MEDIADORES INFLAMATÓRIOS E O PULMÃO

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1 1 de 5 20/10/ :22 MEDIADORES INFLAMATÓRIOS E O PULMÃO 13/07/2009 Prof. Dr. Helio Romaldini CITOCINAS E INFLAMAÇÃO PULMONAR Citocinas são proteínas produzidas por células, cuja função fisiológica primordial é regular o funcionamento celular. A citocina clássica é uma proteína glicosilada que é sintetizada transitoriamente por uma célula efetora apropriadamente estimulada. Seus efeitos são mediados através da ligação com receptores celulares em órgãos alvo. Esta regulação pode ser autócrina (os receptores estão na superfície da célula que produz a citocina) ou parácrina (os receptores estão na proximidade de células alvo do sistema imunológico ou não). Exceções a esta regra são bem freqüentes. É fundamental entender o conceito de que os eventos inflamatórios pulmonares são regulados por uma elaboradíssima e complexa rede de citocinas que interagem entre si. Acredita-se que as citocinas, vistas individualmente, funcionem como um alfabeto para decodificar um complicado sistema de sinalização celular. A resposta final da celular será determinada pelo número de diferentes mensagens recebidas concomitantemente na superfície celular. A complexidade do sistema aumenta quando levamos em conta a existência em paralelo das citocinas anti-inflamatórias e dos inibidores específicos de citocinas. Em circunstâncias fisiológicas, estas citocinas inibidoras servem como elementos imunomoduladores que limitam as reações inflamatórias sustentadas ou excessivas. Sob condições não fisiológicas, estes mediadores anti-inflamatórios podem ser insuficientes em controlar as atividades pró-inflamatórias nas doenças auto-imunes ou super-compensar e inibir a resposta imune adequada, favorecendo a quadros de infecção sistêmica. Esta regulação entre citocinas e seus inibidores torna-se ainda mais complicada pelo fato do sistema imune ter múltiplas vias redundantes com efeitos fisiológicos similares. Com exceção do antagonista do receptor da interleucina-1 (Interleukin (IL) 1 receptor antagonist) (IL-1ra), todas as citocinas anti-inflamatórias têm, pelo menos em pequeno efeito, algum grau de atividade pró-inflamatória. O vetor final deste balanço irá depender do timing em que esta citocina é liberada, onde é liberada, qual a densidade de seu receptor e qual a responsividade do órgão aos seus efeitos. Torna-se claro que as citocinas e suas interações participam ativamente na regulação de todos os eventos biológicos imunes e não-imunes, incluindo metabolismo, crescimento e diferenciação celular, morfogênese, fibrogênese e hemostasia. É sabido, também, que os efeitos regulatórios das citocinas são parte de um aparato regulador multifuncional que envolve o sistema nervoso e o sistema endócrino, integrados de forma hierárquica. Crescimento normal, reparação e desenvolvimento são funções apropriadas e coordenadas por estes processos reguladores. Uma desregulação em qualquer nível, particularmente na produção anormal ou defeituosa de citocinas, é parte importante na patogênese de várias doenças humanas. No pulmão merecem particular atenção as interleucinas inflamatórias 1-10, o TNF e o TGF-b. Os linfócitos T helper CD4+ (Th) podem se diferenciar funcionalmente em subtipos, a depender do microambiente em que está exposto. Este linfócito produtor de citocinas é classificado em células Th1 e Th2 com base em qual citocina produz. Classificação semelhante existe para os linfócitos citotóxicos CD8+ (células CD8+ T1 e CD8+T2). As células Th1 secretam grandes quantidades de IL-2, TNF-a e IFN-g. Estas citocinas ativam macrófagos e promovem a resposta imune mediada por células contra patógenos intra-celulares. As células Th2 produzem diversas citocinas anti-inflamatórias, incluindo IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13. Tanto as células Th1 quanto as Th2 sintetizam pequenas quantidades de GM-CSF e IL-3. As citocinas do tipo Th2 promovem resposta humoral imune contra patógenos extra-celulares. Inibição cruzada mútua entre Th1 e Th2 polarizam as funções das células Th em respostas mediadas por células ou humorais. PRINCIPAIS CITOCINAS INFLAMATÓRIAS Estão listadas na Tabela 1. Interleucina-1 (IL-1) Existem duas formas bioquímica e geneticamente distintas de IL-1, a IL-1a e IL-1b. Possuem homologia de 26% enquanto composição de amino-ácidos e são produtos de genes distintos localizados no cromossomo-2. Em sua maior parte, a IL-1 associada a células/ligada a membrana é a IL-1a. Fagócitos mononucleares, linfócitos B, células dendríticas, células endoteliais e fibroblastos apropriadamente estimulados expressam quantidades significativas de IL-1a. Esta forma de IL-1, através de mecanismos autócrinos e /ou parácrinos, consegue regular eventos inflamatórios locais sem induzir a reações sistêmicas. A IL-1b é a forma predominantemente existente nos fluidos extra-celulares. É sintetizada principalmente por monócitos estimulados por uma série de agentes endotoxina, sílica, fagocitose, leucotrienos e aderência a superfícies estranhas. Efeitos Imunológicos IL-1 ativa diretamente linfócitos e induz a síntese de IFN, fatores estimuladores de colônias e IL-6. Na presença de IL-1, a proliferação de linfócitos T e B sob efeito de fatores de crescimento é aumentada, a produção de anticorpos por linfócitos B é ampliada e a ligação entre células natural killer (NK) e células alvo torna-se mais evidente. A quimiotaxia linfocítica também fica maior. Efeitos Inflamatórios Atrai leucócitos ao sítio inflamado, induzindo a degranulação de basófilos e eosinófilos Estimula a síntese de tromboxanos por macrófagos e neutrófilos Potencia a atividade neutrofílica Aumenta a síntese de colágeno tipo I, III e V e de glicosaminoglicanos por fibroblastos Aumenta a síntese de PGE2, PGI2 e PAF pelo endotélio Altera a superfície dos receptores celulares do endotélio, facilitando a adesão e migração dos leucócitos para o espaço extra-vascular celular Estimula a expressão endotelial de pró-coagulantes, de fibroblastos e de células musculares lisas.

2 2 de 5 20/10/ : TNF (Fator de Necrose Tumoral) Existem duas formas bioquímica e geneticamente distintas de TNF, o TNF-a e TNF-b. Possuem homologia de 28% enquanto composição de amino-ácidos e possuem espectro de atividade biológica muito semelhante. As duas formas de TNF são sintetizadas por genes distintos localizados no braço curto do cromossomo 6, próximos ao complexo maior de histocompatibilidade (MHC). São produzidos por macrófagos (principal fonte biológica), células NK, astrócitos e células de Kupffer. Seus efeitos biológicos são multifuncionais, destacando-se: Inibição do crescimento de células tumorais Estimula o crescimento de fibroblastos Estimula a síntese de IL-6, IL-8, PGE2, IL-1a, CSF e de colagenase Estimula a expressão de moléculas de adesão neutrofílica Favorece o metabolismo oxidativo de neutrófilos (degranulação e fagocitose) Aumenta a síntese de prostaciclina pelo endotélio e favorece a atividade pró-coagulante Aumenta a produção de proteínas de fase aguda pelo fígado Favorece a quimiotaxia macrofágica 2.2 TGF-b (Fator de Crescimento Transformador-b) A família de proteínas TGF-b são proteínas essenciais na regulação de uma série de funções celulares. Seus efeitos podem ser inibitórios ou excitatórios a depender da célula alvo envolvida, da quantidade de TGF-b presente, da existência de outras citocinas envolvidas e do microambiente reinante. Seus efeitos biológicos são multifuncionais, destacando-se: Estimulação de osteoblastos e proliferação de células de Schwann Regulação da morfogênese Síntese de colágeno e fibronectina Inibição da proliferação linfocítica e endotelial. PRINCIPAIS CITOCINAS ANTI-INFLAMATÓRIAS As tabelas 2 e 3 listam as principais citocinas anti-inflamatórias e os inibidores de citocinas. Define-se como citocina anti-inflamatória, aquela citocina capaz de inibir a síntese da interleucina-1 (IL-1), do fator de necrose tumoral (TNF) e de outras citocinas pró-inflamatórias. IL-1ra A IL-1ra é uma seqüência de 152 amino-ácidos que funciona como inibidor específico de dois membros da família de IL-1; a IL-1a e a IL-1b. O gene humano da IL-1ra localiza-se no braço longo do cromossomo 2, muito próximo aos genes da IL-1a e a IL-1b. A IL-1ra bloqueia a ação das IL-1a e IL-1b por inibição competitiva ao nível de receptor de membrana. É produzida por monócitos e macrófagos e liberada na circulação em quantidades 100 vezes maior que IL-1a e IL-1b, após estimulação por lipopolissacáride (LPS). A síntese de IL-1ra e IL-1b é regulada diferenciadamente em promoters próprios. As citocinas anti-inflamatórias IL-4, IL-6, IL-10 e IL-13 inibem a síntese de IL-1b, apesar de estimularem a síntese de IL-1ra. O polimorfismo existente na regulação genética da síntese de IL-1ra explica por que um excesso de síntese de IL-1ra em relação a IL-1a ou IL-1b aumenta a susceptibilidade a diversas doenças humanas, entre elas a tuberculose; por outro lado, a produção inadequada de IL-1ra no pulmão predispões ao surgimento de lesão pulmonar grave e resulta em maior mortalidade por síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA). Já que a IL-1 participa ativamente de uma série de processos pró-inflamatórios, a IL-1ra tem sido exaustivamente estudada em ensaios clínicos como um inibidor específico da IL-1. Apesar de dados convincentes da participação da IL-1 na sepse bacteriana, os resultados de um estudo fase III em sepse grave empregando IL-1ra foram desapontadores. IL-4 A IL-4 é uma citocina que influencia em demasia a diferenciação das células Th. Secreção precoce de IL-4 leva a diferenciação das céls. Th em Th2. Estas, por sua vez, secretam sua própria IL-4 formando-se um ciclo autócrino. A secreção de IL-4 e IL-10 por céls. Th2 leva a supressão da resposta Th1 (down regulation) da produção de macrófagos e inibição da diferencoação em população Th1. Além de céls Th2 maduras, a IL-4 pode ser produzida por mastócitos e basófilos, mediando o recrutamento e ativação da linhagem basofílica, estimulando a produção de IgE (via a diferenciação de céls. B em secretoras de IgE). Sua atividade inibitória sobre citocinas pró-inflamatórias é marcante. Bloqueia as citocinas derivadas de monócitos (IL-1, TNF-a, IL-6, IL-8 e proteína inflamatória de macrófagos (MIP)-1a)). Suprime toda atividade macrofágica, além de estimular a síntese de IL-1ra. Na presença de infecção bacteriana tem papel não totalmente compreendido. Em modelos experimentais de pneumonia por Gram-negativos, a IL-4 aumenta o cleararnce de P. aeruginosa de tecidos pulmonares; em modelos por Gram positivos funciona como fator de crescimento para S. aureus, aumentando a letalidade do processo. Pode, ainda, potenciar a proliferação de endotélio vascular e fibroblastos. IL-6 Possui tanto papel pró-inflamatório (é marcador de ativação sistêmica de citocinas pró-inflamatórias) quanto anti-inflamatório. Faz parte de uma família de receptores ligandes que incluem a IL-11, o fator de inibição da leucemia, fatores neurotróficos ciliares e a cardiotropina-1. Seu papel anti-inflamatório reside no fato de causar down regulation da IL-1 e TNF, aumentar a síntese de glicocorticóides e promover a síntese de IL-1ra e receptor solúvel de TNF. Além disso inibe a produção de citocinas pró-inflamatórias como o GM-CSF, IFN-g e MIP-2. IL-10

3 3 de 5 20/10/ :22 É a citocina anti-inflamatória mais importante da resposta imune humana. É potente inibidor de citocinas Th1 (IL-2 e IFN-g). Também é potente desativador da atividade pró-inflamatória de monócitos e macrófagos. Sintetizada por células Th2 CD4+, monócitos e células B. Uma vez ligado a seu receptor celular, inibe TNFa, IL-1, IL-6, IL-8, IL-12, fator estimulador de colônias de granulócitos, todas citocinas derivadas de monócitos e macrófagos. IL-10 inibe a expressão na superfície celular de moléculas MHC classe II e da molécula de reconhecimento e sinalização CD14. Também inibe a produção de células NK pelos neutrófilos, o fator nuclear Kappa-beta, além de promover a degradação do RNA mensageiro por citocinas pró-inflamatórias. Já é possível mensurar os níveis séricos de IL-10 circulante em doenças sistêmicas. Sabe-se que pacientes que expressam preferencialmente altos níveis de IL-10 e níveis reduzidos de TNF-a, são mais propensos a morrer de meningococcemia e outras infecções comunitárias. Baixas concentrações de IL-10 em pacientes com lesão pulmonar aguda podem sugerir o desenvolvimento de SDRA. Em voluntários humanos sadios, a administração de IL-10 após estímulo com endotoxina atenua os efeitos sistêmicos da endotoxina, a resposta neutrofílica e a produção de citocinas. De uma forma geral a IL-10 protege o hospedeiro de inflamações sistêmicas após lesão induzida por toxina, mas há uma série de evidências mostrando que aumenta a letalidade em indivíduos susceptíveis. IL-11 IL-11 possui diversas semelhanças com IL-6, incluindo o mesmo ligande (receptor gp 130). Inicialmente descrito como fator de crescimento hematopoiético com intensa atividade na plaquetogênese, a IL-11 foi liberada para uso clínico como agente restaurador de plaquetas após supressão por quimioterapia. Paralelamente a isto é capaz de atenuar a síntese macrofágica de IL-1 e TNF através de up regulation do fator nuclear inibitório kappa-b. Inibe, ainda, a síntese de IFN-d e IL-2 por células CD4+. IL-13 IL-13 é sintetizada por linfócitos T ativados. Divide uma série de semelhanças imunológicas com IL-4. Através de down regulation diminui a produção de TNF, IL-1 e IL-8 por monócitos.através de up regulation controla a expressão celular de integrinas beta-2 e antígenos MHC classe II. TGF-b Sintetizado como um precursor inativo, o TGF-b precisa ser ativado para desempenhar sua função. É importante regulador da proliferação celular, diferenciação e formulação da matriz extra-celular. Induz a diferenciação de células escamosas do epitélio brônquico; inibe a proliferação do pneumócito tipo II e diminui a expressão da proteína A do surfactante humano. TGF-b parece contribuir para a instalação da fase fibroproliferativa da SDRA. Como outras citocinas, tem efeitos pró e anti-inflamatórios, funcionando como um modulador de outras citocinas ou de fatores de crescimento. TGF-b suprime a proliferação e diferenciação de células T e B e limita a síntese de IL-2, IFN-g e TNF. Semelhante a IL-10, age como um desativador de monócitos e macrófagos, tendo pouca ação sobre a produção de IL-1. RECEPTORES SOLÚVEIS DE CITOCINAS COMO MOLÉCULAS ANTI-INFLAMATÓRIAS Tanto o receptor para TNF-a tipo 1 (p55) e tipo 2 (p75) podem existir na superfície celular como uma unidade transdutora de sinal ou em forma solúvel no fluido extra-celular. Esta forma solúvel existente na circulação retém a mesma capacidade e afinidade de se ligar ao TNF. Os receptores solúveis competem com os receptores de membrana pela ligação com TNF; altas quantidades de receptores solúveis de TNF funcionam como inibidores específicos da atividade de TNF em órgãos alvos. Sob certas situações os receptores de TNF funcionam mais como agonistas de TNF do que antagonistas. Isto ocorre especificamente para o receptor solúvel tipo 2 (p75). Este receptor pode se ligar ao TNF-a na circulação e prolongar sua meia vida; porém, o TNF-a pode se dissociar prontamente do receptor tipo 2, prolongando a atividade do TNF na circulação sistêmica com os efeitos deletérios disto. INTERAÇÃO ENTRE CITOCINAS E CÉLULAS INFLAMATÓRIAS O pulmão é constantemente exposto a antígenos inalatórios e partículas estranhas. A maior parte destas substâncias é normalmente eliminada pelas defesas pulmonares sem o desenvolvimento de uma resposta inflamatória, porém, em determinadas situações (pneumonias infecciosas, pneumonites tóxicas, pneumopatias idiopáticas) um complexo emaranhado de citocinas interfere nesta regulação pulmonar, levando a alterações particulares. MACRÓFAGO ALVEOLAR O macrófago alveolar é capaz de sintetizar uma série de citocinas que participam ativamente dos mecanismos de defesa pulmonar, remodelamento tecidual e fibrose. Um dos estímulos mais potentes para o macrófago alveolar produzir citocinas é a endotoxina. Macrófagos alveolares estimulados por endotoxina sintetizam IL-6 e TNF em grande quantidade, e, em menor quantidade, IL-1b. A capacidade do macrófago alveolar em produzir estas citocinas inflamatórias é significativamente menor que o de seu precursor, o monócito circulante. Acredita-se que esta menor capacidade em produzir IL-1b pelo macrófago alveolar seja um mecanismo que previna cargas rotineiras de partículas inalatórias que induzem a eventuais pneumonias. Além dessas interleucinas, o macrófago alveolar produz IL-8, TGF-b, TGF-a, PDGF, IGF-1 e IFN-g. Paralelamente a

4 4 de 5 20/10/ :22 isto, tanto a IL-1b e o TNF funcionam como indutores de produção de IL-8, que por sua vez é fundamental no recrutamento de neutrófilos para o pulmão. Interessante notar que o macrófago alveolar é mais ativado em resposta a estímulos externos, tais como microorganismos, diferentemente de fibroblastos, p. ex., que produzem grandes quantidades de citocinas (IL-6, CSFs, IL-8 e IL-1a) em resposta a IL-1 e TNF sintetizados pelo macrófago. Tabela 1. Citocinas Inflamatórias Citocina Origem Efeito Biológico Principal IL-1 IL-1b: monócitos estimula proliferação células T IL-1a: macrófagos, fibroblastos estimula liberação IL-2 estimula expressão de receptor de IL-2 estimula crescimento de células B ativa endotélio e proliferação de colágeno IL-2 linfócitos Th1 estimula linfócitos T estimula linfócitos B estimula células NK IL-3 linfócitos T estimula mastócitos e síntese de histamina estimula megacariócitos, neutrófilos e macrófagos IL-4 linfócitos Th2 co-estimulador da proliferação de linfócitos B estimula produção de IgE e IgG1 IL-5 linfócitos Th2 estimula proliferação de eosinófilos estimula produção Ig IL-6 células Th2, macrófagos proliferação linfócitos T IL-7 timo proliferação células T citolíticas IL-8 monócitos, macrófagos fator quimiotático seletivo de neutrófilos IL-9 linfócitos T proliferação de progenitores eritropoiéticos IL-10 linfócitos Th2 inibe produção células Th1 Inibe produção de Il-2, IL-3, IFN-g, GM-CSF TNF macrófagos multifuncionalidade TGF-b macrófagos, plaquetas multifuncionalidade Tabela 2: Citocinas com Atividade Anti-Inflamatória Citocina Origem Atividade Biológica IL-1ra Macrófago/cel. dendrítica Inibidor específico IL-1a e IL-1b IL-4 Céls.T (Th2), mastócitos, céls. Promove desenvolvimento linfócito Th2, B inibe síntese de citocinas pró-inflamatórias induzidas por LPS IL-6 Céls. T, céls. B, PMN Inibe síntese de TNF e IL-1 por macrófagos IL-10 Céls. T (Th2), Inibe monócitos e macrófagos, inibe monócito/macrófago, céls. B produção de citocinas por neutrófilos e inibe resposta linfocítica do tipo Th1 IL-11 Céls. estroma, fibroblastos Inibe resposta de citocinas pró-inflamatórias por monócitos e macrófagos e promove a resposta linfocítica do tipo Th2 IL-13 Céls.T (Th2) Homóloga a IL-4 TGF-b Constitutivamente expresso Inibe monócitos e macrófagos, inibe em várias células síntese de citocinas pró-inflamatórias Tabela 3: Receptores Solúveis de Citocinas com Atividade Anti-Inflamatória Receptor Solúvel Fonte Celular Ação Biológica Receptor solúvel TNF p55 inúmeras Liga-se aos trimers de TNF na circulação, previnindo interação entre os ligantes e receptores de membrana de TNF Receptor solúvel TNF p75 inúmeras Liga-se aos trimers de TNF na circulação, previnindo interação entre os ligantes e receptores de membrana de TNF

5 5 de 5 20/10/ :22 Receptor solúvel IL-1 tipo 2 Céls. B, neutrófilos Une-se aos ligantes circulantes de IL-1, previnindo a interação entre Il-1b e receptor tipo 1 de IL Proteína ligadora de IL-18 Inúmeras Domínio extra-celular solúvel de IL-18 Receptor ligado a membrana IL-1 Céls. B, neutrófilos tipo 2 Literatura Recomendada Kasai, T, Inada, K, Takakuwa, T, et al (1997) Anti-inflammatory cytokine levels in patients with septic shock. Res Commun Mol Pathol Pharmacol 98,34-42 Dinarello, CA (1998) Interleukin-1, interleukin-1 receptors and interleukin-1 receptor antagonist. Int Rev Immunol 16, van de Poll, T, Marchant, A, van Deventer, SJH (1997) The role of interleukin-10 in the pathogenesis of bacterial infection. Clin Microbiol Infect 3, Dinarello, CA (1996) Biologic basis for interleukin-1 in disease. Blood 87, Dinarello CA. Induction of interleukin-1 and interleukin-1 receptor antagonist. Semin Oncol 1997; 24(suppl):S9 81, S9 93 Opal, SM, Fisher, CF, Dhainaut, J-F, et al (1997) Confirmatory interleukin-1 receptor antagonist trial in severe sepsis: a phase III randomized, double-blind, placebo-controlled multicenter trial. Crit Care Med 25, Wang P, Wu P, Siegel ML, et al. Interleukin (IL)-10 inhibits nuclear factor kappab (NF-kappaB) activation in human monocytes: IL-10 and IL-4 suppress cytokine synthesis by different mechanisms. J Biol Chem 1995: Marchant, A, Deviere, J, Byl, B, et al (1994) Interleukin-10 production during septicaemia. Lancet 343,