Técnicas de biologia molecular e clonagem. Brasília-DF.

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1 Técnicas de biologia molecular e clonagem Brasília-DF.

2 Elaboração Joci Neuby Alves Macedo José Luiz de Souza Lopes Júlio Cesar Pissuti Damalo Produção Equipe Técnica de Avaliação, Revisão Linguística e Editoração Todos os direitos reservados. W Educacional Editora e Cursos Ltda. Av. L2 Sul Quadra 603 Conjunto C CEP Brasília-DF Tel.: (61) Fax: (61) equipe@ceteb.com.br editora@weducacional.com.br

3 SUMÁRIO APRESENTAÇÃO... 5 ORGANIZAÇÃO DO CADERNO DE ESTUDOS E PESQUISA... 6 Introdução... 8 Unidade I Biologia Molecular: Breve Histórico Capítulo 1 Um pouco de história Capítulo 2 A descoberta do DNA como transmissor da informação gênica e o surgimento da engenharia genética Unidade II Manipulação do DNA Capítulo 3 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) Capítulo 4 Sequenciamento de DNA Capítulo 5 Enzimas de restrição e ligases: montando o DNA Capítulo 6 Extração, purificação de DNA e eletroforese Capítulo 7 Vetores de clonagem molecular Capítulo 8 Transformação bacteriana Capítulo 9 Clonagem molecular Capítulo 10 Biblioteca de DNA genômico e de cdna... 60

4 Unidade III Técnicas de hibridização capítulo 11 Southern blot, northern blot e western blot Capítulo 12 Microarranjo de DNA e de proteínas Capítulo 13 Hibridização de colônias: triagem de bibliotecas Unidade IV Identificação de parceiros proteicos Capítulo 14 Duplo híbrido em leveduras Unidade V Depois da Dupla Hélice Capítulo 15 Biotecnologia Capítulo 16 Células-tronco, clonagem terapêutica e terapia gênica Capítulo 17 Clonagem reprodutiva Dolly Capítulo 18 Impressão digital do DNA Medicina forense Capítulo 19 Teste de paternidade Capítulo 20 Organismos transgênicos PARA (NÃO) FINALIZAR referências

5 APRESENTAÇÃO Caro aluno A proposta editorial deste Caderno de Estudos e Pesquisa reúne elementos que se entendem necessários para o desenvolvimento do estudo com segurança e qualidade. Caracteriza-se pela atualidade, dinâmica e pertinência de seu conteúdo, bem como pela interatividade e modernidade de sua estrutura formal, adequadas à metodologia da Educação a Distância EaD. Pretende-se, com este material, levá-lo à reflexão e à compreensão da pluralidade dos conhecimentos a serem oferecidos, possibilitando-lhe ampliar conceitos específicos da área e atuar de forma competente e conscienciosa, como convém ao profissional que busca a formação continuada para vencer os desafios que a evolução científico-tecnológica impõe ao mundo contemporâneo. Elaborou-se a presente publicação com a intenção de torná-la subsídio valioso, de modo a facilitar sua caminhada na trajetória a ser percorrida tanto na vida pessoal quanto na profissional. Utilize-a como instrumento para seu sucesso na carreira. Conselho Editorial 5

6 ORGANIZAÇÃO DO CADERNO DE ESTUDOS E PESQUISA Para facilitar seu estudo, os conteúdos são organizados em unidades, subdivididas em capítulos, de forma didática, objetiva e coerente. Eles serão abordados por meio de textos básicos, com questões para reflexão, entre outros recursos editoriais que visam a tornar sua leitura mais agradável. Ao final, serão indicadas, também, fontes de consulta, para aprofundar os estudos com leituras e pesquisas complementares. A seguir, uma breve descrição dos ícones utilizados na organização dos Cadernos de Estudos e Pesquisa. Provocação Pensamentos inseridos no Caderno, para provocar a reflexão sobre a prática da disciplina. Para refletir Questões inseridas para estimulá-lo a pensar a respeito do assunto proposto. Registre sua visão sem se preocupar com o conteúdo do texto. O importante é verificar seus conhecimentos, suas experiências e seus sentimentos. É fundamental que você reflita sobre as questões propostas. Elas são o ponto de partida de nosso trabalho. Textos para leitura complementar Novos textos, trechos de textos referenciais, conceitos de dicionários, exemplos e sugestões, para lhe apresentar novas visões sobre o tema abordado no texto básico. Sintetizando e enriquecendo nossas informações abc Espaço para você, aluno, fazer uma síntese dos textos e enriquecê-los com sua contribuição pessoal. 6

7 Sugestão de leituras, filmes, sites e pesquisas Aprofundamento das discussões. Praticando Atividades sugeridas, no decorrer das leituras, com o objetivo pedagógico de fortalecer o processo de aprendizagem. Para (não) finalizar Texto, ao final do Caderno, com a intenção de instigá-lo a prosseguir com a reflexão. Referências Bibliografia consultada na elaboração do Caderno. 7

8 Introdução Este Caderno de Estudos foi elaborado com o propósito de oferecer conhecimentos sobre as principais técnicas da Biologia Molecular e suas aplicações, além de fornecer informações sobre alguns temas recentes desta área da Ciência. Iniciaremos nosso Curso fazendo uma rápida viagem pela história da Biologia Molecular, conhecendo as principais descobertas no meio científico que consolidaram esta área da Ciência. Não podemos deixar de falar sobre o DNA, a molécula da vida que armazena nossa herança genética. Após um pouco de história, vamos abordar as principais técnicas utilizadas em biologia molecular que representam A tecnologia do DNA recombinante, como, por exemplo, a PCR. O que seria desta área da ciência sem essa ferramenta? Vocês verão que, depois dessa técnica, tudo aconteceu mais rápido. Para consolidar nossos conhecimentos, vestiremos nossos jalecos e seguiremos todas as etapas de um procedimento de clonagem, produção de DNA recombinante. Agora já estamos prontos para aprofundar nossos conhecimentos com técnicas específicas para a identificação de uma molécula de DNA, RNA e proteína entre milhões de moléculas, assim como procurar uma agulha no palheiro. Vamos introduzir os conceitos de uma técnica para identificação de interação entre proteínas, e o porquê da busca de parceiros proteicos. Como nós, as moléculas da vida convivem interagindo entre si. Para finalizar, exploraremos o que veio depois da Dupla hélice, a busca por informação em grande escala, não pensamos em um gene, mas, sim, no genoma; uma proteína é pouco para todo conhecimento que já armazenamos chegou a era das ômicas, e assim pensamos com todas biomoléculas. Vamos discutir um pouco sobre temas atuais e alguns polêmicos da Biologia Molecular, por exemplo, biotecnologia, clonagem terapêutica e as famosas células-tronco; a clonagem reprodutiva com o caso da ovelha Dolly e a terapia gênica. Vamos entender a importância da impressão digital do DNA, sua aplicação no teste de paternidade e na medicina forense. E, por fim, os organismos transgênicos tão polêmicos e, ao mesmo tempo, tão necessários. Bom estudos! Objetivos Introduzir os principais acontecimentos históricos que deram origem a biologia molecular. 8

9 Apresentar os grandes cientistas que contribuíram para o desenvolvimento da biologia molecular. Conhecer as principais características do DNA como a molécula que armazena as informações da vida. Introduzir os fundamentos das principais técnicas da biologia molecular. Contextualizar as aplicações das técnicas. Apresentar os diferentes vetores para clonagem e suas aplicações. Consolidar as informações sobre as técnicas apresentando um roteiro para clonagem. Reconhecer as diferenças entre as bibliotecas de DNA genômico e de cdna. Apresentar e estabelecer diferenças entre as técnicas de hibridização e suas aplicações. Introduzir o novo conceito de pesquisa: as ômicas. Apresentar a biotecnologia com exemplos que fazem parte do nosso cotidiano, a ciência em nossas casas. Introduzir os conceitos de clonagem reprodutiva e terapêutica, e terapia gênica. Discutir temas polêmicos e atuais: clonagem reprodutiva e terapêutica, terapia gênica e organismos transgênicos.»» Compreender a importância da impressão digital do DNA para a medicina forense e o teste de paternidade. 9

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11 Unidade I Biologia Molecular: Breve Histórico

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13 Capítulo 1 Um pouco de história O termo Biologia Molecular foi usado, pela primeira vez, por Warren Weaver em 1938, num relatório enviado para a Fundação Rockefeller: Entre os estudos para os quais essa fundação dá suporte, há um grupo, em um campo relativamente novo, que pode ser chamado de Biologia Molecular. O marco inicial da história da Biologia Molecular moderna foi a descoberta do DNA por Friedrich Meischer em 1869, como uma nova substância química presente no núcleo de células de glóbulos brancos, que foi inicialmente chamada de nucleína. A partir de então, vários acontecimentos no meio científico contribuíram para consolidar essa área da ciência, que, hoje, pode ser definida como uma forma de abordagem de um problema em nível molecular, onde a combinação de técnicas e teorias provindas da genética microbiana, microbiologia, bioquímica e biofísica auxiliam na busca das respostas. Abaixo, apresentaremos algumas das descobertas que contribuíram para a consolidação da Biologia Molecular como uma área das ciências biológicas Friedrich Miescher: bioquímico suíço que isolou do núcleo de células de glóbulos brancos provenientes de pus um composto de caráter ácido que foi denominado de nucleina. Esse composto era constituído por hidrogênio, oxigênio, nitrogênio e fósforo. Mais tarde, ele conseguiu isolar o mesmo composto de células de esperma de salmão. Este composto era resistente à ação da enzima pepsina, uma protease. O próprio Miescher acreditava que as proteínas fossem as moléculas da hereditariedade, ele não sabia que estava dando o pontapé inicial para elucidar esta questão Walther Flemming: considerado o criador da ciência da citogenética, foi o primeiro pesquisador a descrever o comportamento dos cromossomos durante o processo da divisão celular. Os termos mitose e cromatina foram primeiramente usados por ele Thomas Hunt Morgan: biólogo norte americano que formulou a teoria cromossômica da hereditariedade por meio dos seus trabalhos com a mosca Drosophila melanogaster. Ganhou o prêmio Nobel em Fisiologia e Medicina em Frederick Griffith: identificou o princípio transformante e hereditário, que, mais tarde, seria chamado de DNA. No clássico experimento realizado com Diplococcus pneumoniae, Griffith demonstrou o seguinte. 13

14 UNIDADE I Biologia Molecular: Breve Histórico Camudongos morreram após receberem uma injeção de uma estirpe virulenta de Diplococcus. Camundongos permaneceram vivos após injeção de uma estirpe avirulenta de Diplococus. Camudongos conservaram-se vivos após injeção da estirpe virulenta morta por aquecimento. Tudo bem até aqui! Camudongos morreram após injeção de uma mistura composta por estirpe virulenta morta por aquecimento juntamente com uma estipe avirulenta viva. Griffith isolou do sangue destes camudongos a estirpe virulenta da bactéria viva. Como isso pode acontecer, visto que a estirpe virulenta estava morta? Conclusão: alguma coisa foi transferida da bactéria virulenta morta para a bactéria avirulenta viva, conferindo-lhe a capacidade de matar os camudongos. A essa coisa, foi dado o nome de princípio transformante. No entanto, ele não conseguiu responder o que seria esse princípio. Por outro lado, Griffith também estava descobrindo a transformação bacteriana. Fiquem atentos, pois este enigma começa a ser elucidado em George Beadle e Edward Lawrie Tatum: foram os primeiros a fazer a relação: um gene uma enzima a partir de trabalho com o fungo Neurospora. Eles observaram que a mutação em um gene alterava a atividade de uma enzima. Este trabalho resultou nas bases da genética bioquímica. Juntos, ganharam o prêmio Nobel em Fisiologia e Medicina em Frederick Sanger: Bioquímico inglês, desenvolveu um método de sequenciamento de proteínas e determinou a sequência completa de aminoácidos da insulina. Em 1958, recebeu o prêmio Nobel em Química graças a este trabalho. Sanger aparecerá em nosso histórico mais uma vez ganhando um prêmio, agora em trabalhos com o DNA Oswald Avery, Colin McLeod e Maclyn McCarty: apresentaram as primeiras evidências de que as informações hereditárias estariam armazenadas no DNA e não nas proteínas, como ainda se pensava na época. Dessa forma, responderam a pergunta que Griffith não tinha elucidado em 1928: o princípio transformante é o DNA. Eles demonstraram que o princípio transformante era degradado pela ação de uma desoxirribonuclease pancreática (DNAse), mas não pela atividade de ribonuclease pancreática (RNAse) ou de enzimas proteolíticas (proteases). O mundo já começava a relacionar o DNA com a hereditariedade, mas, mesmo assim, ainda havia os que não acreditavam nesta proposição Rosalind Franklin: biofísica britânica que obteve o primeiro padrão de difração de raios-x para o DNA, o qual foi fundamental para a proposição da 14

15 Biologia Molecular: Breve Histórico UNIDADE I estrutura em dupla hélice para o DNA por Watson e Crick. Muitos dizem que ela foi negligenciada por Watson e Crick, que não a mencionaram por este feito em seu trabalho sobre a estrutura do DNA, visto que, a imagem por ela obtida do DNA foi de fundamental importância para que eles chegassem a estrutura de dupla hélice para o DNA. Independentemente do que a história relata, aqui nós daremos a ela a importância merecida pelo seu trabalho Erwin Chargaff: bioquímico austríaco, demonstrou uma razão constante entre as bases nitrogenadas adenina/timina e citosina/guanina no DNA, independentemente do DNA analisado Linnus Pauling: Propôs as estruturas de alfa hélice e folha beta para proteínas Alfred Hershey e Martha Chase: provaram que o DNA, e não a proteína, é o material genético. Colocaram um ponto final nesta questão no experimento conhecido como experimento do liquidificador. Eles adicionaram o isótopo radioativo P 32 (fósforo) em uma cultura de bacteriófagos (um tipo de vírus que infecta bactérias), e em outra cultura adicionaram o isótopo radioativo S 35 (enxofre). Lembre-se de que o DNA não possui enxofre e que as proteínas não possuem o elemento fósforo. Após infecções de E. coli com os bacteriófagos marcados, as amostras foram agitadas em um liquidificador para separar os bacteriófagos das bactérias. Eles observaram que no precipitado formado pelas bactérias havia apenas P 32, enquanto no sobrenadante onde se encontrava os bacteriófagos estava presente apenas S 35. Dessa forma Hershey e Chase constataram que o DNA dos bacteriófagos tinha sido transferido para o interior das bactérias James Watson e Francis Crick: determinaram a estrutura tridimensional do DNA Este é o marco principal da biologia molecular. No próximo capítulo, discutiremos essa descoberta. Estes pesquisadores receberam o prêmio Nobel em Medicina e Fisiologia em Francis Crick: postulou o dogma central da biologia molecular: DNA RNA Proteína Arthur Kornberg: bioquímico americano que isolou a enzima DNA polimerase e foi o primeiro pesquisador a sintetizar DNA in vitro. Foi agraciado com o prêmio Nobel em Medicina e Fisiologia em As ferramentas da tecnologia do DNA recombinante começam a surgir Matthew Meselson e Franklin Stahl: demonstraram que o DNA se duplica de forma semiconservativa, em um experimento considerado um dos mais bonitos da biologia molecular François Jacob e Jacques Monod: biólogos franceses que decifraram os mecanismos de regulação gênica em procariotos o operon. Atualmente, a 15

16 UNIDADE I Biologia Molecular: Breve Histórico expressão de proteínas heterólogas em bactérias tem como fundamentos os operons. Receberam o prêmio Nobel em Medicina e Fisiologia em Marshall Nirenberg e Phil Leder: biólogos americanos que juntos decifraram o código genético. Nierenberg ganhou o prêmio Nobel em Medicina e Fisiologia em 1968, com estudos que culminaram na descoberta de que cada aminoácido é codificado por, pelo menos, uma trinca de nucleotídeos Bernard Weiss e Charles Richardson: pesquisadores americanos que isolaram a enzima DNA ligase do bacteriofago T4, uma ferramenta essencial para a tecnologia do DNA recombinante H.O. Smith, K.W. Wilcox, e T.J. Kelley: isolaram a primeira endonuclease de restrição especifíca. Tal fato permitiu o início da consolidação da tecnologia do DNA recombinante, pois as endonucleases são uma das principais ferramentas nessa área David Baltimoree e Howard Temin: identificaram uma transcriptase reversa viral enzima capaz de sintetizar DNA a partir de um molde de RNA. A partir de então, houve uma reavaliação do dogma central e novas expectativas para a biologia molecular: DNA RNA Proteína. Receberam o prêmio Nobel em Medicina e Fisiologia em David Jackson, R.H. Symons e P. Berg: Produziram a primeira molécula de DNA recombinante. Estaria o homem começando a brincar de Deus? 1975 Edwin Southern Desenvolveu um método de detecção de sequência específica de DNA Southern blot. Assim começavam a surgir as técnicas da biologia molecular Robert Swanson e Herber Boyer Fundaram a empresa Genentech de biotecnologia na Califórnia. A biologia molecular começa a se torna rentável Frederick Sanger e Walter Gilbert: Independentemente desenvolveram métodos para determinar a sequência exata do DNA. Olha o Sanger retornando ao nosso histórico e, junto com Gilbert e Berg (DNA recombinante), ganhou mais um prêmio Nobel, agora em química, em Kary Mullis: inventou a técnica da Reação em Cadeia da Polimerase PCR, fato pelo qual foi agraciado com prêmio Nobel em química em Podemos dizer que, as pesquisas em engenharia genética e biologia molecular só chegaram ao nível de complexidade em que estamos atualmente graças a essa técnica. É difícil imaginar a manipulação do DNA sem a PCR Leroy Hood: Desenvolveu o sequenciamento automático. A partir de então se podia pensar em projetos genomas. 16

17 Biologia Molecular: Breve Histórico UNIDADE I 1988 NIH (National Institutue of Health) e DOE (Department of Energy): lançam nos EUA o consórcio do projeto genoma humano (PGH) TIGER (EUA): finalizam o sequenciamento do primeiro genoma sequenciado: Haemophilus influenzae Ian Wilmut: criador do primeiro clone de um mamífero adulto: a ovelha Dolly. Aqui fica novamente a questão: será que o homem está brincando de Deus? 2000 Consórcio PGH: Publica um rascunho do genoma humano com 30 mil genes Consórcio PGH: conclui o sequenciamento do genoma humano Pesquisadores brasileiros concluem o sequenciamento do genoma da bactéria Xylella fastidiosa, a causadora da doença do amarelinho em cítricos. A doença do amarelinho é causada devido a oclusão de vasos do xilema por agregados da bactéria Xylella fastidiosa. Isso impede a passagem de água e sais minerais até as folhas, causando um estresse hídrico. O sequenciamento do genoma da Xylella envolveu 192 pesquisadores em 34 laboratórios distintos. O resultado desse sequenciamento foi capa da revista científica Nature, aliás, foi a primeira vez que um trabalho desenvolvido nos laboratórios brasileiros foi capa dessa prestigiada revista. Este histórico ilustra a corrida cientifica na área da Biologia Molecular para elucidar os mecanismos moleculares que governam a vida, inclusive vários deles receberam o prêmio Nobel por isso. Há 60 anos não se conhecia a estrutura do DNA, na atualidade manipulamos está molécula com uma facilidade inimaginável naqueles tempos. Muitas perguntas ainda estão sem respostas, mas os conhecimentos acumulados pelos biologistas moleculares na atualidade são essenciais para futuras descobertas. 17

18 Capítulo 2 A descoberta do DNA como transmissor da informação gênica e o surgimento da engenharia genética A história da biologia molecular tem como marco inicial a descoberta do DNA em Desde então, várias perguntas foram a motivação para elucidar a importância desta molécula para o ser vivo e a conservação de suas características ao longo de gerações. Essas perguntas só começaram a ser respondidas há sete décadas, com o clássico experimento de Oswald Avery, Colin McLeod e Maclyn McCarty, em que eles demonstraram que o chamado princípio transformante era o ácido nucleico. E o ponto culminante das descobertas, que, enfim, forneceram os conhecimentos necessários para entender como a informação genética era armazenada e transmitida, foi a elucidação da estrutura do DNA, há quase 60 anos. O evento considerado o mais importante da Biologia do século passado, foi a elucidação da estrutura do DNA por Watson e Crick em A simplicidade das palavras dos autores no início da publicação dos dados não mensurava a importância de tal feito: We wish to suggest a structure for the salt of deoxyribose nucleic acid [DNA]. This structure has novel features which are of considerable biological interest (Nós queremos sugerir uma estrutura para o sal de ácido desoxirribonucleico [DNA]. Esta estrutura tem novas características que são de considerável interesse biológico). É importante ressaltar que outros pesquisadores contribuíram com informações importantes para este feito, como Maurice Wilkins e Rosalind Franklin, entre outros. Assim, hoje, sabemos que o DNA (Ácido desoxirribonucleico) é a molécula da vida, na qual toda a informação necessária para o desenvolvimento de um organismo está armazenada na forma de um código formado por 4 unidades, chamadas de desoxinucleotídeos (nucleotídeos). Esses nucleotídeos são simplificadamente abreviados pelas letras A (adenina), T(timina), C (citosina) e G (guanina) e são constituídos por um grupo fosfato ligado a uma pentose (desoxirribose açúcar de cinco carbonos) que, por sua vez, se encontra ligada a uma das quatro bases nitrogenadas (adenina, timina, citosina e guanina). A estrutura do DNA foi, então, demonstrada ser formada por duas cadeias de nucleotídeos que se polimerizam por meio de ligações fosfodiéster entre os nucleotídeos. Essas cadeias se encontram pareadas em uma orientação antiparalela e unidas por ligações de hidrogênio entre as bases nitrogenadas complementares (A/T e C/G). Essas duas cadeias formam uma hélice que lembra uma escada em espiral onde os degraus são as bases nitrogenadas e o corrimão é formado pelas desoxirriboses e os grupos fosfatos (Figura 1). Os autores fazem uma importante observação no texto que será mais tarde confirmada: It has not escaped our notice that the specific pairing we have postulated immediately suggest a possible copying mechanism 18

19 Biologia Molecular: Breve Histórico UNIDADE I for the genetic material (Não nos passou despercebido que o pareamento específico, que nós postulamos imediatamente sugere um possível mecanismos de cópia para o material genético). Logo em seguida, o mecanismo de replicação semiconservativa do DNA foi descrito por Matthew Meselson e Franklin Stahl (1958), mostrando, assim, que a informação contida em uma molécula de DNA era passada para novas moléculas. Com todos esses eventos, surgiu a Engenharia Genética, que podemos dizer ser toda manipulação do DNA que resulte em uma molécula de DNA recombinante, por este motivo é também conhecida por tecnologia do DNA recombinante. Mas, o que é esse tal de DNA recombinante? O DNA recombinante é o termo utilizado para definir uma molécula de DNA que sofreu alguma modificação quando comparada com a molécula de origem, seja uma clivagem com endonucleases de restrição, a inserção em um plasmídeo, a substituição ou inserção de um ou mais nucleotídeos, entre outras. Desta forma, as técnicas que permitem gerar um DNA recombinante constituem a tecnologia do DNA recombinante ou a engenharia genética. Figura 1. Estrutura do DNA (A) Representação das duas cadeias da molécula de DNA interligadas por ligações de hidrogênio entre as bases nitrogenadas complementares (A/T e C/G). S corresponde a pentose e P ao grupo fosfato. (B) Estrutura da molécula de DNA na forma de uma hélice, como descrita por Watson e Crick. Figura modificada do site: < retirada em 17/9/2011. Várias descobertas favoreceram a manipulação do DNA, como, por exemplo, a descoberta de enzimas tais como as endonucleases, a DNA polimerase, a T4 DNA ligase; o desenvolvimento de protocolos para extração de DNA de vários organismos, a manipulação de bactérias como vetores de propagação de DNA recombinante, a descoberta dos plasmídeos bacterianos (moléculas de DNA circular), a invenção das técnicas de PCR e de sequenciamento do DNA, entre outras. Hoje, a Engenharia Genética é essencial para os estudos na grande área da biologia que em algum momento envolvam a molécula de DNA. Por mais simples que sejam as análises, alguma ferramenta da engenharia genética será aplicada para auxiliar nas investigações, seja na simples análise do padrão de restrição de uma molécula de DNA, seja nas mais complexas formas de clonagem molecular em plasmídeo. Esse último, sempre tem início com a busca do gene de interesse dentro do genoma de um determinado 19

20 UNIDADE I Biologia Molecular: Breve Histórico organismo, a identificação de sua sequência de nucleotídeos até a inserção no plasmídeo, gerando, assim, uma molécula de DNA recombinante. Leia mais a respeito do assunto em: < Caldeira.pdf> < 20

21 Unidade II Manipulação do DNA 21

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23 Capítulo 3 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) A reação em cadeia da polimerase (PCR, Polymerase Chain Reaction), foi inicialmente desenvolvida por Saiki e colaboradores em 1985, e, em seguida, foi aprimorada por Kary Mullis, que tentou publicar seus experimentos nas duas revistas científicas mais importantes do mundo, a Science e a Nature, as quais não reconheceram a importância de tal conquista. Desta forma, Kary Mullis publicou seus dados sobre a amplificação do gene da β-globina humana em uma revista de fator de impacto imensamente menor, a Methods in Enzymology, e, mais tarde, em 1993, sua criação foi reconhecida e ele foi agraciado com o prêmio Nobel em quimíca. Mullis é conhecido como o criador da técnica de PCR, pois ele a idealizou da forma que é realizada atualmente, introduzindo o uso de uma enzima termoestável e os conceitos de oligonucleotídeos (primers) e, consequentemente, de especificidade do produto amplificado. O fator de impacto de uma revista é uma medida que reflete o número médio de citações de artigos científicos publicados naquela revista. É empregado frequentemente para avaliar a importância de uma dada revista em sua área, sendo que aqueles com um maior fator de impacto são considerados mais importantes. Saiki que descreveu a técnica precursora da PCR a realizava de forma rústica e onerosa, adicionando a enzima DNA polimerase de Escherichia coli, que possui ótima atividade a 37 C, a cada ciclo da reação. Pois a mesma era inativada durante as etapas de elevação de temperatura para 94 C. Com Mullis duas mudanças fundamentais foram adicionadas à técnica tornando a viável do ponto de vista científico e econômico. 1. O uso da enzima recém-identificada Taq, uma DNA polimerase termoestável isolada da bactéria de fontes termais, Thermus aquaticus, que se mantém estável em temperaturas próximas a 117ºC e tem como ótima temperatura 72ºC. 2. E as pequenas sequências de DNA, conhecidas como oligonucleotídeos, que delimitam a região a ser amplificada do DNA-alvo, tornando, assim, o produto amplificado específico. Logo em seguida, o interesse comercial pela técnica resultou no desenvolvimento dos termocicladores, máquinas que variam a temperatura e controlam o tempo, repetindo o ciclo por várias vezes, permitindo, assim, automatizar a técnica, eliminando as exaustivas etapas de transferência dos tubos com a reação por vários banhos-maria de temperaturas diferentes. 23

24 UNIDADE II Manipulação do DNA A técnica de PCR veio para resolver um grande problema nas análises de DNA, a baixa quantidade de DNA nas células, pois ela visa a amplificar uma região específica do DNA a partir de uma única molécula, de tal forma que, após inúmeros ciclos de amplificação, tenhamos quantidade de DNA suficiente para ser detectado e manuseado para diversos fins (Tabela 1). A PCR é um processo de replicação do DNA in vitro, com uma diferença básica em relação a este processo na célula, apenas uma região desejada do DNA é amplificada, diferente do que acontece na célula que a replicação é de todo o DNA celular. Tabela 1 Componentes necessários para a PCR. Componentes Função DNA Temperatura: 94ºC Um par de oligonucleotídeos Temperatura: 58 66ºC Alvo a ser amplificado Temperatura para separação das fitas do DNA-alvo Delimitar a região a ser amplificada Temperatura para o pareamento dos oligonucleotídeos no DNA-alvo Nucleotídeos* (C, G, A e T), Taq e temperatura: 72ºC Polimerização da nova fita de DNA *Na PCR utilizamos a nomenclatura dntps para a mistura dos quatros nucleotídeos. Os oligonucleotídeos são pequenos fragmentos de DNA de aproximadamente 17 a 35 pares de bases que são complementares as regiões que delimitam a sequência de DNA de interesse. Cada nucleotídeo pareia com uma das fitas do DNA. Estes podem conter além da sequência complementar ao DNA-alvo, pequenas sequências de DNA que caracterizam sítios de reconhecimento para enzimas (como endonucleases). Estas sequências serão incorporadas nas novas moléculas de DNA amplificadas (Figura 2). Figura 2. Exemplos de oligonucleotídeos. (A), Sequência de DNA-alvo. (B) e (C) Oligonucleotídeos (em negrito) pareados na sequência-alvo. (C) Oligonucleotídeos contendo sequência adicional (letras minúsculas). A PCR ocorre em três etapas de forma automatizada em um equipamento chamado de termociclador. 1. Desnaturação: corresponde a separação da dupla fita de DNA por elevação da temperatura para 94ºC durante 2 a 5 minutos. 2. Anelamento: com as fitas de DNA separadas a temperatura é reduzida para valores entre 58 e 66ºC, favorecendo o pareamento dos dois oligonucleotídeos nas fitas complementares do DNA, desta forma delimitando a região do DNA a ser amplificada. 24

25 Manipulação do DNA UNIDADE II 3. Extensão: a 72 ºC a enzima Taq posiciona-se próximo aos oligonucleotídeos e recruta os nucleotídeos para a síntese da nova fita de DNA. Finalizado o ciclo da reação composto por essas três etapas, o ciclo é repetido por aproximadamente 35 vezes até que se obtenha o DNA amplificado em quantidades suficientes para as análises (Figura 3). A quantidade de DNA amplificada segue uma função exponencial, onde: N= N 0 x 2 n N = quantidade final de DNA amplificado N 0 = quantidade inicial de DNA molde n = números de ciclos da reação Desta forma, para uma molécula de DNA-alvo teremos no final de 35 ciclos 2 35 moléculas. Figura 3. Reação em cadeia da polimerase (PCR). A reação ilustrada inicia com uma molécula de DNA que no final de dois ciclos originam 4 moléculas de DNA idênticas a molécula molde. Figura modificada do site: < retirada em 17/9/2011. Uma variável da técnica de PCR é a RT-PCR, que é composta por duas partes: a primeira corresponde a reação da transcrição reversa, e a segunda a PCR. A diferença básica entre a PCR e a RT-PCR é que na última se sintetiza moléculas de DNA a partir de moléculas de RNA mensageiro (mrna) como molde, diferente do PCR que o molde é DNA. Desta forma, podemos obter apenas a região codificadora de um gene eucarioto. Ou seja, a sequência que tem a informação final para a codificação de uma proteína. 25

26 UNIDADE II Manipulação do DNA Recordando: 1. O gene eucarioto é formado por sequências de DNA codificantes chamadas de éxons e por sequências não codificantes chamadas de íntrons. No processo de transcrição do gene, teremos um mrna chamado de transcrito primário. Esse transcrito passará por algumas etapas de processamento, sendo uma delas a retirada dos íntrons originando o mrna maduro, o qual será responsável pela codificação de uma proteína no processo de tradução (Figura 4). A partir do mrna maduro que ocorre a síntese de molécula de DNA na RT-PCR. 2. A descoberta da enzima transcriptase reversa resultou na reavaliação do dogma central, o qual postulava que o fluxo da informação genética era unidirecional: DNA RNA Proteína. Após tal descoberta, observou-se que DNA RNA Proteína. Figura 4. Transcrição do gene eucarioto e o processamento do mrna. Na primeira etapa da RT-PCR, moléculas de mrna são moldes para a síntese de uma fita de DNA complementar à sua sequência, chamada de cdna. Nesta etapa, utiliza-se apenas um oligonucleotídeo que geralmente não é tão específico quanto no PCR, pois este é formado por uma sequência de Timinas (oligo-dt) que irá anelar na cauda poli-a presente nos mrnas. A polimerização da cadeia de cdna é realizada pela adição dos nucleotídeos (dntps) complementares a fita de mrna pela enzima transcriptase reversa. Após a síntese do cdna, o mrna molde é degradado pela ação da enzima RNAse-H e o DNA fita simples fica disponível para iniciar a PCR (Figura 5). 26

27 Manipulação do DNA UNIDADE II Figura 5. Primeira etapa da RT-PCR. Síntese da fita de cdna apartir de mrna como molde pela ação da enzima transcriptase reversa. Após esta etapa o cdna está disponível para iniciar a PCR. A segunda etapa da reação é uma PCR, onde dois oligonucleotídeos específicos para o gene determinarão a região a ser amplificada. No primeiro ciclo da reação, temos apenas DNA fita simples, logo, apenas um dos nucleotídeos terá sua fita complementar para parear. No final deste ciclo, teremos como produto DNA fita dupla. Nos próximos ciclos, a reação ocorre seguindo uma progressão exponencial, como já descrita anteriormente. Mas o porquê de se obter DNA a partir de RNA? Como já mencionado acima, primeiramente porque esta é a forma que temos de obter apenas a sequência codificadora de um gene eucarioto. Mas você poderia perguntar: e daí? Em primeiro lugar, este é um dos pontos mais importante para o uso desta técnica, pois grande parte dos estudos em Biologia Molecular é realizado em bactérias, expressando-se e purificando proteínas de eucariotos neste organismo. Bactérias, diferente de eucariotos, não possuem íntrons em seu DNA, e desta forma, não possuem a maquinaria necessária para, após a transcrição, retirar os íntrons do mrna (Figura 4). Por isso a RT-PCR veio para resolver este problema, pois agora conseguimos obter apenas a sequência codificante dos genes eucariotos para, então, expressá-los em bactérias. Mas você ainda poderia questionar: não se pode expressar genes em organismos eucariotos? Sim, mas muitos genes eucariotos são muito grandes para serem manipulados de forma a gerarem DNA recombinante para este fim. Em segundo lugar, os cdnas nos permitem avaliar o padrão de expressão dos genes, de um organismo ou de partes deste organismo, em diferentes condições ambientais ou de estresses, por exemplo. A técnica de PCR continua tendo como uso principal o processo de amplificação de sequências específicas de DNA, mas, atualmente, várias novas aplicações são dadas a esta técnica, tais como: sequenciamento de DNA, análise de polimorfismo, diagnóstico de doenças genéticas e infecciosas, é aplicada nos testes de paternidade e na medicina forense, como também na criação de organismos transgênicos. 27

28 . UNIDADE II Manipulação do DNA Se a PCR é um processo de replicação do DNA in vitro, então: 1. Na célula, quem é responsável pela função da elevação da temperatura para 94ºC? 2. Quem é o análogo dos oligonucleotídeos na célula e qual a diferença básica entre eles? 3. Compare as etapas da PCR e a replicação do DNA na célula, e você entenderá o quanto foi merecido o prêmio Nobel que Mullis recebeu. Conheça animações para o melhor entendimento da PCR: < < < < < animation_ quiz_2.html> 28

29 Capítulo 4 Sequenciamento de DNA A primeira pergunta que deve ser respondida neste capítulo é: o que é o sequenciamento de DNA? É uma técnica que tem por finalidade determinar com fidelidade a sequência dos nucleotídeos que compõem um determinado DNA, independentemente de sua origem e, desta forma, dando as moléculas de DNA uma marca digital, ou seja, um registro que pertence só a ela. Trabalhando independentes, Frederick Sanger e Walter Gilbert desenvolveram as primeiras técnicas de sequenciamento do DNA. O primeiro método de sequenciamento de DNA foi desenvolvido em meados da década de 1970 e é conhecido como sequenciamento químico ou Maxan-Gilbert. O segundo, e mais utilizado, é o sequenciamento enzimático também conhecido como método de Sanger, método dideoxi ou método de terminalização. Sanger utilizou sua técnica para sequenciar o genoma do bacteriófago ϕ X174 (5.375 nucleotídeos), podendo ser considerada a primeira descrição do genoma completo de um organismo. Já Gilbert sequenciou um operon de um genoma bacteriano. Junto com Paul Berg, Gilbert e Sanger dividiram o prêmio Nobel em Fisiologia e Medicina, em A metodologia do sequenciamento de DNA, nos dias atuais, tem como fundamentos o método de Sanger, com várias modificações que permitiram automatizar a técnica. Para explanarmos o sequenciamento automático do DNA baseado no método de Sanger, é necessário relembrarmos alguns conceitos importantes referente ao DNA. Na síntese do DNA, temos como precursores os desoxinucleotídeos ou nucleotídeos (dntp) que possuem a seguinte estrutura (Figura 6). Figura 6. Esquema ilustrativo da estrutura de um desoxinucleotídeo ou nucleotídeo (dntp). P corresponde ao grupo fosfato; BN, base nitrogenada que pode ser adenina ou timina ou guanina ou citosina. E no centro a pentose na qual os cabornos estão numerados de 1 a 5. Estes nucleotídeos polimerizam por meio de ligação fosfodiéster entre uma hidroxila na posição 3 de um nucleotideo e o grupo fosfato na posição 5 do nucleotídeo a ser adicionado. A nova fita de DNA é estendida a partir da hidroxila 3 (Figura 7). 29

30 UNIDADE II Manipulação do DNA Figura 7. Esquema ilustrativo da polimerização da cadeia de DNA. A seta indica ligação fosfodiéster entre a OH 3 e o grupo fosfato 5. No método de sequenciamento automático de DNA, utiliza-se desoxinucleotídeos (dntp) e análogos, chamados de didesoxinucleotídeos (ddntp), que diferenciam dos dntps pela ausência da hidroxila na posição 3 (Figura 8). O que carreta essa alteração veremos a seguir. Figura 8. Esquema ilustrativo da estrutura de um didesoxinucleotídeo (ddntp). P, corresponde ao grupo fosfato; BN, base nitrogenada que pode ser adenina, timina, guanina ou citosina. E no centro, a pentose na qual os carbonos estão numerados de 1 a 5. A seta indica a ausência da hidroxila no carbono 3. Neste método de sequenciamento de DNA, realiza-se uma reação de PCR onde são adicionados os componentes básicos da PCR (enzima, DNA molde, os quatros dntps e apenas um oligonucleotídeo). Além, dos dntps são adicionados em quantidades menores (1%) os quatros ddntps. Estes ddntps encontram-se marcados com sondas fluorescentes distintas, que permitem distingui-los um dos outros quando são excitados com laser. Durante a reação de PCR, de forma aleatória, um ddntp é inserido na cadeia no lugar do respectivo dntp e a polimerização da cadeia é finalizada, parando assim a reação (Figura 9). 30

31 Manipulação do DNA UNIDADE II Figura 9. Esquema ilustrativo da interrupção da polimerização da cadeia nucleotídica devido a adição de um ddntp. A seta indica a ausência da hidroxila na posição 3, sendo assim impedindo a formação de uma ligação fosfodiéster com o próximo dntp. Logo, é fácil imaginar que se temos quantidades iguais dos ddntps competindo com os dntps para serem inseridos durante a polimerização da cadeia, o resultado da amplificação após os ciclos da reação, será uma mistura de fragmentos de DNA de diferentes tamanhos e que foram finalizados pela adição de um ddntp. Ou seja, os fragmentos diferenciam-se por um nucleotídeo até atingir o tamanho total do fragmento de DNA molde (Figura 10). Figura 10. Fragmentos de DNA produzidos após a adição de ddntps na PCR. As letras minúsculas e em negrito correspondem ao oligonucleotídeo utlizado na PCR. As letras maiores e em negrito no final de cada fragmento correspondem ao ddntp introduzido interrompendo assim a polimerização. 31

32 UNIDADE II Manipulação do DNA Concluída a PCR, a próxima etapa é a separação dos fragmentos de DNA amplificados por tamanho em eletroforese em gel de poliacrilamida em placa (sequenciadores mais antigos) ou em microcapilares (sequenciadores modernos). À medida que os fragmentos de DNA migram pelo gel eles são separados por ordem de tamanho crescente, estes a medida que se aproximam da extremidade do gel a sonda fluorescente presente na extremidade do fragmento é excitada por um feixe de laser e, então, emite uma fluorescência específica que o caracteriza. Esta fluorescência será capturada por um sistema de detecção que converte esse sinal em um gráfico chamado de eletreferograma (Figura 11). Um eletreferograma é composto por uma sequência de picos de quatro cores diferentes e cada cor corresponde a um dos quatros ddntps que foram adicionados durante a polimerização da molécula de DNA. Figura 11. Etapas do sequenciamento automático do DNA, baseado no método de Sanger. Figura modificada do site: < retirada em 17/9/2011. O maior progresso na técnica de sequenciamento automático é a utilização do laser e o uso de programas de computadores específicos para converter o sinal da fluorescência para uma linguagem por nós compreendida. 32

33 Manipulação do DNA UNIDADE II O desenvolvimento do sequenciamento automatizado do DNA foi essencial para o surgimento da era dos genomas, na qual vários projetos de sequenciamento de genoma de organismos diferentes foram desenvolvidos, entre eles o humano. Antes do sequenciamento ser automatizado, o sequenciamento de DNA manual era utilizado apenas em pequena escala e era inimaginável decifrar um genoma tão complexo quanto o humano. Novos aperfeiçoamentos foram adicionados à técnica de sequenciamento automático, como o Shotgun e o pirosequenciamento, tornando-a mais eficaz e rápida O sequenciamento do DNA e os projetos genomas foram os responsáveis pelo crescimento de uma nova área da ciência biológica, a bioinformática. A partir de então, surgiram os bancos de dados de sequências, várias ferramentas para análises de sequências foram desenvolvidas e toda essa tecnologia se encontra disponível para qualquer pessoa em sites na web. Veja animação sobre o sequenciamento de DNA: < < Pesquise as diferenças entre o método de Sanger e o método automático de sequenciamento de DNA. 33

34 Capítulo 5 Enzimas de restrição e ligases: montando o DNA Enzimas de restrição as endonucleases Um processo de defesa das bactérias contra infecções virais é chamado de restrição/modificação. Neste processo, os vírus bacterianos (bacteriófagos), ao invadirem a bactéria, têm seu DNA reconhecido por nucleases (enzimas) bacterianas e estas clivam o DNA viral de maneira específica, interrompendo o ciclo de replicação viral, que causaria a lise ou destruição da bactéria. Mas, por que o DNA da bactéria não é também picotado? Simples, para cada enzima de restrição as bactérias produzem uma enzima modificadora, que protege seu DNA da ação das nucleases, marcando-o para diferenciá-lo do DNA do vírus, geralmente por metilação. A enzima modificadora adiciona um grupo metil em uma ou duas bases, geralmente dentro do sítio de reconhecimento da enzima de restrição. Desta forma a molécula de DNA camuflada não é reconhecida pelas nucleases (Figura 12). Este processo ocorre em diferentes espécies e linhagens de bactérias. Figura 12 Nucleases clivando DNA viral em um processo de proteção da célula bacteriana contra a infecção viral. Figura modificada do site: < retirada em 17/9/2011. Essas nucleases são conhecidas como enzimas de restrição ou endonucleases (endo = dentro, nuclease = quebra) de restrição, são proteínas que reconhecem uma sequência específica dentro da dupla hélice do DNA e clivam em um ponto específico. As enzimas de restrição são classificadas em três tipos, I, II e III: Tipo I reconhecem uma sequência específica assimétrica e bipartida e clivam o DNA a mais de 1000 pares de bases depois. 34»» Tipo II São as mais importantes para a engenharia genética e possuem algumas características interessantes.

35 Manipulação do DNA UNIDADE II 1. Não precisam de ATP para realizar sua função. 2. Reconhecem uma sequência simétrica e específica de 4 ou 6 ou 8 nucleotídeos, ou seja, palíndroma, que é lida simetricamente. Em ambas as direções, lê-se a mesma coisa. Exemplo de palíndromo: OVO, ANA, ARARA, RADAR, e REVIVER. 3. Clivam dentro do sítio de reconhecimento. 4. Clivam a ligação fosfodiéster. Tipo III reconhecem uma sequência assimétrica de 5 a 7 nucleotídeos e clivam aproximadamente 24 a 26 pares de bases depois. Após reconhecer a sequência específica, as enzimas do tipo II fazem dois cortes na molécula de DNA, um em cada fita. Existem dois tipos de cortes (Figura 13). Os dois cortes são feitos no eixo de simetria da sequência específica, gerando extremidades chamadas de abruptas. Os dois cortes são feitos assimetricamente, mas no mesmo local nas duas fitas do DNA, resultando em extremidades coesivas. Figura 13. Tipos de extremidades produzidas no DNA pela ação de endonucleases do tipo II. (A) Extremidades coesivas geradas pela ação da endonuclease EcoRI. (B) Extremidades abruptas produzidas após clivagem com a endonuclease EcoRV. Em negrito sequência de reconhecimento das endonucleases. Atualmente, já foram isoladas mais de 1000 enzimas de restrição de diferentes bactérias (Tabela 2). Padronizou-se uma nomenclatura para as enzimas baseada na abreviação do nome do micro-organismo do qual a enzima foi identificada e isolada. Primeira Letra maiúscula = gênero. Segunda e terceira letras = espécie. Letra adicional = cepa da bactéria. Número em algarismo romano = número da enzima descoberta ou a linhagem da qual ela foi isolada: 35

36 UNIDADE II Manipulação do DNA Por exemplo: HindIII é isolada da Haemophilus influenzae, linhagem d III EcoRI é isolada de Escherichia coli, linhagem RY13 e foi a primeira enzima de restrição identificada nesta espécie. EcoRV é isolada de Escherichia coli, linhagem RY13 e foi a quinta enzima de restrição identificada nesta espécie. Tabela 2 Enzimas de restrição comumente utilizadas na engenharia genética. Visto que o DNA é formado por 4 nucleotídeos (A, T, G e C) e assumindo que estes nucleotídeos são distribuídos ao acaso dentro da sequência, a frequência de reconhecimento de uma enzima de restrição é 4 n, onde n é igual ao número de nucleotídeos que a enzima reconhece, desta forma, enzimas que reconhecem: 4 nucleotídeos cortam o DNA uma vez a cada 4 4 = 256 nucleotídeos; 6 nucleotídeos cortam o DNA uma vez a cada 4 6 = 4096 nucleotídeos; 8 nucleotídeos cortam o DNA uma vez a cada 4 8 = nucleotídeos. Porém, esses valores podem sofrer variações significativas, dependendo, principalmente, da composição de bases do DNA analisado. Uma importante consequência da ação dessas enzimas é que quando uma determinada molécula de DNA é clivada com uma endonuclease, ela vai clivar sempre nos mesmos pontos, gerando, assim, sempre o mesmo conjunto de fragmentos de DNA, ou seja, terá um padrão de restrição específico permitindo, desta forma, o isolamento de fragmentos de DNA de interesse. Os sítios das enzimas de restrição são distribuídos de forma randômica dentro da molécula, implicando a geração de fragmentos de DNA de vários tamanhos após a sua ação. 36

37 Manipulação do DNA UNIDADE II Outra consequência de fundamental importância, é o fato de após a clivagem do DNA, este passa a ter extremidades de fita simples (coesivas) que permitem a ligação de outra molécula de DNA que possua extremidade de fita simples e complementar. Ou seja, se tivermos dois fragmentos de DNA produzidos pela ação da mesma enzima de restrição, estes fragmentos podem ser unidos gerando uma molécula de DNA recombinante. Essas duas características, junto com a facilidade de se obter essas enzimas, fazem com que as enzimas de restrição sejam um dos pilares do desenvolvimento da engenharia genética. Esta é uma das ferramentas que permitiu manipular o DNA com extrema precisão. Além da construção de moléculas de DNA recombinantes, essas enzimas são utilizadas nos testes de paternidade, na medicina forense, na construção de bibliotecas genômicas como as usadas nos projetos genomas. Poderiamos estudar alterações na sequência do DNA por análise do padrão de restrição do mesmo? Conheça melhor as enzimas de restrição: < Ligases E agora que já mencionamos no capítulo anterior que podemos ligar dois fragmentos de DNA gerando um DNA recombinante, estudaremos como isso acontece no laboratório. Lembre-se, primeiro, qual a molécula na célula responsável pela ligação de fragmentos de DNA durante o processo de replicação. Como já foi visto durante o processo de replicação do DNA, uma das fitas é sintetizada de forma contínua e a outra descontínua. Nesta última, são sintetizados fragmentos de DNA, chamados de fragmentos de Okazaki, que serão ligados pela ação da enzima DNA ligase. Da mesma forma que ocorre na célula, nós realizamos a ligação de moléculas de DNA no laboratório, utilizando a enzima DNA ligase, só que, neste caso, a enzima é codificada pelo bacteriófago T4 e é conhecida como T4 DNA ligase. Essa enzima catalisa a ligação fosfodiéster entre a hidroxila 3 de um nucleotídeo e o grupo fosfato do próximo nucleotídeo. Ela pode ligar fragmentos de DNA com extremidades coesivas ou abruptas, porém extremidades abruptas são ligadas com baixa eficiência. Os requisitos necessários para a ação da T4 DNA ligase são (Figura 14) os seguintes. Hidroxila livre na extremidade 3 de um dos fragmentos do DNA. Grupo fosfato livre na extremidade 5 do outro fragmento de DNA. Temperatura baixa (16ºC a 22 C) para favorecer o encontro das moléculas de DNA e o pareamento das bases nitrogenadas complementares. 37