VARIAÇÃO TEMPORAL DA MOTILIDADE ESPERMÁTICA DA TILÁPIA DO NILO EM AMOSTRAS REFRIGERADAS E ATIVADAS GEORGE SHIGUEKI YASUI

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1 VARIAÇÃO TEMPORAL DA MOTILIDADE ESPERMÁTICA DA TILÁPIA DO NILO EM AMOSTRAS REFRIGERADAS E ATIVADAS GEORGE SHIGUEKI YASUI UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO CAMPOS DOS GOYTACAZES - RJ MARÇO

2 VARIAÇÃO TEMPORAL DA MOTILIDADE ESPERMÁTICA DA TILÁPIA DO NILO EM AMOSTRAS REFRIGERADAS E ATIVADAS GEORGE SHIGUEKI YASUI Dissertação apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Produção Animal. Aprovada em 08 de março de 2007 Comissão Examinadora Prof. Dalcio Ricardo de Andrade Prof. José Frederico Straggiotti Silva Prof. Eduardo Shimoda Prof. Manuel Vazquez Vidal Júnior Orientador ii

3 Buscar o conhecimento é apenas uma forma de descobrir o quanto o ser humano é limitado iii

4 DEDICATÓRIA A minha esposa Thauanna, minha mãe Noriko, minhas irmãs Érika e Anne pelo apoio incondicional. Ao meu pai Makoto e meu irmão Ralph pelo incentivo e por terem despertado minha fascinação pelos peixes através da pesca esportiva e do aquarismo. iv

5 AGRADECIMENTOS A formação de um indivíduo é o resultado de uma inter-relação de fatores, dentre os quais se destaca o convívio tanto pessoal quanto profissional, onde ocorre uma interação de amizade, profissionalismo, dedicação, bem como momentos de alegrias e de tristezas. Nesse contexto, gostaria de expressar minha imensa gratidão às diversas pessoas e instituições, que direta ou indiretamente contribuíram tanto para minha formação acadêmica quanto pessoal. Em especial, agradeço: A FAPERJ/UENF, pela concessão da bolsa de estudos. Aos meus familiares, aos quais não tenho palavras em meu vocabulário para expressar tamanha gratidão. Ao meu orientador, Manuel Vazquez Vidal Júnior, pela eficiente orientação e amizade. Ao professor, Dalcio Ricardo de Andrade, pela orientação dentro e fora do meio acadêmico. Ao professor e amigo, Eduardo Shimoda, pela ajuda na coleta de dados e indispensáveis sugestões deste trabalho, bem como os momentos de descontração. Ao professor José Frederico Stragiotti Silva, pelas sugestões e pela constante disponibilidade em contribuir. Ao companheiro André Veloso, pela amizade e pela contribuição nas correções finais deste documento. À Pós-graduação em Produção Animal da Universidade Estadual do Norte Fluminense e ao Laboratório de Zootecnia e Nutrição Animal, pela oportunidade, pelo inestimável apoio durante a realização deste trabalho, em especial à professora Celia Raquel Quirino. Aos meus mestres da Universidade Federal de Viçosa, Luiz Carlos dos Santos e Oswaldo Pinto Ribeiro Filho, pela eficiente orientação durante a graduação e pela amizade. Aos funcionários da Estação de Piscicultura e Hidrobiologia-UFV e Ranário Experimental, João Pindóia, Paulo, Donizete, José Antônio, Inácio, Carlos, Alvaro, Everaldo e Raimundo, pelos ensinamentos e pela amizade. Aos professores da UENF, Francisco Aloízio Fonseca, Rita Trindade, José Brandão Fonseca, Ricardo Vieira, Humberto Couto, Rony Ferreira, Luis Castillo e Alberto Fernandes, pelo convívio diário e prazeroso e pelo aprendizado. Aos escudeiros da UENF Lombardi, Etiene, Elenita, Jovana, Simone, Jorge, Jonas, José, Bia e Mauricio. A todos os amigos (são muitos e felizmente não caberiam nesta página) de Viçosa-MG, Campos dos Goytacazes-RJ e Mogi das Cruzes-SP. v

6 BIOGRAFIA George Shigueki Yasui, filho de Makoto Yasui e Noriko Yasui, nascido em 1º de janeiro de 1979, em Mogi das Cruzes, São Paulo. Em setembro de 2002, graduou-se no curso de Zootecnia pela Universidade Federal de Viçosa UFV, onde foi contemplado com bolsa de extensão, MEC/UFV, trabalhando com cultivo de tilápias. De outubro de 2002 a julho de 2004, foi bolsista de apoio técnico do TECNORTE, na Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, na área de biotecnologia de tilápias. Em Agosto de 2004, ingressou no Curso de Pós-graduação em Produção Animal, nível de mestrado, na Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro. Em 8 de março de 2007, submeteu-se aos exames finais de defesa de tese. vi

7 SUMÁRIO RESUMO... viii ABSTRACT... ix CAPÍTULO I: ASPECTOS GERAIS DA TILAPICULTURA E TECNOLOGIA DO SÊMEN 1. INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA A tilápia Histórico da tilapicultura nacional Importância da qualidade seminal na produção de peixes Coleta de sêmen Parâmetros espermáticos Volume seminal, concentração espermática e espermatócrito Motilidade espermática Visualização e avaliação da motilidade Tempo de motilidade Fatores que afetam a qualidade seminal Indução hormonal e período de coleta Contaminação do sêmen Efeito da salinidade na qualidade seminal Conservação do sêmen Refrigeração Outras técnicas REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS CAPÍTULO II: VARIAÇÃO TEMPORAL DA MOTILIDADE ESPERMÁTICA DA TILÁPIA DO NILO EM AMOSTRAS REFRIGERADAS E ATIVADAS ( Brazilian Archives of Biology and Technology, protocolo BD-1693) ABSTRACT INTRODUÇÃO MATERIAL E MÉTODOS Experimento 1: Motilidade espermática do sêmen refrigerado Experimento 2: Motilidade espermática do sêmen fresco Estatística RESULTADOS E DISCUSSÃO Experimento Experimento CONCLUSÕES vii

8 AGRADECIMENTOS RESUMO REFERÊNCIAS viii

9 RESUMO YASUI, GEORGE SHIGUEKI. M.Sc. Universidade Estadual do Norte Fluminense. Março/2007. Variação temporal da qualidade seminal de tilápia do Nilo em amostras refrigeradas e ativadas. Manuel Vazquez Vidal Júnior (orientador), Dalcio Ricardo de Andrade, José Frederico Straggiotti Silva e Eduardo Shimoda. O presente trabalho objetiva avaliar parâmetros seminais de tilápia do Nilo, em amostras refrigeradas e pós-ativadas. Primeiramente, amostras seminais foram mantidas a 4ºC em caixas isotérmicas, tendo a motilidade mensurada a cada 30 minutos, por meio de Analisador Espermático Computadorizado (CASA), até que as células se tornassem imóveis. Similarmente, outra amostra seminal foi avaliada a cada 15 segundos após a ativação, para observar o decréscimo da qualidade seminal. Em cada avaliação foram mensurados os seguintes parâmetros: motilidade total e progressiva, freqüência de batimentos flagelares e percentual de células rápidas, lentas e estáticas. Os resultados demonstram que amostras refrigeradas se mantém móveis até 10,59 horas, enquanto o sêmen ativado teve a motilidade prolongada até 300 segundos. Por outro lado, a motilidade progressiva se manteve por apenas 9,1 horas para amostras refrigeradas e 90 segundos para amostras ativadas, o que enfatiza a otimização de amostras seminais antes dos períodos mencionados. ix

10 ABSTRACT YASUI, GEORGE SHIGUEKI. M.Sc. Universidade Estadual do Norte Fluminense. March/2007. Temporal variation of sperm motility of Nile tilapia in activated and stored samples. Manuel Vazquez Vidal Júnior (supervisor), Dalcio Ricardo de Andrade, José Frederico Straggiotti Silva and Eduardo Shimoda The present study aims to evaluate seminal parameters of Nile tilapia, in stored and activated samples. Firstly, seminal samples were maintained at 4 o C in an ice-box, and the motility was measured each 30 minutes by means of Computer Assisted Sperm Analyzer (CASA), until all cells became immotile. Similarly, another sperm sample was evaluated each 15 seconds after activation, to observe the decrease in sperm quality. In each evaluation it was measured the following parameters: total and progressive motility, flagellar beating frequence, and percentage of fast, slow and static cells. Results demonstrates that stored samples maintained motile until 10,59 hours, while activated sperm prolonged its motility until 300 seconds. On the other hand, progressive motility maintained only for 9,1 hours for stored, and 90 seconds for post activated sperm, what emphasizes the optimization of sperm samples before these mentioned periods. x

11 Capítulo I: Aspectos gerais da tilapicultura e tecnologia do sêmen de peixes

12 1. INTRODUÇÃO A piscicultura é uma atividade econômica em fase de consolidação no Brasil, sendo que, nos últimos anos, tem-se observado maior profissionalização deste setor com reflexos sobre a diversidade e o preço dos produtos. A redução do custo de produção em diversas empresas aqüícolas tem sido decorrente da adoção de novas tecnologias, desenvolvidas principalmente nos países onde a aqüicultura tem maior destaque. Entretanto, mesmo nestes países, o desenvolvimento de diversos processos tecnológicos, ainda não está consolidado e, portanto, as metodologias pertinentes não estão disponíveis aos produtores. A cadeia produtiva do cultivo de tilápias, atividade também conhecida como tilapicultura, se encontra entre as principais atividades do setor aqüícola no Brasil. Entretanto, esta cadeia produtiva necessita do desenvolvimento de tecnologias para a sua consolidação no aspecto quali-quantitativo, podendo assim se tornar competitiva no mercado externo. O cultivo de tilápias ocupa atualmente a posição de principal atividade de cultivo em ambientes aquáticos dulcícolas no mundo (POPMA e 2

13 LOVSHIN, 1994; FITZSIMMONS, 2000) e é uma atividade considerada estratégica, pelo Ministério da Agricultura e do Abastecimento no Brasil. No Brasil, a tilápia foi introduzida na década de 40, mas apenas após o desenvolvimento das técnicas de inversão sexual, nos anos 80, e a introdução de linhagens de maior potencial zootécnico, na década de 90, é que a atividade teve maior impulso (KUBTIZA, 2000; ZIMMERMANN, 2000). Um dos indicativos do processo de intensificação da tilapicultura é a procura por linhagens de alto desempenho, tendo em vista a otimização do processo produtivo. Nos últimos anos, diversas linhagens de tilápia foram introduzidas no país, entre elas a linhagem vermelha da Flórida, na década de 90 (LOVSHIN, 2000), a linhagem Thai-Chitralada, introduzida em meados de 1996, que é a principal linhagem cultivada em todo o país e uma das mais utilizadas em todo o mundo (ZIMMERMANN, 2000; LOVSHIN, 2000), e a linhagem Supreme, introduzida recentemente e que se mostra uma linhagem bastante promissora para a nossa região (KUBITZA, 2006). A disseminação genética dessas linhagens geralmente é feita através da aquisição de alevinos, os quais passam por um processo de engorda até atingirem a maturidade sexual, quando então são utilizadas como matrizes. Esse procedimento é bastante eficaz, no relativo ao custo com o transporte, em função do tamanho reduzido dos animais. Entretanto, por serem provenientes do mesmo lote, este procedimento apresenta como inconveniente o cruzamento sucessivo entre as linhagens, bem como o cruzamento entre membros consangüíneos, induzindo a uma rápida depreciação genética por endogamia, já que poucos reprodutores são utilizados como estoque fundador (HILSDORFF e SANTOS, 1999; CAROSFELD e HARVEY, 1999). Diversos problemas ligados à endogamia já foram constatados quando as tilápias foram disseminadas da África para outras partes do mundo, visto que poucos reprodutores foram utilizados para a propagação genética (CAROSFELD & HARVEY, 1999). Para que o potencial de cultivo de tilápias no país seja otimizado, devem ser adotadas práticas que proporcionem melhorias no tocante à sua qualidade genética, com redução dos custos de produção, para se tornarem cada vez mais competitivos 3

14 aos mercados consumidores externos e internos, o que implicará em um fortalecimento da cadeia agroindustrial da tilápia. Assim sendo, a tendência atual é que ocorra um processo de intensificação na tilapicultura, incluindo biotécnicas que permitam a otimização do potencial produtivo. Entre elas, destacam-se técnicas de criopreservação, androgênese, ginogênese, clonagem e manipulação cromossômica, que são biotécnicas importantes para o melhoramento genético. Nesses procedimentos, é de fundamental importância o domínio da reprodução artificial e a avaliação da qualidade dos gametas, e, no caso dos machos, o estudo de aspectos básicos da qualidade seminal ofereceria informações importantes para a aplicação de muitas tecnologias. A disseminação genética utilizando-se de sêmen apresenta vantagens em relação às fêmeas, como a possibilidade de estocagem sob refrigeração ou congelamento, bem como a possibilidade de utilizar amostras compostas ( pool ), o que tenderia a aumentar a heterose. Para o produtor de alevinos o desenvolvimento destas tecnologias permitiria disponibilizar no mercado animais com elevado desempenho zootécnico, visto que a aquisição freqüente de material genético comprovadamente de boa qualidade. 4

15 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1. A TILÁPIA O nome genérico tilápia reúne um grande número de espécies de ciclídeos africanos, provenientes da Bacia do rio Congo, Nilo, Níger e Senegal (NOAKES e BALON, 1982). Uma das características mais marcantes no tocante à etologia reprodutiva dessas espécies é a proteção à prole, podendo ser classificados como peixes guardadores e ativos (WOYRANOVICH e HORVATH, 1989; VAZOLLER, 1996). Todas as espécies de tilápia costumam fazer uma escavação no substrato, para que nesse local seja feita a desova, sendo conhecido popularmente como ninhos, e, após a desova, os progenitores costumam protegê-la. Algumas espécies realizam a incubação no próprio substrato, defendendo a desova contra possíveis predadores, ao passo que outras espécies coletam os ovos na boca, aonde irão oxigená-los e protegê-los até a fase de juvenis. Essas últimas são conhecidas como espécies de incubação oral (TREWAWAS, 1982a e 1982b; NOAKES e BALON, 1982). 5

16 Fundamentado nessas características reprodutivas e no hábito alimentar, as espécies de tilápia podem ser classificadas em três principais gêneros (TREWAWAS, 1982a e 1982b; NOAKES e BALON, 1982). O gênero Tilápia, composto por peixes de hábito alimentar onívoro, com tendência à herbivoria, e incubam os ovos no substrato. Tanto o macho quanto a fêmea participam da escavação do ninho e da proteção da prole. São exemplos desse gênero a tilápia do Congo (T. rendalli), a Tilapia zilli e a tilápia zebra (T. buttikoferi). O gênero Oreochromis, com peixes de hábito alimentar onívoro, sendo o macho responsável pela escavação do ninho e a fêmea coleta os ovos na boca e realiza a incubação oral. São exemplos desse gênero a tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus), a tilápia de Zanzibar (Oreochromis hornorum) e a tilápia azul (Oreochromis aureus). O gênero Sarotherodon, representado por tilápias que possuem o hábito alimentar onívoro e tanto o macho quanto a fêmea ajudam na escavação do ninho e na incubação oral. São exemplos de tilápias desse gênero a Sarotherodon gallilaeus e S. melanotheus. De acordo com YASUI et al. (2006), no Brasil, são encontradas apenas tilápias do gênero Tilapia (T. rendalli e T. buttikoferi) e Oreochromis (O. niloticus, O. hornorum e híbridos Oreochromis sp.), sendo que este último gênero possui maior relevância na piscicultura. São classificados como peixes r-estrategistas, iteróparos, apresentando alta prolíficidade, baixa competição intra-específica, postura freqüente de ovos, altas taxas de crescimento e maturação sexual precoce. Habitam ambientes lênticos, onde podem desovar naturalmente durante todo o ano (desova múltipla) em temperaturas acima dos 21 o C (POPMA e GREEN, 1990), visto que a maturação dos ovócitos ocorre em mais de dois grupos (VAZZOLER, 1996). A tilápia do Nilo, principal espécie de tilápia cultivada no país, é considerada uma espécie rústica, tolerando altas densidades de estocagem, salinidade, variações da qualidade da água, além de apresentar bons índices zootécnicos de crescimento, conversão alimentar, e também capacidade de filetagem, gerando filés sem espinhos, excelente qualidade de carne e aceitação no mercado (YASUI et al., 2006). 6

17 2.2 HISTÓRICO DA TILAPICULTURA NACIONAL Os primeiros indícios da tilapicultura no Brasil datam de 1953, quando foram introduzidos no país alguns exemplares de Tilapia rendalli, peixes de desova natural e que poderiam reproduzir sem técnicas mais refinadas para obtenção de alevinos (ANDRADE e YASUI, 2003). Estes animais foram trazidos para a região Nordeste para povoamento de diversos reservatórios construídos nessa região para geração de energia elétrica, e, a partir desse ponto, as tilápias foram se disseminando para outras regiões do país. Contudo, essa espécie de tilápia possui um potencial zootécnico bastante reduzido, que, associado às técnicas rudimentares utilizadas na época, acabaram apresentando baixos índices de crescimento (ZIMMERMANN, 2000). Em dezembro de 1971, foram trazidos pelo DNOCS (Departamento Nacional de Obras Contra as Secas) vinte exemplares de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) e vinte exemplares de tilápia de Zanzibar (Oreochromis hornorum), provenientes da Costa do Marfim. O intuito era povoar açudes e atenuar a deficiência de alimentos na região (LOVSHIN, 1976). Essas espécies apresentavam potencial de crescimento bastante superior às anteriores. Por outro lado, o manejo inadequado e a falta de utilização de populações monossexuais acabaram gerando índices zootécnicos muito aquém do seu potencial, fato que foi agravado pela falta de controle dos cruzamentos e ausência de rastreabilidade, ocorrendo uma disseminação exacerbada por todo o país, bem como grande depreciação genética por endogamia (ZIMMERMANN, 2000). Desse modo, as tilápias, por muitos anos, foram consideradas como verdadeiras pragas, que causavam superpopulação de diversos ambientes aquáticos, reduzindo o potencial de crescimento de outras espécies mais promissoras. Paralelamente, em outras partes do mundo, as técnicas de obtenção de populações monossexuais foram se desenvolvendo, e POPMA e GREEN (1990) mostraram que a técnica de inversão sexual poderia ser perfeitamente utilizada em ambientes contendo alimento autóctone (plâncton), o que possibilitava a aplicação desta técnica em larga escala, obtendo, assim, populações monossexuais masculinas, otimizando o potencial de engorda e contornando o entrave da superpopulação. 7

18 Paralelamente, outros trabalhos também foram se desenvolvendo com o intuito de melhorar a qualidade genética das tilápias, e inúmeras linhagens e híbridos de alto potencial zootécnico foram desenvolvidos. Na década de 90, foi introduzida no país a linhagem vermelha da Flórida, que é um híbrido de coloração clara (róseo ao vermelho) e bastante resistente à salinidade. Essa linhagem apresenta bom desempenho zootécnico, bem como a aceitação no mercado, em função da coloração chamativa, mas apresenta baixa fecundidade e também altas mortalidades, principalmente em função da predação por pássaros (LOVSHIN, 2000). Em 1996, foram trazidos para o país, na região Sul, alguns exemplares de tilápias do Nilo, da linhagem tailandesa, ou Thai-Chitralada, que apresentavam um desempenho de crescimento superior às anteriormente encontradas no país (ZIMMERMANN, 1999). Essa linhagem é a mais utilizada no país atualmente, e, com o desenvolvimento de algumas empresas de maior porte, as quais mantém a qualidade genética, e associada à melhoria das técnicas de cultivo a tilapicultura passou a ser considerada uma referência nacional na aqüicultura, chegando inclusive ao processo de industrialização. Assim sendo, ao final da década de 90 e início da década seguinte, a tilápia se tornou um dos poucos peixes de água doce no Brasil com produção intensiva e com a cadeia produtiva mais consolidada, fatos estes que apenas aconteciam com a truticultura, embora em menor escala. Outra linhagem de tilápia foi introduzida, no ano de 2002, proveniente do programa GIFT, conhecida como Supreme Tilapia, e vem apresentando bom desempenho de engorda, segundo relatos de diversos produtores, que encontraram, inclusive, desempenho superior que o apresentado pela linhagem Thai-Chitralada (Kubitza, 2006). Atualmente, existem grandes criações de tilápias nos estados do Sul, Sudeste e Nordeste, com um grande potencial produtivo, inclusive com vistas ao mercado internacional (VINATEA, 1998; KUBITZA, 2000). 8

19 2.3 IMPORTÂNCIA DA QUALIDADE SEMINAL NA PRODUÇÃO DE PEIXES Um dos requisitos básicos para que ocorra a intensificação da produção de peixes é a produção massal de juvenis destinados à engorda, que assim podem ser cultivados até o peso de abate. Além de proporcionar sementes para a piscicultura, a reprodução artificial apresenta certas vantagens, como a aplicação em técnicas de melhoramento genético, manipulação cromossômica e criobiologia (ARAI, 2000; YASUI e ANDRADE, 2003). Diante desta realidade, foram desenvolvidos diversos protocolos de reprodução induzida (YASUI e ANDRADE, 2003; DONALDSON, 1996), para possibilitar a obtenção de alevinos em peixes reofílicos (peixes de piracema), visto que este grupo não atinge o grau de maturação gonadal final em ambientes lênticos. Dentre esses protocolos, tem-se observado maior interesse no manejo reprodutivo de fêmeas, visto que o sistema endócrino-fisiológico é mais complexo, e os gametas são obtidos, na maioria das espécies, exclusivamente mediante indução reprodutiva (hormonal). Antagonicamente, nos machos, a produção espermática envolve um processo mais simples, onde não há incorporação de vitelo aos gametas, dispensando uma série de etapas bioquímicas complexas envolvendo hormônios e outras substâncias como enzimas. Por esta razão, em machos, a obtenção de gametas viáveis é mais comum, mesmo omitindo-se a indução reprodutiva. Entretanto, utilizam-se os indutores com o intuito de potencializar a produção espermática, obtendo-se, na maioria dos casos, sêmen em quantidade e qualidade suficiente para a desova. No tocante ao manejo reprodutivo, é prática rotineira a utilização de excesso de sêmen para fecundar os ovócitos, muitas vezes empregando-se amostras seminais de vários machos para fertilização, visando superestimar a relação espermatozóide/ovócito e assim garantir a fertilização (WOYRANOVICH e HORVATH, 1989). Todavia, ao passo que ocorre a intensificação dos sistemas de produção, tornase cada vez mais relevante a contenção dos custos de produção, aliada a otimização do processo produtivo. Esses aspectos fazem com que os gastos referentes ao plantel de matrizes sejam reduzidos, otimizando-se então a eficácia reprodutiva de cada 9

20 indivíduo. Além destes fatos, com os avanços do melhoramento genético na piscicultura, a tendência é que se utilize linhagens de alta performance e sêmen criopreservado, e sejam implementadas as técnicas de rastreabilidade, o que pode exigir uma utilização mais controlada e racional de sêmen. 2.4 COLETA DE SÊMEN Geralmente, a coleta de sêmen é realizada mediante massagem abdominal (extrusão), em sentido crânio-caudal. Antes de iniciar o processo, deve ser feita uma compressão na região próxima à papila genital, para que seja eliminado o excesso de urina e fezes, que podem contaminar o sêmen, e então secar a região com pano ou papel absorvente. No manejo reprodutivo de rotina (grande escala), o sêmen de dois ou mais machos costuma ser extrusado diretamente sobre os ovos, contidos em um recipiente plástico. Esse procedimento visa garantir a qualidade seminal e aumentar a variabilidade genética dos descendentes. Contudo, recomenda-se a verificação da qualidade seminal antes de sua utilização, visto que mediante esta análise podem ser detectadas características que comprometem a qualidade seminal, como a baixa motilidade, bem como outros aspectos negativos como a azoospermia (ausência de espermatozóides), podendo, inclusive, se apresentar como uma característica hereditária (SHIMODA, 1999). Em algumas espécies em que a liberação do sêmen é difícil de ser obtida por compressão (ex. Clarias gariepinus, Silurus glanis), ou mesmo liberada em pequena quantidade (ex. Leporinus sp, espécies de pequeno porte), a coleta de sêmen é realizada mediante o sacrifício dos animais, sucedido de coleta de sêmen testicular (LINHART et al., 1987; DeGRAAF e JANSSEN, 1996; RIBEIRO e GODINHO, 2003). Para a coleta, diversos recipientes podem ser utilizados, como tubos tipo falcon, placas de Petri, seringas, ou mesmo tubos para hematócrito, no caso de espécies de pequeno porte. Porém, recipientes graduados ou seringas costumam proporcionar maior praticidade para se avaliar o volume no momento da coleta (GODINHO et al., 2003). 10

21 As amostras então obtidas são observadas imediatamente ao microscópio para verificar a motilidade espermática, e, caso seja detectada, as amostras geralmente são eliminadas. 2.5 PARÂMETROS ESPERMÁTICOS Volume seminal, concentração espermática e espermatócrito O volume de sêmen coletado é um parâmetro quantitativo de extrema importância, pois pequenas quantidades de sêmen podem inviabilizar a fertilização e a realização de diversas análises espermáticas. Algumas espécies são caracterizadas por produzirem baixo volume de sêmen, como é o caso do piau-açu (Leporinus macrocephalus), dos lambaris (Astyanax sp.) e do bagre africano (Clarias gariepinus). (DeGRAAF e HANSSEN, 1996; RIBEIRO e GODINHO, 2003; YASUI e ANDRADE, 2003). RIBEIRO e GODINHO (2003) encontraram valores de 0,4 ± 0,2mL em piau-açu de 446,7 ± 165,1g de peso corporal, e VIVEIROS et al. (2003), trabalhando com Clarias gariepinus induzidos por oxitocina, encontraram valores de 1,0 ± 0,8mL. Outras espécies, porém, produzem sêmen em grande quantidade, como é o caso do pacu (Piaractus mesopotamicus), do jundiá (Rhamdia quelen) e das carpas chinesas. Em algumas ocasiões, em função dessa grande produção seminal, a indução hormonal, que tende a incentivar a espermiação, é descartada, e poucos machos podem ser utilizados para fecundar um grande número de ovócitos. SHIMODA (1999) encontrou valores de 5,4 ± 2,43mL em pacus, ao passo que BELOVA (1981) encontrou volume de 1 a 9mL em carpa-capim (Ctenopharyngodon idella). CRUZ- CASALLAS et al. (2005) obtiveram valores de volume seminal de 1,8 ± 1,2 em Brycon siebenthalae. Conforme pode ser observado nos dados apresentados, esta característica possui uma grande variação individual, o que pode ser confirmado pelos altos valores de desvio-padrão. Variáveis como período de coleta, número e freqüência de coletas, também influenciam os valores de volume seminal, sendo estas características espécieespecífica (GJERD, 1984; SUQUET et al., 1992 e 1994). 11

22 A concentração ou densidade espermática é um parâmetro quantitativo que relaciona o número de espermatozóides em função do volume seminal. A concentração de espermatozóides em peixes costuma ser elevada quando comparada com mamíferos, chegando à ordem de bilhões de espermatozóides/ml (CHAO et al., 1987; BILLARD et al., 1995; CRUZ-CASALAS et al., 2005). SHIMODA et al. (1999) encontraram concentrações de 37,4 ± 8,05 x 10 9 espermatozóides/ml em Piaractus mesopotamicus. Em truta arco-íris, GLOGOWSKI et al. (2000) encontraram concentrações espermáticas de 10,39 ± 2,13 x 10 9 espermatozóides/ml. Na mesma espécie, KAVAMOTO et al. (1985) encontraram concentrações de 15,07 a 20,99 x 10 9 espermatozóides/ml. Além da variação interespecífica da concentração espermática, ocorre também uma grande variação intraespecífica, já que este parâmetro pode variar em função com o peso e a idade do animal, época de coleta, tratamento hormonal e porção do ejaculado (GJERD, 1984; SUQUET et al., 1992 e 1994; CACOT, 2003; VIVEIROS, 2003). Entre as espécies de peixes teleósteos estudadas, parece haver tendência a uma relação inversamente proporcional entre o volume seminal e a concentração espermática (CACOT et al., 2003; MYLONAS e ZOHAR, 2001). Para a mensuração deste parâmetro, diversas técnicas podem ser utilizadas, como a câmara de Mackler (TAITSON e GODINHO, 2003), hemocitômetro, espectrofotometria, citometria de fluxo (HANSEN et al., 2002; CHRISTENSEN et al., 2004) e, indiretamente, o espermatócrito e a concentração de DNA (FENTON et al., 1990) Motilidade espermática Um dos principais parâmetros que caracterizam a qualidade do sêmen é a motilidade espermática, sendo um dos aspectos qualitativos de maior relevância. Os espermatozóides de peixes são estáticos no testículo e no trato genital, em função de diversas características encontradas no plasma seminal, tais como a osmolaridade, ph, e concentração de íons de sódio, potássio e cálcio (PADHI e MANDAL, 2000; ALAVI et al., 2004). A definição mais genérica, conforme adotada por COSSON (2004), é que os espermatozóides são ativados quando entram em contato com o meio 12

23 circundante. No caso da tilápia do Nilo, além dos fatores supracitados, existem também glicoproteínas de alto peso molecular, presentes no plasma seminal, e que atuam como agente imobilizante (MOCHIDA et al., 1999). Alterações nesses parâmetros podem iniciar a motilidade espermática, sendo que em peixes de água doce, a redução da osmolaridade tende a iniciar a motilidade, já em peixes marinhos ocorre o inverso, uma vez que o ambiente é hiper osmótico em relação ao plasma seminal (BILLARD, 1978; BENAU, 1980; MORISAWA et al., 1983; MIURA et al., 1992; BILLARD et al., 1995). Conforme observado por CHAO et al. (1987), a concentração de cálcio no meio externo também é um fator crucial na iniciação da motilidade, visto que influencia no potencial de membrana, que pode então iniciar a motilidade, mesmo que a osmolaridade no meio externo seja inadequada para a ativação espermática Visualização e avaliação da motilidade A visualização de espermatozóides móveis é realizada colocando-se a amostra em uma lâmina, previamente focalizada em um microscópio óptico, com aumento de 40x, e adicionando quantidade de solução ativadora suficiente para atingir todos os espermatozóides. Segundo BILLARD e COSSON (1992) as amostras devem ser ativadas utilizando sêmen diluído, já que a ativação dos espermatozóides é mais homogênea. Amostras de sêmen fresco, quando ativadas, podem levar a erros experimentais como a superestimação do tempo de motilidade e do percentual de células móveis devido à viscosidade do sêmen. Diante desse fato, os autores recomendam que a avaliação da motilidade seja realizada mediante a diluição em duas etapas. A primeira, utilizando-se uma solução diluidora, com osmolaridade alta (no caso de peixes dulcícolas), para que os espermatozóides não sejam ativados. A segunda, feita com uma solução ativadora, que no caso de peixes de água doce é realizada com água destilada ou solução de bicarbonato de sódio. No que concerne ao aspecto qualitativo do sêmen, diversas técnicas podem ser empregadas para se avaliar a motilidade espermática. O método mais simples é a avaliação subjetiva, que consiste em observar o número de células móveis e estáticas. 13

24 Devido à subjetividade do método e conseqüente erros na avaliação das amostras, costuma-se estimar a motilidade em percentual, e classificando em quatro grupos: grupo 1, que denomina motilidade entre 0 (zero) e 2 5 %; grupo 2, para motilidade variando entre 25 e 50 %; grupo 3, variando de 50 a 75%e grupo 4, variando de 75 a 100%de motilidade (VIVEIROS et al., 2003). Considerando o curto tempo de motilidade em peixes e a subjetividade do método, a tendência é que este procedimento seja substituído por metodologias mais precisas, entretanto, esta é a técnica mais amplamente empregada atualmente em função de sua simplicidade e do baixo custo. Outro método, proposto por TRIPPEL e NEILSON, (1992), e posteriormente validado por IWAMATSU et al. (1993), consiste em avaliar a motilidade através de imagens de vídeo, obtidas por uma câmera acoplada ao microscópio, e apresenta a vantagem de se avaliar a motilidade posteriormente, analisando parâmetros como a progressividade e tempo de motilidade com maior precisão. Outra vantagem do método é a possibilidade de se utilizar mais de um avaliador para analisar a mesma amostra. Este tipo de avaliação apresenta, obviamente, inúmeras vantagens em relação ao método anterior, entretanto requer equipamentos de maior custo para que a utilização seja viável (KIME et al., 2001). O Computer Assisted Sperm Analyzer (CASA) é atualmente o método mais preciso para a avaliação dos parâmetros espermáticos e consiste de um software que capta imagens de amostras seminais analisando diversas características seminais como percentual de motilidade, movimentos progressivos e movimentos curvilineares, e vem sendo empregado com mais freqüência nos últimos anos (KIME et al., 2001; RAVINDER et al., 1997). A principal vantagem é a precisão e a redução da subjetividade na avaliação, sendo um método limitado em função do custo Tempo de motilidade O tempo da motilidade espermática é variável, com tendência espécieespecífica. Em geral, a motilidade em peixes marinhos é maior em relação aos peixes dulcícolas (SUQUET et al., 2000; DREANNO et al., 1997). 14

25 Em E. frenatus, a motilidade fica em torno de 30 segundos (VIDAL JR. et al., 2002), ao passo que em Clarias gariepinus o valor varia de 30 a 40 segundos (MANSOUR et al., 2002). FRANCISCATTO et al. (2002) observaram um tempo de motilidade de 96s para Prochilodus lineatus, tempo este superior ao encontrado em Brycon siebenthalae (41± 7s; CRUZ-CASALLAS et al., 2005). AMORIM (2002), trabalhando com tilápias do Nilo, linhagem Thai-Chitralada, encontrou tempos de motilidade variando de 9 ± 22 a 261 ± 91,8 segundos, em diferentes crioprotetores. Dentre as variáveis que podem afetar o tempo de motilidade está a solução utilizada para a ativação dos espermatozóides. Na maioria das pisciculturas comerciais, a própria água que abastece os laboratórios de reprodução é utilizada para a ativação espermática. Contudo, conforme observado por MORISAWA et al. (1983), a utilização de soluções com maior osmolaridade tende a otimizar a motilidade espermática e sua duração, visto que a diferença em osmolaridade do plasma seminal e da solução ativadora pode causar injúrias nas células. LAHNSTEINER et al., (2000) utilizando soluções de NaCl 25 e 50mM observaram maior tempo de motilidade em comparação à água destilada, sendo que nesta última observaram os piores resultados. AMORIM (2002) não observou diferença significativa entre água destilada, bicarbonato de sódio 119mM ou NaCl 25mM para tilápia do Nilo, no tocante à motilidade total e o tempo de motilidade. LINHART et al. (2005) utilizaram uma solução ativadora composta por 17mM NaCl e 5mM Tris-HCl para bagre europeu, Silurus glanis, ao passo que STOSS e HOLTZ (1981) e YAO et al. (2000) observaram melhores resultados utilizando solução de NaHCO 3 a 1%. 15

26 Tabela 1. Principais soluções ativadoras da motilidade espermática em algumas espécies de peixes teleósteos Espécie Solução ativadora Referência Urechis unicintus* Água marinha artificial (ASW) % KANG et al. (2004a) Thamnaconus septentrionalis* Água marinha artificial (ASW) KANG et al. (2004b) Acipenser sturio 5,3mM NaCl; 3.1 Tris-HCl; 58,3mM sacarose KOPEIKA et al. (1999) Acipenser rutheneus 20mM NaCl; 2mM CaCl 2 ; 10mM Tris-HCl JAHNICHEN et al. (1999) Acipenser baerii 50mM Tris-HCl TSVETKOVA et al. (1996) Pangasius bocourti 34mM NaCl CACOT et al. (2003) Macrozoarces americanus NaHCO 3 119mM YAO et al. (2000) Salmo gairdneri NaHCO 3 119mM STOSS e HOLTZ (1981) Oreochromis niloticus dh 2 O, NaHCO 3 119mM, NaCl 25mM GODINHO et al. (2003) Silurus glanis 17mM NaCl; 5mM Tris-HCl LINHART et al., 2005 *Espécies de água salgada Visto que a motilidade espermática possui baixa durabilidade e é um parâmetro quantitativo diretamente proporcional à sua capacidade fecundante, a coleta de sêmen deve ser feita tendo em vista otimizar essa característica, e a sua ativação deve ser realizada apenas quando estiver próximo dos gametas femininos (ovócitos) (BILLARD et al., 1995). 2.6 FATORES QUE AFETAM A QUALIDADE SEMINAL Apesar de diversos fatores diretos e indiretos afetarem a qualidade seminal, tais como as condições fisiológicas em função do estado nutricional dos reprodutores, doenças, idade, estresse, da qualidade da água e de outros agentes externos, os tópicos seguintes procurarão abordar as características que afetam diretamente a qualidade seminal, partindo de um pressuposto da sanidade física dos reprodutores. Entretanto, informações referentes a esses assuntos podem ser encontrados em RURANGWA et al., (2004). 16

27 2.6.1 Indução hormonal e período de coleta De acordo com ANDRADE e YASUI (2003), diversos indutores reprodutivos podem ser utilizados para a maturação final das gônadas, tais como macerado de hipófise desidratada de carpa, gonadotropina coriônica humana, hormônios liberadores de gonadotropinas, entre diversos outros. Em peixes, o uso de indutores é bastante difundido para a maturação gonadal final, principalmente em fêmeas de espécies reofílicas, visto que a maturação final dos ovócitos não acontece em ambientes lênticos (HORVATH e WOYRANIVICH, 1989). MIRANDA et al. (2005) verificaram incremento no volume seminal em Odontesthes bonariensis, ao comparar diversos indutores reprodutivos. Utilizando-se hcg, o incremento em volume foi de 16,7 vezes em relação ao controle, resultado superior aos demais indutores utilizados, como a hipófise desidratada de carpa (13,5X); hipófise de salmão (12,8X); GnRHa de salmão (16,7X) e GnRHa de mamíferos (10,8X). Em espécies como o bagre africano (Clarias gariepinus), a indução de machos não provocou diferença significativa no volume seminal (YASUI et al., 2003), possivelmente em função do indutor utilizado (hipófise de carpa), já que existem outros indutores que são mais eficientes para essa espécie (VIVEIROS et a., 2003). AMORIM (2002), utilizando diferentes indutores em machos de tilápia do Nilo, não encontrou diferença significativa entre aspectos quantitativos e qualitativos do sêmen, mostrando que a indução reprodutiva pode ser omitida. LIM et al. (2004) observaram que o uso de implantes de GnRHa incrementaram significativamente o volume seminal em linguados (Rhombosolea tapirina). Utilizando técnicas similares de implantes, MYLONAS e ZOHAR (2001) observaram incremento na produção espermática em peixes do gênero Morone com um máximo de 15mL/kg após 2 dias, ao passo que no controle os valores oscilaram entre 2 a 3mL/kg. Em Pangasius bocourti, a aplicação de hcg (2000 UI/kg) e sucedidas 12 horas após a aplicação, observou-se um incremento de 13 vezes o volume seminal (CACOT et al., 2003). Os mesmo autores observaram que o uso de GnRH associado à domperidona induziu uma menor produção espermática. 17

28 GJERD (1984) observou em salmão do Atlântico e truta arco-íris, uma produção seminal em intervalo semanais e obteve um volume final de 136,7 ± 59,2mL para salmão do Atlântico e 22,9 ± 14,5mL para trutas. Em ambos os casos, houve um decréscimo na produção com o decorrer do tempo. No referente ao período de coleta, CHRIST et al. (1996) observaram que parâmetros seminais como a concentração e volume apresentaram variação sazonal, ao passo que a osmolaridade do plasma seminal e qualidade dos movimentos espermáticos, tais como a linearidade, pouco foram afetados. Em geral, a qualidade espermática é incrementada nas estações reprodutivas, acompanhada pelo desenvolvimento gonadal Contaminação do sêmen Um dos grandes entraves para a coleta de sêmen de qualidade é a contaminação, que ocorre principalmente no momento da extrusão. Conforme citado anteriormente, a eliminação de fezes e urina realizada com uma leve compressão na região peritoneal reduzem os riscos de contaminação, entretanto, em muitas espécies, observa-se a eliminação do sêmen juntamente com urina, pois ambos são eliminados por um único poro uro-genital. Nessas espécies, freqüentemente amostras de sêmen podem apresentar contaminações com urina (SHIMODA, 2004; COSSON, 2004). É constatado que peixes de água doce são hiper-osmóticos em relação à água doce e a eliminação de urina é um dos principais mecanismos de osmo-regulação, compensando a entrada passiva de água. Em tilápia do Nilo, cultivada em ambientes dulcícolas, observa-se grande produção de urina, dificultando, inclusive, a coleta de sêmen. A urina em algumas espécies de peixe possui baixa osmolaridade e acaba ativando a motilidade espermática, devido à sua baixa concentração osmótica (PERCHEC-POUPARD et al., 1998; DREANNO et al., 1998). Além disso, parte das reservas de ATP intracelular pode ser utilizada (PERCHEC-POUPARD et al., 1998), o que pode resultar em menor sobrevivência de espermatozóides após o processo de criopreservação (OGIER DE BAULNY, 1997). Os efeitos negativos da contaminação 18

29 por urina em amostras seminais também são constatados no bagre europeu, Silurus glanis (BILLARD et al., 1997; LINHART et al., 1987 e 2004a). Devido aos inconvenientes supra citados, diversas metodologias têm sido adotadas com o intuito de evitar ou contornar a contaminação do sêmen com urina, incluindo a técnica de coleta de sêmen com o auxílio de cateteres (GLOGOWSKI et al., 2000), que são inseridos diretamente no lúmen testicular, como é o caso de salmonídeos. Entretanto, essa técnica nem sempre é factível visto que em peixes a morfologia da papila nem sempre é compatível para a inserção de cateteres. No caso de linguado, é possível a inserção de um cateter para a na uretra e eliminar a parte da urina presente na bexiga (DREANNO et al., 1998; PERCHEC-POUPARD et al., 1998). Esta técnica, porém, geralmente aumenta o nível de estresse do animal, além de causar irritação nas áreas cateterizadas. Outra técnica mais drástica de obter sêmen isento de contaminação é a coleta de sêmen testicular precedida do sacrifício dos animais (GRAFF e JANSSEN, 1996; KOPEIKA et al., 2003; RIBEIRO e GODINHO, 2003). Esta técnica é mais utilizada em peixes que apresentam testículo de pequeno tamanho (índice gonadossomático < 1%; ex. Clarias gariepinus; Silurus glanis), ou em peixes de tamanho reduzido, em que a extrusão para a coleta de sêmen se torna difícil de ser realizada (ex. espécies ornamentais). Em tilápias, o poro uro-genital de tamanho reduzido impossibilita a introdução de cateteres, e, no momento da extrusão, observa-se grande presença de urina. Para contornar esse inconveniente, HARVEY (1983) realizou a extrusão de machos de tilápia do Nilo em um recipiente contendo uma solução de alta osmolaridade. Apesar da re-imobilização dos espermatozóides ser uma técnica factível, ocorre um decréscimo da quantidade de ATP intracelular (COSSON, 2004). Outro inconveniente seria a presença da urina juntamente com a amostra de sêmen, o que tenderia a aumentar o volume (reduzindo a concentração de espermatozóides) e a deteriorar a qualidade da amostra. 19

30 2.6.3 Efeito da salinidade na qualidade seminal Peixes eurialinos cultivados em águas salinas foram estudados por diversos autores. LABBE e MAISSE (2001), trabalhando com truta marrom (Salmo trutta f. fario), compararam a qualidade seminal em animais mantidos em água doce e salgada, observando que a motilidade espermática foi inferior (55 ± 29%) e mais variável quando comparada com o grupo mantido em água doce (89 ± 7%), entretanto não encontrou diferenças na composição celular. Não houve também diferença no processo de criopreservação e os autores concluíram que a salinidade não é um fator determinante da qualidade espermática. Em tilápias, LINHART et al. (1999) observaram um acréscimo na concentração espermática, inversamente proporcional ao volume. LANDERGREN e VALLIN (1998), realizaram a fertilização e incubação em diferentes salinidades, observando melhores resultados em salinidades de 0 e 2. LEE et al. (1992), fazendo induções em tainhas (Mugil cephalus) em águas salgada e salobra, observaram melhores resultados em água salgada (32-34 ). Observaram também que a motilidade não era iniciada em salinidades menores que 13 e os melhores resultados foram encontrados em salinidades maiores que 17. HADDY e PANKHURST (2000) trabalhando com Acanthopagrus butcheriem sob diferentes salinidades observaram que a motilidade espermática era nula em salinidade 5. A 20, a motilidade iniciava imediatamente, chegando a mais de 5 minutos. A 35, a motilidade iniciava-se rapidamente, entretanto, houve uma queda brusca de motilidade após 2 minutos. Esses dados indicam que o ponto ótimo de salinidade gira em torno de 20, pois nessa salinidade a taxa de fecundação também foi otimizada. 20

31 2.7 CONSERVAÇÃO DO SÊMEN Refrigeração O sêmen de peixes pode ser conservado em diversas maneiras, incluindo a simples refrigeração, a liofilização e criopreservação. A refrigeração é o processo mais simples e pode ser realizada com a simples coleta do sêmen e posterior estocagem no refrigerador, ou caixa isotérmica contendo gelo, mantendo-se a temperatura em torno de 0 a 4ºC. O sêmen coletado pode ser estocado puro, sem diluição, ou então diluído, utilizando-se solução diluidora ou extender. A diluição aumenta a disponibilidade de oxigênio para as células e também reduz a concentração de proteínas do plasma seminal que podem degenerar com o tempo, comprometendo a qualidade seminal (BILLARD e COSSON, 1992; PADHI e MANDAL, 2000). Existem várias soluções diluidoras, compostas basicamente por sais e tampões, conforme pode ser observado na tabela 2. Essa solução diluidora também costuma ser utilizada como solução imobilizadora para atenuar os efeitos da contaminação por urina, podendo, inclusive, reimobilizar os espermatozóides natantes devido ao aumento da osmolaridade (LINHART et al., 2005; BILLARD e ZHANG, 2001). 21

32 Tabela 2. Principais soluções diluidoras (extender) utilizadas em peixes teleósteos Solução diluidora Componentes Espécie utilizada Referência NaCl NaCl 1,2% Brycon insignis SHIMODA (2004) trealose Trehalose Cyprinus carpio Solução de Ringer modificada Solução imobilizadora para Silurus Glanis Solução diluidora de Kurokura Soluções diluidoras à base de sais e açúcares Solução diluidora para ciprinídeos 7,5g NaCl 0,2g KCl 0,2g MgCl 2 0,4g CaCl 2 200mM NaCl; 30mM Tris-HCl 128,4mM NaCl 2,7mM KCl 1,4mM CaCl 2 2,4mM NaHCO 3 350mM glicose 30mMTris 300mM sacarose 30mMTris 350mM frutose 30mMTris 200mM KCl 30mMTris 75mM NaCl 70mM KCl 2mM CaCl 2 1mM MgSO 4 20mM Tris-base 0,5% glicina Misgurnus anguillicaudatus* WARNECKE e PLUTA (2003) ARAI et al. (1993) Silurus glanis LINHART et al. (2005) Cyprinus carpio Tinca tinca Ctenopharyngodon idella KUROKURA et al. (1984); WARNECKE e PLUTA, (2003) Cyprinus carpio HORVATH et al. (2003) Barbus barbus Chondrostoma nasus Ctenopharyngodon idella Cyprinus carpio Hypophtalmichtys molitrix Leuciscus cephalus Rutilus meidingerii Vimba vimba LAHNSTEINER et al. (2000) Associado à solução diluidora, pode-se também utilizar aditivos que ajudam a manter a integridade das células, como oxigênio (MAGYARY et al., 1996, BENCIC et al., 2000), antibióticos (MANSOUR et al., 2004; BILLARD et al., 2004), e substratos energéticos (OGIER DE BAULNY et al., 1999). 22

33 Tabela 3. Alguns protocolos de estocagem de sêmen à curto prazo, sob refrigeração. Espécie Solução diluidora Tempo de estocagem Referência Clarias gariepinus 150mM NaCl; 2,5mM KCl; 1mM CaCl 2 ; 1mM MgSO 4 ; Tris (ph 8,5) e 0,5% BSA ou gema de ovo. >4 dias MANSOUR et al. (2004) Scophthalmus 74mM NaCl; 27mM KCl; 1,6mM maximus NaHCO 3 ; 1,8mM CaCl 2 >2 dias CHEREGUINI et al. (1997) Gadus morhua e M. Sol. Mounib modif. (1% KHCO 3 ; aglefinus 0,2% glutationa; 4,27% sucrose) 40 dias DEGRAF e BERLINSKY (2004) Tilápias Sem diluição 5 dias CHAO et al. (1987) Urechis unicintus Sem diluição 6 dias KANG et al. (2004ª) Polyodon spathula 150mM NaCl; 5000 U.I. penicilina; 5 mg/ml streptomicina 56 dias BROWN and MIMS (1995) P. spathula 100m glicose; 20mM Tris 72h LINHART et al. (1995) S. platorhynchus 150mM glucose; 20mM Tris 72h LINHART et al. (1995) Anguilla japonica 1,3mM CaCl 2 ; 139,5mM NaCl; 1,6mM MgCl 2 ; 25mM KCl 28 dias OHTA e IZAWA (1996) Prochilodus lineatus Sem diluição 20h (30% motilidade) MARQUES e GODINHO (2004) Leporinus friderici Sem diluição 7h (30% motilidade) MARQUES e GODINHO (2004) Além dos fatores externos, como a temperatura e a composição da solução diluidora, o tempo de estocagem varia de acordo com a espécie. Em piabanha, o tempo de estocagem do sêmen não diluído e conservado em gelo foi de 7,42h, valor semelhante ao observado por MARQUES e GODINHO (2004) para espécies do gênero Leporinus. Em Melanogrammus aeglefinus e Gadus morhua, observou-se motilidade até 20 dias e uma diluição de 1:3 incrementou essa característica para até 40 dias (DeGRAF and Berlisky, 2004). Utilizando-se antibióticos e refrigeração, BROWN e MIMS (1995) observaram motilidade espermática em paddlefish por até 56 dias. Ainda no tocante à refrigeração, KOTEESWARAN e PANDIAN (2002) mantiveram sêmen post-mortem de Heteropneustes fossilis sob refrigeração (-20ºC) por até 240 dias, sendo o peixe sacrificado e diretamente conservado em freezer, apresentando, inclusive, motilidade e capacidade fecundante. Resultados semelhantes foram encontrados em outras espécies tais como Labeo rohita (ROUTRAY et al., 23

34 2006), Hemigrammus caudovitattus (DAVID e PANDIAN, 2006), e Puntius conchonius (KIRANKUMAR e PANDIAN, 2004) Outras técnicas A técnica mais difundida para a preservação seminal é a criopreservação em nitrogênio líquido, visto que apresenta inúmeras vantagens, entre elas a possibilidade de conservação por tempos mais prolongados, com baixo ou nulo decréscimo em qualidade ao longo do tempo, o que constitui assim um eficiente meio para a conservação ex-situ de gametas, servindo tanto para a conservação do germoplasma como para a reprodução de rotina. Aliada à técnica de androgênese, o sêmen criopreservado pode também articular a reposição de espécies ameaçadas de extinção ou mesmo extintas, visto que essa técnica apresenta uma herança 100% paternal (ARAI, 2000 e 2001; BABIAK et al., 2002). Diante desta realidade, foram desenvolvidos protocolos de criopreservação para mais de 200 espécies de peixes (BILLARD e ZHANG, 2001), sendo a maioria de espécies dulcícolas. No caso de tilápias, apesar de ser uma das espécies mais difundidas no cenário aquacultural, existem poucos estudos no tocante à criopreservação (HARVEY e KELLEY, 1988; RANA e McANDREW, 1989; GODINHO et al., 2003). Embora a maioria dos protocolos de criopreservação de gametas envolva a coleta por extrusão sucedida da criopreservação, alguns trabalhos abordam a criopreservação de gônadas inteiras, que, inclusive, podem ser transplantadas para outros indivíduos (NAGLER et al., 2001; CLOUD, 2003a; 2003b). Entretanto, de acordo com os mesmo autores, esse tipo de transplante deve ser realizado em linhagens isogênicas, visto que ocorrem problemas associados à histo-compatibilidade. Outra técnica importante é a liofilização de sêmen ou freeze-drying. Esta técnica consiste em desidratar as células espermáticas sob baixas temperaturas, e, após a desidratação, as células podem ser conservadas sob temperatura ambiente, preferencialmente sob vácuo. A desvantagem é que após a reidratação os espermatozóides perdem a motilidade, visto que no processo de desidratação estruturas frágeis como o axonema são danificados, exigindo então uma injeção de 24