ASPECTOS BIOLÓGICOS, EPIDEMIOLÓGICOS, CLÍNICOS E DE DIAGNÓSTICO DO Toxoplasma gondii

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1 Universidade Federal de Goiás Escola de Veterinária e Zootecnia Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal Disciplina: SEMINÁRIOS APLICADOS ASPECTOS BIOLÓGICOS, EPIDEMIOLÓGICOS, CLÍNICOS E DE DIAGNÓSTICO DO Toxoplasma gondii Nome: Rebeka Cristine de Bastos Costa Orientadora: Valéria de Sá Jayme GOIÂNIA 2013

2 REBEKA CRISTINE DE BASTOS COSTA ii ASPECTOS BIOLÓGICOS, EPIDEMIOLÓGICOS, CLÍNICOS E DE DIAGNÓSTICO DO Toxoplasma gondii Seminário apresentado junto à Disciplina de Seminários aplicados do Programa de Pós-graduação em Ciência Animal da Escola de Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Goiás. Nível: Mestrado Área de Concentração: Sanidade Animal, Higiene e Tecnologia de Alimentos Linha de Pesquisa: Enfermidades de importância em saúde pública Orientadora: Prof. Dr. Valéria de Sá Jayme Comitê de orientação Prof. Dr. Guido Fontgalland Coelho Linhares Prof. Dr. Andréa Caetano da Silva GOIÂNIA 2013

3 LISTA DE FIGURAS iii FIGURA 1 - Morfologia geral da forma taquizoíta do Toxoplasma gondii, protozoário do Filo Apicomplexa, o qual possui as estruturas características do complexo apical, como róptrias, micronemas, anéis polares FIGURA 2 - Ciclo biológico do Toxoplasma gondii e suas três fases de vida: taquizoítos, bradizoítos (cistos tissulares) e esporozoítos (oocistos), com os diferentes tipos de hospedeiros intermediários (mamíferos e aves) e o hospedeiro definitivo, felino FIGURA 3 - Corte de cérebro de paciente com neurotoxoplasmose, mostrando duas lesões necróticas extensas (setas) FIGURA 4 - Recém-nascidos com as formas clínicas da toxoplasmose congênita. A. Hidrocefalia; B. Microcefalia FIGURA 5 - Cisto tecidual de Toxoplasma gondii identificado no material cerebral de camundongo, inoculado com material cerebral de ovino. Ampliação de 400x... 8 FIGURA 6 - Esquema demonstrativo das três etapas da PCR convencional: A. No primeiro passo, ocorre a desnaturação, então a dupla fita de DNA separa-se, a uma temperatura de 94ºC por um minuto, dando origem a duas fitas simples de DNA. B. A uma temperatura de 30 a 60ºC por cerca de um minuto, ocorre o segundo passo e tem-se o anelamento dos primers em cada uma das fitas simples, em posições específicas. C. O terceiro passo ou extensão dá-se pela ação da DNA polimerase, a uma temperatura de 72ºC por dois minutos, a qual realiza o processo de extensão da sequência a ser amplificada FIGURA 7 Amplificação da sequência de 529 pb (pares de base) e detecção pela PCR do DNA de Toxoplasma gondii em água contaminada experimentalmente FIGURA 8 - Oocistos não esporulados de Isospora felis (A), Isospora rivolta (B), e Toxoplasma gondii (C), em comparação com esporocisto esporulado de Sarcocystis muris (D). Ampliação de 1600 x FIGURA 9 - Mapa do Brasil demonstrando a distribuição dos isolados do Toxoplasma gondii: Pará, linhagem BrI, em frangos; Espírito Santo, tipo BrI em frangos; São Paulo, BrI, BrII e BrIII em cães e gatos e tipo II, em ovinos; Paraná, tipos BrI, BrII e BrIII, em cães e gatos; Rio Grande do Sul, tipos BrIII e BrIV, em frangos

4 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA Toxoplasma gondii Métodos de diagnóstico e caracterização molecular Reação em cadeia da polimerase Teste de polimorfismo de comprimento de fragmentos de DNA gerados por enzimas de restrição sobre produtos amplificados pela reação em cadeia da polimerase Diagnóstico e caracterização molecular do Toxoplasma gondii Diagnóstico molecular Caracterização molecular CONSIDERAÇÕES FINAIS REFERÊNCIAS... 23

5 1 INTRODUÇÃO Apesar dos avanços no conhecimento e na prática médica, as doenças parasitárias continuam a ser um importante problema de saúde global (VASOO & PRITT, 2013). Entre as principais enfermidades de importância mundial, estão incluídas as causadas por protozoários, os quais podem atingir tanto os seres humanos como os animais (THEKISOE & INOUE, 2011), um exemplo é o caso do Toxoplasma gondii, o qual é capaz de infectar mamíferos e aves (SILVEIRA, 2009). O desenvolvimento de métodos simples, rápidos e sensíveis para a detecção e identificação desse protozoário é importante para o aperfeiçoamento dos diagnósticos e dos estudos epidemiológicos da toxoplasmose (SU et al., 2010). Assim, com o crescimento da biologia molecular foram desenvolvidas ferramentas baseadas na amplificação do DNA, as quais aprimoraram e aperfeiçoaram o diagnóstico do parasita em questão (WAAL, 2012). Inicialmente, a aplicação de técnicas moleculares para o diagnóstico do T. gondii foram concentradas na detecção do mesmo. Porém, com o desenvolvimento de métodos baseados em uma variedade de marcadores genéticos para as populações deste protozoário proporcionou a identificação de diferentes linhagens genotípicas, o que aprimorou as informações já conhecidas, em relação à epidemiologia e à patogenicidade para a toxoplasmose (SU et al., 2010). Por ser um potencial causador de zoonose e de distribuição cosmopolita, o T. gondii tem sido um dos protozoários mais amplamente estudados. Os recentes desenvolvimentos na área da biologia molecular forneceram ferramentas, as quais foram utilizadas para o aprofundamento do conhecimento dessa espécie, de elevada importância na clínica médica e veterinária. Diante disto, objetivou-se com esta revisão de literatura, abordar a biologia do T. gondii e a aplicação dos métodos moleculares utilizados para a detecção e caracterização das diferentes linhagens genotípicas do T. gondii.

6 2 REVISÃO DE LITERATURA Toxoplasma gondii Os protozoários pertencem ao Reino Protista, sub-reino Protozoa (grego, protos=primeiro e zoon=animal) e são classificados em sete filos, destacando-se o Apicomplexa, o qual representa um dos maiores grupos de protozoários parasitas, compreendendo muitas espécies de importância veterinária e médica (TENTER et al., 2002). Esse filo é composto por parasitas intracelulares obrigatórios que se caracterizam por possuírem, em determinadas fases de sua vida, uma estrutura chamada de complexo apical, o qual é composto por organelas secretórias especializadas, entre elas as róptrias, os micronemas e os elementos do citoesqueleto, como os anéis apicais (Figura 1) (MONTEIRO, 2006). Este conjunto de organelas está localizado na região anterior da célula parasitária, pois possui como função principal facilitar a entrada dos parasitas nas células hospedeiras (TENTER et al., 2002). Dentro do Filo Apicomplexa destaca-se a família Sarcocystidae por conter cerca de 200 espécies. Ainda, essa se subdivide em subfamílias, sendo uma delas a Toxoplasmatinae, na qual estão alocados vários gêneros e entre eles, o Toxoplasma, no qual se tem uma única espécie: o T. gondii (SERCONDES, 2010). Família Sarcocystidae (Poche,1913) Subfamília Toxoplasmatinae (Biocca de 1957) Gênero Besnoitia (Henry, 1913) Gênero Hammondia (Frenkel, 1974) Género Neospora (Dubey et al., 1988) Gênero Toxoplasma (Nicolle & Manceaux, 1909) Toxoplasma gondii (Nicolle & Manceaux, 1909)

7 3 O T. gondii foi descrito pela primeira vez em roedores, em 1908, na Tunísia, África. Seu nome derivou-se da sua morfologia: toxo = arco, plasma = forma, e do seu hospedeiro: gondii, por ter sido descoberto em um roedor da região do Gundi. Também em 1908, foi encontrado o mesmo parasita em São Paulo, Brasil (DUBEY, 2008). A primeira descrição desse protozoário em humanos ocorreu somente em No Brasil, em 1927, foi relatado um caso humano no Rio de Janeiro (DUBEY et al., 2012). Em 1942, a toxoplasmose foi detectada em gatos e, em 1967, foi demonstrado que o protozoário em questão pode ser contraído pela ingestão de oocistos eliminados nas fezes dos felinos. A descoberta dos felinos, como hospedeiros definitivos, em 1970, levou à elucidação do ciclo biológico completo do T. gondii (DUBEY, 2008). Complexo apical FIGURA 1 - Morfologia geral da forma taquizoíta do Toxoplasma gondii, protozoário do Filo Apicomplexa, o qual possui as estruturas características do complexo apical, como róptrias, micronemas, anéis polares. Adaptado de

8 4 Segundo DUBEY (2008), em seu ciclo de vida o T. gondii, desenvolve organelas características do Filo Apicomplexa, apresentando o complexo apical e as organelas mencionadas anteriormente, porém é o único que apresenta o conóide, como demonstrado na Figura 1. Tal protozoário possui três fases distintas: taquizoítos, bradizoítos (cistos tissulares) e esporozoítos (oocistos). Ainda, possui ciclo de vida heteroxeno (Figura 2), sendo que todos os animais de sangue quente (mamíferos e aves) podem participar do ciclo como hospedeiros intermediários e os felinos são seus hospedeiros definitivos (TENTER et al., 2000). FIGURA 2 - Ciclo biológico do Toxoplasma gondii e suas três fases de vida: taquizoítos, bradizoítos (cistos tissulares) e esporozoítos (oocistos), com os diferentes tipos de hospedeiros intermediários (mamíferos e aves) e o hospedeiro definitivo, felino. Fonte: Todas as fases de desenvolvimento são infecciosas para ambos hospedeiros e estes podem adquirir a toxoplasmose por diferentes vias, como a horizontal, por ingestão oral de oocistos esporulados no ambiente (Figura 2) e por ingestão de cistos tissulares na carne crua ou mal cozida (Figura 2); ou verticalmente, pela transmissão transplacentária de taquizoítos (Figura 2).

9 5 Estes também podem ser transmitidos pelo leite, da mãe para o filho, ou por transplante de sangue ou órgãos (TENTER et al., 2000). Os gatos podem eliminar oocistos no ambiente (Figura 2) após a ingestão de qualquer um dos estágios de desenvolvimento do T. gondii, mas, somente 30% dos felinos eliminam essa fase no ambiente após ingerir taquizoítos ou oocistos, enquanto, praticamente todos os gatos que ingerem bradizoítos eliminam-nos (DUBEY et al., 1998). O contato com o protozoário promove a formação de anticorpos contra o parasita em questão, sendo que TENTER et al. (2000) verificaram que 74% da população de gatos adultos, dependendo do tipo de alimentação e acesso à rua ou não, apresentam anticorpos contra o T. gondii. Como o homem pode participar do ciclo, sendo um hospedeiro, a toxoplasmose é considerada uma zoonose, a qual se destaca na medicina veterinária e humana, pois pode causar aborto ou doença congênita em seus hospedeiros intermediários (TENTER et al., 2000). Tal enfermidade apresenta distribuição cosmopolita e estima-se que um terço, ou mais, da população mundial esteja cronicamente infectada, apresentando anticorpos para o parasita (MONTOYA & LIESENFELD, 2004), chegando a índices de soropositividade variando de 23 a 83%, dependendo de fatores climáticos, socioeconômicos e culturais (FIALHO et al., 2009). No Brasil, a infecção pelo T. gondii está amplamente prevalente em humanos, sendo que 50% das crianças e 80% das mulheres em idade fértil têm anticorpos para esse protozoário (DUBEY et al., 2012). Infecções primárias em adultos são geralmente assintomáticas, mas linfadenopatia ou toxoplasmose ocular podem ocorrer em alguns pacientes (SU et al., 2010). Já para os imunossuprimidos a toxoplasmose apresenta-se de forma aguda, podendo em alguns casos levar a encefalite fatal, ou neurotoxoplasmose, e provocar lesões necróticas no cérebro (MONTOYA & LIESENFELD, 2004), como demonstrado na Figura 3.

10 6 FIGURA 3 - Corte de cérebro de paciente com neurotoxoplasmose, mostrando duas lesões necróticas extensas (setas). Fonte: Quando ocorre a transmissão vertical, a enfermidade é conhecida como toxoplasmose congênita (SU et al., 2010). Porém, se a infecção materna for adquirida antes da gestação, aquela representa pouco ou nenhum risco para o feto. Mas quando mulheres, já gestantes, são infectas pela primeira vez pelo T. gondii, a chance do filho desenvolver a toxoplasmose congênita clínica é aumentada. Já a infecção subclínica dessa enfermidade, em recém-nascidos, pode passar despercebida ou o bebê desenvolverá a hidrocefalia ou microcefalia (MONTOYA & LIESENFELD, 2004), como demonstrado na Figura4. Da mesma forma que ocorre nos homens, a infecção pelo T. gondii está amplamente difundida em animais em todo o mundo. Inquéritos epidemiológicos relevam que 90% dos animais domésticos e silvestres possuem anticorpos para aquele protozoário. Desta forma, ressalta-se a importância da toxoplasmose, pois animais de produção, como suínos, ovinos e caprinos podem apresentar sorologia positiva para o T. gondii (DUBEY et al., 2012). No Brasil, a maioria dos suínos apresenta-se sorologicamente positiva para o protozoário em questão, e de forma semelhante, este está largamente distribuído entre ovinos, destacando-se ainda que as aves possam

11 7 apresentar-se positivas diante de um exame sorológico para a toxoplasmose (DUBEY et al., 2012). Tais condições representam riscos à saúde pública, pois uma das formas de infecção mais recorrente é a horizontal, pela ingestão de bradizoítos viáveis presentes nas vísceras dos animais infectados (DUBEY et al., 2007b). A FIGURA 4 - Recém-nascidos com as formas clínicas da toxoplasmose congênita. A. Hidrocefalia; B. Microcefalia. Fonte: hassan344.tripod.com/protozoa/tox-gondii.html e asorridente.blogspot.com.br/2011/05/toxoplasmose.html B Diante disto, o diagnóstico laboratorial da toxoplasmose representa elevada importância para vigilância epidemiológica e saúde pública. Para diagnosticá-la, inicialmente é utilizada a sorologia, que busca demonstrar níveis de anticorpos específicos ao T. gondii, sendo que, os títulos mantêm-se elevados durante meses até anos (MONTOYA, 2002). Porém, os testes sorológicos disponíveis, indicam somente o contato do hospedeiro com o protozoário em algum momento no passado e não a presença de protozoário viável à infecção. Deste modo, são associados ao exame sorológico outros métodos de diagnóstico (DUBEY, 2010). Dentre esses, inclui-se a biopsia ou autópsia, que permite a constatação de taquizoítos, indicando infecção ativa; ou achados de cistos teciduais, os quais são as formas encontradas na infecção latente (Figura 5). Porém, é pequena a chance de encontrar o protozoário, pois este pode parasitar qualquer célula nucleada e os organismos encontrados nas lesões, na maioria das vezes, estão em estado de degeneração, o que dificulta sua detecção (DUBEY, 2010).

12 8 FIGURA 5 - Cisto tecidual de Toxoplasma gondii identificado no material cerebral de camundongo, inoculado com material cerebral de ovino. Ampliação de 400x. Fonte: SILVA, Ainda, para diagnosticar a toxoplasmose pode ser associado, aos exames sorológicos, o diagnóstico molecular, o qual busca detectar o DNA do T. gondii, em amostras biológicas. Como exemplo, pode ser associada à sorologia, a técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) (CARNEIRO, 2011), pois pode identificar o DNA de agentes parasitários em tecidos e secreções de animais, o que promove a obtenção de informações não fornecidas pelos testes imunológicos ou morfológicos (SINGH, 1997). Contudo, como limitação da técnica molecular, a positividade não determina se o DNA amplificado é de parasitas viáveis ou de fragmentos do parasita. Devido a isso, o bioensaio em animais susceptíveis é utilizado para indicar a viabilidade do parasita nos tecidos animais (SILVEIRA, 2009).

13 2.2 Métodos de diagnóstico e caracterização molecular 9 O diagnóstico molecular é baseado na detecção, identificação e quantificação de ácidos nucleicos, auxiliando no diagnóstico e no prognóstico de enfermidades (BARRA et al., 2011). Ainda, possui a capacidade de diferenciar agentes parasitários taxonomicamente muito próximos (THOMPSON et al., 1998), o que facilita estudos das populações de parasitas, bem como a identificação de possíveis relações entre um determinado genótipo e sua virulência (YERA et al., 2003). Os métodos caracterizados como moleculares dependem da reação em cadeia da polimerase (PCR) para a detecção específica ou a análise de DNA do T. gondii (SU et al., 2010). Tais métodos podem ser divididos em dois grupos: no primeiro grupo estão as técnicas capazes de detectar especificamente o DNA em amostras biológicas, como a PCR convencional (cn-pcr) e a nested-pcr (n-pcr). Já no segundo, tem-se o teste de polimorfismo de comprimento de fragmentos de DNA gerados por enzimas de restrição sobre produtos amplificados pela PCR (PCR-RFLP), o qual é capaz de identificar os fragmentos do DNA do T. gondii, realizando assim, a caracterização genotípica do protozoário (SU et al., 2010) Reação em cadeia da polimerase Para conseguir uma boa sensibilidade na detecção do DNA do parasita, o resultado depende do método utilizado, como também, da técnica realizada para extração do DNA (SILVA et al., 1999). Tradicionalmente, no laboratório clínico, os ácidos nucleicos são extraídos de amostras como sangue total, soro, líquido amniótico e restos placentários (BARRA et al., 2011). Para realizar a extração do DNA, na maioria das vezes são utilizados kits comerciais, os quais facilitam o manuseio das amostras. Ainda, possibilitam a remoção de possíveis inibidores de PCR, como por exemplo, o grupo heme do sangue e a heparina, que é frequentemente utilizada na coleta

14 10 sanguínea. No caso de amostras fecais, os kits devem extrair o DNA do parasita a partir dos oocistos, evitar adsorção do material obtido pelos constituintes das fezes e remover os inibidores da PCR (SILVA et al., 1999). Após a extração do DNA, é iniciada a cn-pcr e para a realização desta, são necessários três segmentos de ácidos nucléicos: a dupla fita de DNA, a qual servirá de molde para amplificação e dois oligonucleotídeos específicos, também conhecidos como primers ou iniciadores. Além destes, são necessários: DNA polimerase, dntps (trifosfatos desoxinucleótidos), tampão e sais de cloreto de magnésio (LIMA, 2008). A DNA polimerase necessita do magnésio para realizar sua atividade e este geralmente é fornecido sob a forma de cloreto de magnésio. Os dntps são de quatro tipos de nucleotídeos, os quais são utilizados pela polimerase para estender o iniciador anelado e o tampão garante adequado ambiente à ação da polimerase (STEPHENSON & ABILOCK, 2012). Já os primers são pequenas sequências de nucleotídeos que se anelam no início da sequência alvo, sendo então complementares à fita de DNA (LIMA, 2008). Assim, o método padrão requer um modelo de DNA, que contenha a região a ser amplificada pelos dois primers e para realizar a amplificação é utilizada a Taq DNA polimerase. Ao reconhecer os iniciadores, a polimerase sintetiza uma cópia complementar, obedecendo à informação contida na sequência de DNA que será replicada (LIMA, 2008). Com a ação da Taq DNA polimerase, ocorre a síntese da nova fita complementar e as regiões específicas do DNA de interesse, são amplificadas enzimaticamente, em sucessivos ciclos (MONIS & ANDREWS, 1998). Cada ciclo da PCR é repetido por cerca de 30 vezes e deve ser realizado em três etapas (Figura 6): desnaturação, anelamento e extensão. Cada uma das três etapas é realizada em temperaturas diferentes, sendo que geralmente na desnaturação a etapa ocorre a 94ºC (Figura 6 A), já no segundo passo, ou anelamento, a temperatura pode variar de acordo com o tamanho e constituição dos primers, podendo variar de 30 a 60ºC (Figura 6 B) e a extensão ocorre a 72ºC (Figura 6 C), sendo que essas diferenças na temperatura são conseguidas com uso do termociclador (LIMA, 2008).

15 11 A 1º Passo Desnaturação: separação da dupla fita de DNA pelo calor (94 C/1min). B 2º Passo Anelamento: Anelamento dos primers em posições específicas (30-60ºC/1min). C 3º Passo Extensão: Extensão da sequência a ser amplificada pela ação da DNA polimerase (72ºC/2min). FIGURA 6 - Esquema demonstrativo das três etapas da PCR convencional: A. No primeiro passo, ocorre a desnaturação, então a dupla fita de DNA separa-se, a uma temperatura de 94ºC por um minuto, dando origem a duas fitas simples de DNA. B. A uma temperatura de 30 a 60ºC por cerca de um minuto, ocorre o segundo passo e tem-se o anelamento dos primers em cada uma das fitas simples, em posições específicas. C. O terceiro passo ou extensão dá-se pela ação da DNA polimerase, a uma temperatura de 72ºC por dois minutos, a qual realiza o processo de extensão da sequência a ser amplificada. Adaptado de Durante cada ciclo, as fitas complementares de DNA são copiadas pela extensão dos primers que se anelam em posições opostas. Desta forma, cada fita recém-amplificada é usada como molde no ciclo seguinte, resultando no acúmulo exponencial do fragmento de DNA flanqueado pelos dois iniciadores (LIMA, 2008). Então, cada ciclo da PCR duplica a quantidade de DNA específico, resultando numa amplificação de um milhão de vezes da sequência alvo (SINGH, 1997). Uma vez que o produto da PCR é produzido após a amplificação, esse pode ser detectado utilizando a eletroforese em gel de agarose (SINGH,

16 ). A agarose utilizada no gel é um polissacarídeo que forma uma rede e permite regular a velocidade da migração das moléculas durante a separação. Esta técnica faz uso da diferença de potencial elétrico, sendo que as moléculas de menor massa migram mais rapidamente (LIMA, 2008). Após a separação dos produtos, ocorre a adição de corante fluorescente (brometo de etídio) que se intercala entre as bases do DNA e o uso de radiação ultravioleta permite a visualização dos produtos gerados (LIMA, 2008), como demonstrado na Figura 7. FIGURA 7 Amplificação da sequência de 529 pb (pares de base) e detecção pela PCR do DNA de Toxoplasma gondii em água contaminada experimentalmente. Legenda: 1) 10 6 taquizoítos/ ml de água; 2) 10 5 taquizoítos/ ml de água; 3) 10 4 taquizoítos/ml de água; 4) 10 3 taquizoítos/ml de água; 5) 10 2 taquizoítos/ml de água; 6) 10 1 taquizoítos/ ml de água; 7) 10 0 taquizoítos /ml de água; 8) água ultrapura (controle negativo da extração); 9) controle positivo; 10) água ultrapura (controle negativo da extração); 11) água ultrapura (controle negativo da PCR); (PM) padrão de peso molecular 100 pb. Fonte: SILVA (2009).

17 13 De acordo com ALMEIDA (2004, vem ocorrendo o desenvolvimento de técnicas baseadas no princípio da cn-pcr e uma delas é a conhecida n- PCR, esta é um método sensível, no qual o produto amplificado é submetido a um segundo processo de amplificação, para isso, são utilizados um conjunto de iniciadores homólogos às sequências internas do segmento já amplificado. Este procedimento torna a reação da polimerase mais específica e sensível. Geralmente, na primeira PCR é utilizado um iniciador gênero-específico e, na segunda, um iniciador espécie-específico do parasita em estudo Teste de polimorfismo de comprimento de fragmentos de DNA gerados por enzimas de restrição sobre produtos amplificados pela reação em cadeia da polimerase Como mencionado anteriormente, a PCR é realizada para a amplificação de uma região de um gene de interesse que contém uma ou múltiplas substituições de bases. Quando o produto de tal técnica é submetido à digestão por uma ou mais enzimas de restrição, ocorre então o PCR-RFLP, este é um método que detecta variações na região do fragmento alvo que foi amplificado, sendo que uma única substituição de bases pode originar ou extinguir um sítio capaz de ser digerido pela enzima de restrição de endonuclease (ALMEIDA, 2004). Para isso, tal método busca os marcadores moleculares e baseia-se na capacidade de que as endonucleases de restrição reconhecem o polimorfismo do nucleotídeo único dos produtos obtidos pela PCR e posteriormente, exibe as regiões distintas do fragmento em padrão de bandas pelo método de eletroforese em gel de agarose (SU et al., 2010).

18 2.3 Diagnóstico e caracterização molecular do Toxoplasma gondii Diagnóstico molecular O T. gondii, eucarioto intracelular obrigatório, foi detectado por meio de técnicas moleculares em vários tecidos vivos e células nucleadas além de ter sido encontrado em líquidos orgânicos como sangue, linfa, saliva, leite (colostro), exsudatos, esperma e líquido peritoneal, sendo ainda capaz de se dividir e multiplicar-se em cultura de células de peixes (SILVEIRA, 2009). Desta forma, os métodos de diagnósticos moleculares promovem a detecção do parasito, pois possuem alta sensibilidade e especificidade, proporcionando a identificação do DNA do protozoário em diferentes amostras, como fezes e fluidos corpóreos (GONÇALVES, 2010). Para alcançar elevada sensibilidade pela PCR, deve-se ter conhecimento prévio da sequência alvo do DNA que se deseja detectar. A partir disto, dois primers já desenhados são utilizados para amplificar a sequência desejada (SU et al., 2010). Cada par de iniciador é específico para um dos marcadores genéticos existentes para o T. gondii, os quais são frequentemente pesquisados nas amostras biológicas (SU et al., 2010), exemplo: o gene B1, inicialmente descrito por BURG et al. (1989); o fragmento de 529 pb (HOMAN et al., 2000), o espaçado interno transcrito (ITS -1) (SLAPETA et al.,2002), entre outros. O gene B1 é um marcador genético com peso molecular de 2,2 Kb (kilobase) (CARNEIRO, 2011), tal marcador é um dos mais utilizados, pois está repetido em 35 cópias no genoma do T. gondii, ainda demonstra alta sensibilidade, sendo capaz de detectar até um parasita em cerca de 100 mil células hospedeiras. Para a detecção do gene B1 são utilizados os pares de primers: 5'-GGA ACT GCA TCC GTT CAT GAG-3' e 5'-TCT TTA AAG CGT TCG TGG TC-3' (BURG et al., 1989). SPALDING et al. (2002) por meio da cn-pcr utilizou os dois pares de primers referidos anteriormente, direcionados ao gene B1 do T. gondii e

19 15 avaliou amostras sanguíneas e placentárias coletadas de mulheres no momento do parto e a reação foi sensível e específica; evidenciando a presença de um a dez taquizoítos, no material amostrado. O marcador genético de 529 pb repete-se 300 vezes no genoma do parasita em questão, assim, apresenta elevada sensibilidade para a detecção de tal protozoário e para a amplificação deste marcador podem ser utilizados os pares de primers: 5 -CGC TGC AGG GAG GAA GAC GAA AGT TG- 3 e 5 - CGC TGC AGA CAC AGT GCA TCT GGA TT-3 (HOMAN et al., 2000). Assim, SILVA (2009) pesquisou a presença de DNA de T. gondii em amostras de vísceras (cérebro, pulmão e músculo) de ovinos sorologicamente positivos para toxoplasmose. Para isso, utilizou a cn-pcr direcionada ao fragmento de 529 pb e obteve que 100% dos animais positivos na PCR convencional também foram positivos na sorologia, como demonstrado na Tabela 1, o que denota a adequação da técnica molecular utilizada para o diagnóstico do T. gondii. TABELA 1 - Frequência de animais positivos à sorologia em relação a PCR de amostras viscerais de ovinos. PCR Sorologia Negativo (%) Positivo (%) Total (%) Negativo 20 (30,8) 45 (69,2) 65 (75,6) Positivo 0 (0,00) 21 (100) 21 (24,4) Total 20 (23,3) 66 (76,7) 86 (100) Fonte: SILVA, Já o ITS-1 é uma sequência-alvo bastante utilizada como marcador molecular em estudos envolvendo protozoários toxoplasmatíneos, pois trata-se de uma região menos conservada e que possui diferenças marcantes entre as espécies dessa subfamília (SLAPETA et al.,2002). Portanto, aquele tem ampla utilização para diagnóstico molecular em estudos filogenéticos (GONÇALVES, 2010). Para a amplificação desta porção do gene podem ser utilizados os

20 16 primers: 5 CGA AAT GGG AAG TTT TGT GAA C3 e 5 -CAG CAG CTA CAT ACG TAG A-3 (SLAPETA et al.,2002). GONÇALVES (2010), a fim de detectar parasitas da subfamília Toxoplasmatinea, presentes em amostras viscerais de galinhas, utilizou dois pares de primers, para amplificar a porção ITS-1, por meio da n-pcr e foi observado que 42% das amostras apresentaram resultado com bandas com cerca de 400pb, equivalentes ao DNA desta subfamília. O autor realizou ainda a cn-pcr para o T. gondii, sendo que para o primeiro foi amplificado o gene B1 e obteve que 66% de amostras positivas na n-pcr também foram positivas para a cn-pcr direcionada ao T. gondii, o que demonstra que as aves apresentam-se como hospedeiros intermediários eficientes deste protozoário. Em geral, a PCR é muito sensível, pois pode detectar o DNA de apenas um taquizoíto, proporcionando um diagnóstico rápido, e o uso de tal método é adequado para espécimes clínicos, porém amostras fecais apresentam inibidores, os quais podem diminuir a sensibilidade da PCR. No entanto, do ponto de vista da saúde pública, é necessário distinguir os oocistos de T. gondii dos oocistos de outros protozoários, como Isospora felis. I. rivolta, Sarcocystis muris (Figura 8), os quais também podem estar presentes nas fezes do gato, porém aqueles não parasitam o homem (DUBEY, 2010). Diante disto, foi desenvolvida uma técnica baseada na cn-pcr, conhecida como copro-cpr na qual procedesse a concentração dos oocistos e o rompimento da parede desses, antes da extração do DNA. Tal técnica foi direcionada à sequência de 529 pb e permitiu a detecção de DNA de T. gondii, a partir de amostras fecais de gatos (SALANT et al., 2010).

21 17 FIGURA 8 - Oocistos não esporulados de Isospora felis (A), Isospora rivolta (B), e Toxoplasma gondii (C), em comparação com esporocisto esporulado de Sarcocystis muris (D). Ampliação de 1600 x. Fonte: DUBEY, Caracterização molecular Apesar de sua grande distribuição mundial, ampla gama de hospedeiros e da presença de uma fase sexual no seu ciclo biológico, o T. gondii apresenta uma baixa variação genética. A estrutura populacional deste protozoário foi definida com auxílio de um sistema de tipificação baseado na técnica de PCR-RFLP, a qual foi capaz de revelar uma estrutura populacional clonal do gênero Toxoplasma. Esta clonalidade manifesta- se pelo isolamento repetitivo do mesmo genótipo em amostras não relacionadas (YAI, 2007). As amostras atualmente conhecidas de T. gondii possuem similaridades antigênicas, morfológicas e semelhanças na capacidade de infectar vários hospedeiros. Porém, apesar do gênero em questão ser considerado monoespecífico (SILVEIRA, 2009), tem sido realizada a caracterização genotípica de diferentes isolados deste protozoário por meio de métodos moleculares (YAI, 2007).

22 18 Para a realização da genotipagem dos isolados de T. gondii pode ser utilizada a PCR-RFLP, a qual é direcionada a vários marcadores moleculares, como por exemplo: SAG1, SAG2, SAG3. O que proporciona a detecção do polimorfismo genético e possibilita a caracterização genotípica em diferentes isolados, originados de material humano e animal, demonstrando a existência de diversidade genética no gênero, ao qual pertence tal protozoário (CARNEIRO, 2011). Assim, com a utilização da técnica mencionada foi possível descrever a subpopulação do T. gondii em várias regiões geográficas do mundo. Desta forma, a maioria dos isolados deste protozoário, de humanos e animais, na América do Norte, Europa e África foram agrupadas em uma da três linhagens clonais conhecidas: tipo I, II e III (SU et al., 2010). Em humanos, a linhagem clonal de T. gondii classificada como tipo I é normalmente associada a casos de toxoplasmose aguda, podendo provocar lesões oculares (VALLOCHI et al., 2005). Já o genótipo tipo II é predominante encontrado em pacientes imunossuprimidos e em casos de toxoplasmose congênita e a do tipo III é comumente encontrada em animais (CARNEIRO, 2011). Assim, de acordo com DUBEY et al. (2004), por meio da PCR-RFLP e a partir de amostras viscerais de gatos sorologicamente positivos para o T. gondii, da região do Paraná, Brasil, foram isoladas somente as linhagens tipo I e tipo III. Outro estudo, com isolados de vísceras de cães, também positivos para toxoplasmose, provenientes do estado de São Paulo, confirmou somente a presença da linhagem tipo III (DUBEY et al., 2007a). Já DUBEY et al. (2007b), demonstraram a partir de amostras viscerais de galinhas caipiras, sorologicamente positivas para toxoplasmose e provenientes da região do Pará e Rio grande do Sul, que os genótipos isolados eram diferentes dos já descritos anteriormente, porém intimamente relacionados com as linhagens clonais tipos I ou III. PENA et al. (2008) avaliaram os resultados obtidos por DUBEY et al. (2004), DUBEY et al. (2007a), DUBEY et al. (2007b) e diante da alta diversidade genética dos isolados, determinaram, por meio da PCR-RFLP,

23 19 utilizando os marcadores moleculares: SAG1, SAG2, SAG3, BTUB, GRA6, C22-8, C29-2, L358, PK1 e Apico, que as linhagens encontrados no Brasil são de quatro tipos (BrI, BrII, BrIII e BrIV) (Figura 9). Assim determinaram que o T. gondii tem uma estrutura populacional epidêmica no Brasil e as principais linhagens têm diferenças entre as anteriormente mencionadas. Outro estudo realizado com isolados de galinhas, da Região do Espírito Santo, demonstrou que o tipo BrI é o genótipo encontrado com mais frequência nesse estado (Figura 9) e nenhum dos tipos I, II ou II foram encontrados (PENA et al., 2013). Isolados do tipo BrI, em frangos Isolados do tipo II, em ovinos Espírito Santo Isolados do tipo BrI, BrII e BrIII em cães e gatos Isolados do tipo BrIII e BrIV, em frangos FIGURA 9 - Mapa do Brasil demonstrando a distribuição dos isolados do Toxoplasma gondii: Pará, linhagem BrI, em frangos; Espírito Santo, tipo BrI em frangos; São Paulo, BrI, BrII e BrIII em cães e gatos e tipo II, em ovinos; Paraná, tipos BrI, BrII e BrIII, em cães e gatos; Rio Grande do Sul, tipos BrIII e BrIV, em frangos. Adaptado de PENA et al., 2008.

24 20 Porém, SILVA et al. (2011) pesquisaram a taxa de infecção por T. gondii em ovinos de frigoríficos do estado de São Paulo e os que foram positivos sorologicamente para toxoplasmose, tiveram suas amostras viscerais avaliadas pela cn-pcr e PCR-RFLP, sendo que para esta utilizaram 11 marcadores: SAG1, SAG2, SAG3, BTUB, GRA6, C22-8, C29-2, L358, PK1, Apico e CS3. A partir disto, os pesquisadores demonstraram que o genótipo tipo II, anteriormente não encontrado no Brasil, estava presente nas amostras viscerais de ovinos provenientes do estado de São Paulo. Tais resultados confirmaram a elevada diversidade de genótipos do protozoário em questão no território brasileiro (SILVA et al., 2011). A infecção pelo T. gondii, bem como o desenvolvimento da toxoplasmose, tem sido detectada com maior sensibilidade através dos métodos moleculares. Contudo, como limitação da técnica, a positividade não discrimina se o DNA amplificado provém de parasitas viáveis ou de fragmentos do parasita. Devido a isso, o isolamento em animais susceptíveis reproduz a infecção quando há parasitas viáveis nos tecidos animais, refletindo a presença ativa dos mesmos (SILVEIRA, 2009). Dentre os animais sensíveis à inoculação, citam-se hamsters, cobaias, camundongos e coelhos. Destes, os camundongos são os melhores por serem os mais susceptíveis à infecção experimental, podendo, fornecer milhões de taquizoítos em apenas três dias depois da infecção experimental (SILVEIRA, 2009). Para o isolamento do T. gondii podem ser utilizados camundongos heterozigotos imunocompetentes, os quais são naturalmente susceptíveis à infecção pelo parasito; a via de inoculação comumente utilizada é a via intraperitoneal, que se mostra mais efetiva do que outras vias, como via oral ou intracerebral (GONÇALVES, 2010). Os camundongos são inoculados com taquizoítos ou bradizoítos, e dependendo da linhagem inoculada, se virulenta o animal pode desenvolver infecção aguda, com a formação de ascite, apresentar taquizoítos no líquido peritoneal, formar cistos teciduais e desenvolver encefalite, o que causa a

25 21 sintomatologia neurológica observada em alguns animais (GONÇALVES, 2010), ou quando a linhagem é não-virulenta a infecção pode apresentar de forma crônica, não desenvolvendo sintomas (YAI, 2007). Considerando que a patogenicidade do T. gondii está estreitamente relacionada à virulência da cepa e à espécie hospedeira (YAI, 2007), PENA et al. (2008) realizaram o isolamento e o bioensaio em camundongos das linhagens encontradas no Brasil (BrI, BrII, BrIII e BrIV) e constrataram que o isolado do tipo BrI pode ser considerado virulento, o tipo BrIII não-virulento, e os tipos BrII e BrIV são considerados virulentos intermediários. Já o tipo II, encontrado em ovinos no estado de São Paulo, não foi virulento ao bioensaio em camundongos (SILVA et al., 2011). Os resultados apresentados demonstram a diferença da distribuição e das linhagens genotípicas apresentadas no Brasil em relação às demonstradas anteriormente para a América do Norte, pois nesta são relatadas apenas a presença de três linhagens: tipo I, II e III (DUBEY et al., 2004). Diante do que foi exposto, é de extrema importância investigar a relação do genótipo e as manifestações clínicas da toxoplasmose em animais, pois estas podem ser relacionadas às linhagens patogênicas aos seres humanos (SU et al., 2006).

26 3 CONSIDERAÇÕES FINAIS 22 Os protozoários são parasitas causadores de doenças de importância médica e veterinária, destacando-se o T. gondii por ser agente causador de zoonose apresentar distribuição cosmopolita. O diagnóstico da toxoplasmose baseia-se no exame sorológico, o qual é capaz de demonstrar o contato com o parasita. Porém, quando a infecção toma a sua forma crônica, a técnica mencionada, não indica a presença de parasita viável. O que é importante, por exemplo, quando se investiga a forma de contaminação: a horizontal, pela presença de bradizoítos em vísceras, ou a forma vertical, pela detecção de taquizoítos em anexos placentários. Para obter tais resultados, as técnicas baseadas no diagnóstico molecular, especificamente a PCR, são utilizadas juntamente com os métodos sorológicos, objetivando-se a detecção do T. gondii. Assim, as técnicas moleculares são ferramentas eficientes, pois podem detectar o DNA do protozoário em diversos materiais biológicos, o que demonstra a presença do mesmo, no material analisado. Porém, somente a identificação do material genético do T. gondii, não indica a sua viabilidade, desta forma é requisitado o bioensaio, pois este é capaz de reproduzir a infecção em animais, como por exemplo, em camundongos. Tal técnica é capaz de demonstrar a presença de parasitas viáveis e assim, será definido que o T. gondii, na amostra analisada, possui potencial infeccioso. Ainda, o estudo da diversidade genética de tal protozoário, por meio da PCR-RFLP, é importante, pois pode esclarecer dúvidas quanto à distribuição epidemiológica nos hospedeiros intermediários, pois estes podem ser importantes fontes de contaminação horizontal. E juntamente com o bioensaio, as técnicas baseadas na PCR, fornecem subsídios para avaliação das características biológicas, como a virulência e patogenicidade da linhagem. Além de elucidar aspectos das distintas manifestações clínicas da doença, o que resulta em obtenção ou ampliação de conhecimentos importantes para o controle, diagnóstico e tratamento da toxoplasmose.

27 4 REFERÊNCIAS 23 1 ALMEIDA, T. T. C. Padronização e avaliação de métodos moleculares para detecção de oocistos de Cryptosporidium spp. (Apicomplexa: Cryptosporiidae) em amostras fecais: extração de DNA genômico e PCR (reação em cadeia pela polimerase) f. Tese (Doutorado em saúde pública) - Universidade de São Paulo, Faculdade de Saúde Pública, São Paulo. 2 BARRA, G. B.; CAIXETA, M. C. S. A. S. B.; COSTA, P. G. G.; SOUSA, C. F.; VELASCO, L. F. R. Diagnóstico molecular - passado, presente e futuro, Revista Brasileira de Análises Clínicas, Rio de Janeiro, v. 43, n. 3, p , BURG, J. L.; GROVER, C. M.; POULETTY, P.; BOOTHROYD, J. C. Direct and sensitive detection of a pathogenic protozoan, Toxoplasma gondii, by polymerase chain reaction. Journal of Clinical Microbiology, Washington, v. 27, n. 8, p , CARNEIRO, A. C. A. V. Caracterização molecular de isolados de Toxoplasma gondii obtidos de crianças com toxoplasmose congênita no Estado de Minas Gerais f. Tese (Doutorado em Parasitologia). Universidade Federal de Minas Gerais - Instituto de Ciências Biológicas, Belo Horizonte. 5 DUBEY, J. P. Diagnosis. In: Toxoplasmoses of animals and humans. 2º ed. Boca Raton: CRC Press, Session 1.7, p DUBEY, J. P. The history of Toxoplasma gondii - the first 100 years. Journal of Eukaryotic Microbiology, Lawrence, v. 55, n. 6, p , Dec DUBEY, J. P.; GENNARI, S. M.; SUNDAR, N. M.; VIANNA, C B.; BANDINI, L. M.; YAI, L. E O.; KWOK, O. C H.; SU, C. Diverse and atypical genotypes identified in Toxoplasma gondii from dogs in São Paulo, Brazil. The Journal of Parasitology, Lawrence, v. 93, n. 1, pp , 2007a. 8 DUBEY, J. P.; LAGO, E. G.; GENNARI, S. M., SU, C., JONES, J. L. Review Article. Toxoplasmosis in humans and animals in Brazil: high prevalence, high burden of disease, and epidemiology. Parasitology, Cambridge, v. 139, n. 11, , DUBEY, J. P.; LINDSAY, D. S.; SPEER, C. A. Structures of Toxoplasma gondii tachyzoites, bradyzoites, and sporozoites and biology and development of tissue cysts. Clinical Microbiology Reviews, Washington, v. 11, n. 2, p , 1998.

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30 26 Experimental e Aplicada às Zoonoses) - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, São Paulo. 28 SINGH, B. Molecular methods for diagnosis and epidemiological studies for parasitic infections. International Journal for Parasitology, Oxford, v. 27, n. 10, p , SLAPETA, J. R.; KOUDELA, B.; VOTYPKA, J.; MODRY, D.; HOREJS, R.; LUKES, J. Coprodiagnosis of Hammondia heydorni in dogs by PCR based amplification of ITS 1 rrna: differentiation from morphologically indistinguishable oocysts of Neospora caninum. The Veterinary Journal, London, v. 163, n.2, p , SPALDING, S. M.; AMENDOEIRA, M. R. R.; COELHO, J. M. C.; ANGEL, S. O. Otimização da reação de polimerase em cadeia para detecção de Toxoplasma gondii em sangue venoso e placenta de gestantes. Jornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratorial. Rio de Janeiro, v. 38, n. 2, p , STEPHENSON, F. H.; ABILOCK, M. C. Optimizing the Polymerase Chain Reaction. Bay Area Biotechnology Education Consortium, Hayward, CA, 2012, 33 p. 32 SU, C.; SHWAB, E. K.; ZHOU, P.; ZHU, X. Q.; DUBEY, J. P. Moving towards an integrated approach to molecular detection and identification of Toxoplasma gondii. Parasitology, London, v. 137, p. 1-11, SU, C.; ZHANG, X.; DUBEY, J. P. Genotyping of Toxoplasma gondii by multilocus PCR-RFLP markers: A high resolution and simple method for identification of parasites. International Journal for Parasitology, Oxford, v. 36, n. 7, p , TENTER, A. M.; BARTA, J. R.; BEVERIDGE, I.; DUSZYNSKI, D. W.; MEHLHORN, H.; MORRISON, D. A.; THOMPSON, R. C. A.; CONRAD, P. A. The conceptual basis for a new classification of the coccidian. International Journal for Parasitology, Oxford, v. 32, n. 5, p , TENTER, A. M.; HECKEROTH, A. R.; WEISS, L.M. Toxoplasma gondii: from animals to humans. International Journal for Parasitology, Oxford, v. 30, n , p , THEKISOE O. M. M.; INOUE, N. Molecular diagnosis of protozoan infections by loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A diagnostic manual. [online] Research Unit for Advanced Preventive medicine, National Research Center for Protozoan Diseases, Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine. Disponível em:

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