculdade de Odontologia da Universidade do Sul da Califórnia e tratadas em meio de cultura para

24 23 obter células entre a terceira e sexta replicação e inseridas na rede fibrosa dos discos de ácido polilático. Este complexo (células tronco e rede de fibras) foi distribuído em 3 grupos. No grupo 1, o complexo foi colocado em meio de cultura sem suplementos (controle), no grupo 2 o complexo foi colocado em meio de cultura suplementados com BMP7 8M (experimental) e grupo 3 o complexo foi colocado com 50 ng /ml de BMP7 (experimental), todos os meios foram cultivados a 37 C com 5% de CO2. Nos complexos disco/células cultivadas, foi realizada a quantificação de DNA, para determinar os níveis de proliferação celular; dispersão de raios X em Microscopia eletrônica de Varredura, para microanálise de elementos químicos; cromatografia, para determinar os níveis de fosfatase alcalina; PCR para determinar o RNA total, seqüências específicas para proteínas da matriz dentinária, sialoproteínas dentinárias, osteocalcina; coloração de Von Kossa, para quantificar cálcio. Complexos disco/células cultivados (4 por cada meio de cultura) foram implantados no tecido subcutâneo da região dorsal de camundongos e observados após 6 semanas pós-implante em cortes histológicos corados pelo H.E., Von Kossa e tricrômico de Masson. A análise de DNA não revelou diferenças significantes na proliferação celular nos 3 grupos (meio de cultura sem suplementos e suplementado com duas diferentes concentrações de BMP7). Os resultados mostraram que tanto o meio de cultura somente com dexametazona e o acrescido com BMP7 induziram às células tronco pulpares a diferenciar células semelhantes a odontoblastos, Mostrando maior capacidade indutora no meio com acréscimo de BMP7. A produção de matriz extracelular e tecido duro foram maiores nas amostras implantadas, no tecido subcutâneo, pertencentes ao grupo acrescido de BMP7 e as células produtoras destas matrizes, semelhantes à odontoblastos, foram caracterizadas pela reação imunopositiva para sialoproteínas dentinárias. Com estes resultados concluíram que a diferenciação de odontoblastos a partir das células tronco pulpares pode ser obtida utilizando rede de ácido polilático como carregador e que a combinação com BMP7 é mais efetiva nesta diferenciação; as combinações do ácido polilático utilizado, com fatores indutores da odontogênese proporcionam um meio excelente para que as células tronco pulpares possam regenerar o complexo polpa-dentina. Yan et al. (2010) tiveram como objetivo, verificar a possibilidade de reprogramar células tronco pluripontenciais induzidas, a partir de tecido ectomesenquimal, descartado como lixo biológico, de dentes decíduos esfoliados e