UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

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1 UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS JOÃO PAULO SILVA PINHEIRO UTILIZAÇÃO DE DIFERENTES DILUIDORES E EQUIPAMENTOS NA CRIOPRESERVAÇÃO DO SÊMEN DE CURIMATÃ (Prochilodus brevis) FORTALEZA 2014

2 1 JOÃO PAULO SILVA PINHEIRO UTILIZAÇÃO DE DIFERENTES DILUIDORES E EQUIPAMENTOS NA CRIOPRESERVAÇÃO DO SÊMEN DE CURIMATÃ (Prochilodus brevis) Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Veterinárias. Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal. Linha de Pesquisa: Reprodução e sanidade de carnívoros, onívoros, herbívoros e aves. Orientadora: Profa. Dra. Carminda Sandra Brito Salmito Vanderley. FORTALEZA 2014

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5 4 Aos meus pais, Francisco Borges e Suzete Maria; Ao meu irmão, Adson Rodrigo; À minha tia, Francisca Castro, Com gratidão e amor, dedico.

6 5 AGRADECIMENTOS A Deus, por ter me concedido o dom da vida, além de que tenho a certeza que com Ele posso vencer os obstáculos, continuar a jornada e concretizar todos os meus sonhos. À Universidade Estadual do Ceará, pelo suporte desde a graduação e durante todo o mestrado, e por ter me proporcionado momentos de enriquecimento científico e social ao lado de pessoas maravilhosas. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CAPES, por ter concedido a bolsa de mestrado. À Financiadora de Estudos e Projetos FINEP, pelo apoio financeiro fornecido ao LBRP, sendo assim possível a realização de todo o experimento. À minha orientadora Profa. Dra. Carminda Sandra Brito Salmito Vanderley, por ter me orientado desde a graduação, pelos seus conselhos, orientações, incentivos e paciência. Ao prof. Dr. José Ferreira Nunes, por ter me aceito inicialmente no mestrado como orientador e por contribuir na banca de defesa dessa dissertação. Aos professores: Dra. Renata Guimarães Moreira e Dr. Rodrigo Magionni por terem aceito prontamente a participar e a contribuir com seus conhecimentos na defesa dessa dissertação. À Professora Dra. Lúcia Daniel Machado da Silva por ter aceito participar como suplente da banca de defesa dessa dissertação. Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias - PPGCV por todo apoio, incentivo, experiências e conhecimentos fornecido durante o mestrado. Aos funcionários, em especial a Adriana Maria S. Albuquerque, pela paciência e ajuda em tornar as coisas mais simples de todo o funcionamento do programa. À Profa. Dra. Ana Gláudia Vasconcelos Catunda, pela realização e explicação da estatística da parte experimental. Aos colegas de pós-graduação do Laboratório de Biotecnologia da Reprodução de Peixes LBRP: Liliane Veras Leite, Júlia Trugílio Lopes, Mayara Setúbal Oliveira, Larissa Teixeira Nunes, Jordana Sampaio Leite, Francisco Renan Aragão Linhares por terem me ajudado durante o período de realização do experimento e de construção do conhecimento desde a iniciação científica e pelo companheirismo no dia a dia. Em especial, a minha mãe científica Mônica Aline Parente Melo Maciel, que sempre me ajudou nas pesquisas e na experimentação, fornecendo dicas, críticas e elogios.

7 6 Aos ex e atuais ICs do LBRP, Thais Maia Torres, Yasmim Maia Ferreira, Priscila Silva de Almeida, Rômulo Roberto Ribeiro Pinheiro, Maria Eduarda Magalhães de Souza, Renata Vieira do Nascimento pelo companheirismo e por terem tornado os trabalhos menos laboriosos. Aos colegas da turma de mestrado, pela troca de experiências e conhecimentos. Aos membros e funcionários do Núcleo Integrado de Biotecnologia, pelo companheirismo e apoio, em especial, a Dona Maria Iraci Clemente de Melo, pelo carinho fornecido durante todos esses anos. A minha amiga Henna Roberta Quinto, pelo seu grande incentivo desde a graduação (me mandando estudar para o mestrado), pela sua amizade e carinho em todos os momentos, compartilhando alegrias e tristezas, dúvidas e anseios. A minha grande amiga Lívia Maria Galdino Pereira, pela sua dedicação em tornar os meus dias menos complicados, pelo carinho, atenção, companheirismo e ajuda no meu crescimento como pessoa e como pesquisador. Aos meus amigos desde a graduação, Edlâny Pinho Romão, Camila Miranda Barbosa e Diego Sales Lucas, pela amizade e diversas alegrias compartilhadas. Aos meus pais: Francisco Borges Pinheiro e Suzete Maria da Silva Pinheiro, que sempre me deram educação, amor, carinho, companheirismo, me encorajaram para trilhar os caminhos da vida, enfim, são a base de toda a minha trajetória. Ao meu irmão Adson Rodrigo Silva Pinheiro, pelo seu ombro amigo, pelo apoio nas horas difíceis e por sempre me escutar e compartilhar comigo diversas experiências de vida. Ao meu irmão Edyhelver Silva Pinheiro por ter compartilhado alguns momentos dessa jornada, a minha tia Francisca Castro da Silva (Zulena), pelo seu apoio, amor e incentivo e aos demais familiares que sempre me ajudaram de alguma forma desde meu nascimento. Enfim, quero agradecer a todos que contribuíram de forma direta ou indireta para a conclusão de mais uma etapa da minha vida.

8 7 RESUMO Curimatã comum (Prochilodus brevis) é um peixe reofílico encontrado em alguns estados (Ceará, Piauí e Rio Grande do Norte) da região Nordeste do Brasil. No entanto, a pesca predatória e o impedimento, pelas barragens nos rios, da migração dessa espécie para a reprodução põe em risco a sobrevivência do P. brevis. Com isso, surge nos pesquisadores o interesse sobre a criopreservação do sêmen dessa espécie, tanto para a produção em aquicultura como para preservação de material genético em programas de conservação. O presente trabalho teve por objetivo avaliar a eficiência de diferentes diluidores e equipamentos de congelação na criopreservação do sêmen de curimatã (P. brevis). Os machos (n=12) pertencentes ao plantel do Laboratório de Biotecnologia da Reprodução de Peixes foram induzidos hormonalmente com extrato hipofisário de carpa comum (3 mg kg -1 ) para a espermiação. Após 18h da indução, os animais foram sedados individualmente e realizada a coleta de sêmen, mensuração do comprimento e a pesagem dos mesmos. Depois da coleta seminal, realizou-se a análise objetiva da motilidade do sêmen com auxílio do Sperm Class Analyzer; foram também mensurados ph, volume, osmolaridade, fixadas alíquotas para morfologia e para concentração espermática, e em seguida, iniciado o processo de criopreservação. As amostras seminais (n=8) de cada animal foram diluídas em quatro diferentes tratamentos (glicose+dimetilsulfóxido-dmso, glicose+metil glicol-mg, Beltsville Thawing Solution- BTS+DMSO e BTS+MG), envasadas em palhetas de 0,25 ml e submetidas a dois diferentes equipamentos de congelação: máquina de congelação programada e dry shipper. Após 10 dias, as amostras seminais foram descongeladas (25 ºC / 30s) e avaliadas quanto à cinética e à morfologia espermáticas com auxílio do software Sperm Class Analyzer. Os parâmetros físico-químicos (ph: 8,21 ± 0,27; osmolaridade: 250,29 ± 25,84 mosm; concentração: 15,12 ± 2,77 x10 9 sptz ml -1 ) do sêmen in natura foram similares aos observados em outros estudos de Characiformes, portanto permitindo a criopreservação do sêmen. A glicose, quando usada como diluente em associação com o crioprotetor MG (glicose+mg), conferiu elevado percentual de espermatozoides móveis após congelação no equipamento dry shipper (76,88 ± 4,84%; P>0,05; Coeficiente de Variação C.V.: 17,8) e em máquina de congelação programada (70,95 ± 1,76%; P>0,05; C.V.: 7,01) sendo superior (P<0,05) aos demais tratamentos (glicose+dmso: 23,64 ± 2,26% e 18,10 ± 2,87%; BTS+DMSO: 41,12 ± 3,14% e 37,58 ± 2,62; BTS+MG: 37,38 ± 5,06% e 50,86 ± 3,36%). Além disso, o tratamento glicose+mg conferiu velocidades espermáticas (VCL:79,52 ± 2,88 µm s -1 ; VSL:45,46 ± 3,01 µm s -1 ; VAP:67,92 ± 3,08 µm s -1 ; P<0,05) superiores aos demais tratamentos estudados, e uma maior quantidade de espermatozoides normais (74,56 ± 0,77%; P<0,05) foi observado quando o sêmen foi criopreservado utilizando a máquina de congelação programada. A anormalidade

9 8 espermática mais encontrada foi a de cauda dobrada. Dessa forma, é recomendável a utilização de glicose+mg, em combinação com o dry shipper ou com a máquina de congelação programada para a criopreservação do sêmen de P. brevis. A utilização de uma máquina de congelação programada é mais recomendada, porque os resultados obtidos são mais uniformes do que utilizando o dry shipper. Palavras-chave: Dry shipper. Máquina de congelação programada. Peixe. Reprodução.

10 9 ABSTRACT Common Curimatã (Prochilodus brevis) is a rheophilic fish found in some states (Ceará, Piauí and Rio Grande do Norte) of northeastern Brazil. However, overfishing and river dams, which prevent the migration of P. brevis of for reproduction, jeopardize the survival of this species. Accordingly, there is interest among researchers regarding P. brevis semen cryopreservation, both for aquacultural production and for the preservation of genetic material in conservation programs. This study aimed to evaluate the efficiency of different extenders and freezing equipment to freeze the semen of P. brevis. Males (n = 12) bred at Laboratory of Biotechnology of Reproduction Fish were hormonally induced with a pituitary extract from common carp (3 mg kg -1 ) to induce spermiation. After 18 h of induction, the animals were sedated, their lengths and weights the same were recorded, and semen was collected individually. After collection, an objective analysis of the motility of the semen was performed with the aid of Sperm Class Analyzer; the ph, volume, osmolality were measured and fixed rates for morphology and sperm concentration. For cryopreservation, the semen samples (n = 8) from each animal were diluted in four different treatments (glucose + DMSO-dimethyl sulfoxide, glucose + MG-methyl glycol, Beltsville Thawing Solution-BTS+ DMSO and BTS + MG) and packaged into 0.25 ml straws. Two different types of freezing equipment were used: a programmed freezing machine and a dry shipper. After 10 days, the semen samples were thawed (25 C / 30 s) and evaluated with regard to kinetics and sperm morphology with the aid of the Sperm Class Analyzer software. The physico-chemical parameters (ph: 8.21 ± 0.27; osmolarity: ± mosm; concentration: ± 2.77 x10 9 sptz ml -1 ) of the semen in natura were similar to those observed in other studies of Characiformes, thus allowing semen cryopreservation. Glucose, when used as a diluent in association with the MG cryoprotectant (glucose + MG), resulted in a high percentage of mobile spermatozoa after dry shipper (76.88 ± 4.84%, P> 0.05; Coefficient of Variation C.V.: 17.8) and programmed freezing machine (70.95 ± 1.76%, P> 0.05; C.V.: 7.01), and both were higher (P <0.05) than with the other treatments (glucose + DMSO: ± 2.26% and ± 2.87%; BTS + DMSO: ± 3.14% and ± 2.62; BTS + MG: ± 5.06% and ± 3.36%). Furthermore, glucose + MG resulted in superior sperm velocities (VCL: ± 2.88 µm s -1 ; VSL: ± 3.01 µm s -1 ; APV: ± 3.08 µm s -1, P <0.05) to other treatments, and a larger amount of normal spermatozoa (74.56 ± 0.77%; P<0,05) was observed when the semen was cryopreserved using the programmed freezing machine. However, bent tail was an observed abnormality. Thus, glucose + MG in combination with dry shipper or programmed freezing machine is recommended for P. brevis semen cryopreservation.

11 10 The use of the programmed freezing machine is preferred because the results were more uniform than when using the dry shipper. Keywords: Dry shipper. Programmed freezing machine. Fish. Reproduction.

12 11 LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Curimatã comum (Prochilodus brevis)

13 12 LISTA DE QUADROS Quadro 1 - Lista de alguns peixes Characiformes e os crioprotetores, os diluentes e os equipamentos utilizados no processo de criopreservação seminal

14 13 LISTA DE TABELAS Capítulo 1 Tabela 1 - Lista de alguns peixes Characiformes e os crioprotetores, os diluentes e os equipamentos utilizados no processo de criopreservação seminal Capítulo 2 Table 1 - Mean ± standard deviation of P. brevis semen parameters in natura (n= 8 males) Table 2 - Mean and standard error of the kinetic parameters (curvilinear velocity - VCL, straight-line velocity - VSL, and average path velocity - VAP) of P. brevis semen after thawing for various treatments (n= 6 replicate straws x 8 males from each treatment) Table 3 - Mean ± standard error of the variables recorded as a percentage of mobile spermatozoa; the results were evaluated post-thawing in P. brevis semen as a function of the interaction of treatment and freezing method (n= 3 replicate straws x 8 males from each treatment and from each freezing method) Table 4 - Percentage of defects in the tail of post-thaw sperm (broken tail, coiled tail, and corrugated tail) of semen from P. brevis for various treatments (n= 6 replicate straws x 8 males from each treatment) Table 5 - Correlation matrix among the kinetic, morphological, and physico-chemical characteristics of P. brevis semen

15 14 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ACP Água de Coco em Pó ATP Adenosina tri-fosfato BTS Beltsville Thawing Solution CAPES Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CASA Análise do Sêmen Assistida por Computador (Computer Assisted Sperm Analyses) CE Ceará DMA Dimetilacetamida DMF Dimetilformamida DMSO Dimetilsulfóxido EDTA Ácido etilenodiamina tetra-acético EHC Extrato Hipofisário de Carpa FINEP Financiadora de Estudos e Projetos LBRP Laboratório de Biotecnologia da Reprodução de Peixes M III Merck III MF Metilformamida MG Metil glicol ph Potencial Hidrogeniônico PI Piauí PPGCV Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias RN Rio Grande do Norte SAS - Statistical Analysis System SCA Sperm Class Analyzer UECE Universidade Estadual do Ceará UFC Universidade Federal do Ceará USP Universidade de São Paulo VAP Velocidade média do percurso (Average Path Velocity) VCL Velocidade Curvilinear (Curvilinear Velocity) VSL Velocidade Progressiva Linear (Straight Line Velocity)

16 15 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA ESPÉCIE TAXONOMIA CRIOPRESERVAÇÃO Diluidores Equipamentos Dry shipper Caixa térmica de poliestireno Máquina de congelação programada ANÁLISE SEMINAL Análise da cinética espermática Análise da morfologia espermática JUSTIFICATIVA HIPÓTESES CIENTÍFICAS OBJETIVOS OBJETIVO GERAL OBJETIVOS ESPECÍFICOS CAPÍTULO CAPÍTULO CONCLUSÕES PERSPECTIVAS REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

17 16 1 INTRODUÇÃO A espécie Prochilodus brevis, popularmente conhecida como curimatã comum, é um peixe Characiforme que se distribui em bacias hidrográficas interiores e costeiras do Nordeste do Brasil, sendo endêmica nos estados do Ceará, do Rio Grande do Norte e do Piauí (ROSA et al., 2005; CHELLAPPA et al., 2009). Apesar de possuir uma considerável importância econômica e ecológica nesta região, sua biologia reprodutiva é pouco conhecida. Além disso, esta espécie fica bastante ameaçada pela pesca predatória no período que antecede a sua desova e pela construção de barragens em rios, que impedem a realização da migração para se reproduzirem (NASCIMENTO, M. et al., 2012). Em virtude disso, surge nos pesquisadores o interesse sobre o estudo da reprodução dessa espécie, e uma das áreas em ascensão para reprodução assistida é a criopreservação do sêmen, tanto para a produção em aquicultura, como para preservação de material genético em programas de conservação (CAROLSFELD et al., 2003). Vários estudos mostram que a criopreservação é uma boa alternativa para a melhoria da reprodução de peixes, tendo em vista que seus benefícios são variados, dentre eles: sincroniza a disponibilidade dos gametas; facilita o transporte e evita envelhecimento dos mesmos; conserva a variabilidade genética; reduz os custos de manutenção do plantel de reprodutores e possibilita trocas de material genético entre criadouros (CARNEIRO et al., 2006). No entanto, para se obter uma boa qualidade seminal pós-descongelação é necessária a interação de diversos fatores, como de um bom diluidor, que assegure a nutrição e a proteção dos espermatozoides, e de taxas de resfriamento adequadas, que evitem as crioinjúrias. Havendo, portanto, a necessidade da padronização de protocolos de criopreservação, principalmente da técnica empregada para controle da queda da temperatura, que pode ser obtida com a utilização do dry shipper ou da máquina de congelação programada. Quando a interação adequada entre esses fatores supracitados não acontece, podem ocorrer danos celulares, havendo a necessidade de que se analisem os principais parâmetros do sêmen pós-descongelação, como a motilidade e morfologia espermática (SALMITO- VANDERLEY et al., 2014), que influenciam diretamente a taxa de fertilização (RURANGWA et al., 2004; FELIZARDO et al., 2010).

18 17 Diante disso, este trabalho objetiva avaliar a eficiência de diferentes diluidores e equipamentos de congelação na criopreservação do sêmen de curimatã (P. brevis) quanto aos parâmetros: motilidade total, velocidades e morfologia espermáticas. Para uma melhor compreensão do assunto abordado nessa dissertação, seguirá uma revisão de literatura abordando os tópicos: espécie, taxonomia, criopreservação e análise seminal.

19 18 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 ESPÉCIE A espécie (Figura 1) Prochilodus brevis Steindachner, 1875 (=Prochilodus cearensis), conhecida regionalmente por curimatã comum, é um teleósteo pertencente à ordem dos Characiformes e nativo do semiárido nordestino brasileiro (CE, PI, RN) sendo introduzido em alguns estados da região sudeste (DOURADO, 1981). Figura 1. Curimatã comum (Prochilodus brevis) Fonte: Laboratório de Biotecnologia da Reprodução de Peixes, 2012 O curimatã possui grande valor biológico e econômico, que de acordo com Fontenele (1982) ocupa lugar de destaque pela precocidade, prolificidade, regime alimentar e grande aceitação pelos habitantes do Nordeste. Caracteriza-se por ter um hábito alimentar planctófago em seus estágios iniciais de vida e na fase adulta é iliófago, alimentando-se de restos de animais e de vegetais depositados no fundo de açudes e viveiros (DOURADO, 1981). Constitui-se como uma espécie de desova total e reofílica, que migra vários quilômetros rio acima a fim de encontrar as áreas de reprodução e realizar a desova (GURGEL; VERANI; CHELLAPPA, 2012). A reprodução em ambiente natural está relacionada às enchentes dos rios, nas épocas de chuvas no Nordeste, que ocorrem entre os meses de dezembro a junho. Nesse período constata-se a evolução das gônadas, migração para realização da desova, ao mesmo tempo, a liberação dos espermatozoides pelos machos, ocorrendo a fecundação externa (PORTO, 1987). Quando não ocorrem as chuvas ou quando o animal está em cativeiro, essa migração para a reprodução é impedida, sendo, portanto necessária à realização da indução hormonal para a maturação final e reprodução assistida. Um dos preparados hormonais mais utilizados em espécies nativas brasileiras é o extrato bruto hipofisário de carpa (EHC) (ZANIBONI

20 19 FILHO; WEINGARTNER, 2007), que atua induzindo essa maturação final, com consequente liberação dos gametas. Além das secas, a construção de barragens em rios impedindo a realização da migração para a reprodução e a pesca predatória no período que antecede a desova, afetam a sobrevivência dessa espécie (NASCIMENTO, M. et al., 2012). Também, a urbanização, a poluição, o extrativismo, as intensas atividades agrícolas com o uso de agrotóxicos, a sobrepesca, e a introdução de espécies exóticas estão relacionadas com o declínio dos estoques de peixes de piracema (CAROLSFELD et al., 2003). 2.2 TAXONOMIA Domínio : Eukaryota Reino : Animalia Filo : Chordata Subfilo : Vertebrata Superclasse : Gnathostomata Classe : Actinopterygii Subclasse : Neopterygii Divisão : Teleostei Subdivisão : Euteleostei Superordem : Ostariophysi Ordem : Characiformes Família : Prochilodontidae Gênero : Prochilodus Espécie : Prochilodus brevis (= Prochilodus cearensis) (CASTRO; VARI, 2003) 2.3 CRIOPRESERVAÇÃO A criopreservação é uma técnica que permite o armazenamento de células, como os gametas, em nitrogênio líquido a -196 ºC, mantendo-se a viabilidade estrutural e funcional celulares por tempo indeterminado.

21 20 Os benefícios da criopreservação de sêmen consistem em: a) fornecer subsídios para a formação de bancos de germoplasma, a fim de garantir a diversidade e a preservação do material genético de espécies de interesse econômico e ambiental; b) troca de material genético entre as explorações piscícolas, evitando o transporte de animais; c) disponibilidade de sêmen em períodos menos favoráveis, evitando assim o problema de assincronia da maturação gonadal; d) economia de sêmen, pois permite o uso do volume total disponível, principalmente quando é de difícil obtenção; ou quando grandes quantidades de volume de sêmen são obtidas em cativeiro, permitindo o armazenamento do sêmen e a sua utilização posteriormente; e) viabilidade de programas de hibridização utilizando peixes com a reprodução em diferentes épocas do ano (CAROLSFELD et al., 2003; MARIA; AZEVEDO; CARNEIRO, 2009; CABRITA et al., 2010; CARNEIRO et al., 2012). Além disso, permite o transporte de material genético através de longas distâncias com baixo custo, maior segurança, preservando a integridade física do animal e evitando a propagação de doenças entre eles (CARNEIRO et al., 2012). No entanto, para obter o sucesso de tal técnica é necessária a utilização e interação de diversos fatores, tais como: bom diluente, que forneça nutrientes adequados às células; crioprotetor, que evite as crioinjúrias, como a formação de cristais de gelo; tempo e método de adição dos crioprotetores; método de envase; taxa de resfriamento, temperatura e tempo de descongelação apropriados, com o objetivo de evitar choque térmico e de danificar os espermatozoides quanto à morfologia; método de avaliação da motilidade espermática, dentre outros (SALMITO-VANDERLEY et al., 2012). Por isso, observa-se na literatura a busca da padronização de protocolos adequados aos parâmetros fisiológicos (por exemplo: a osmolaridade, o ph, entre outros) de cada espécie animal (SILVA; GUERRA, 2011; SALMITO-VANDERLEY et al., 2012). Com isso, garante-se uma qualidade seminal pós-descongelação e o uso do sêmen em programas de fertilização assistida obtendo melhores taxas de fertilização e eclosão, como encontrado por Viveiros et al. (2010) ao criopreservarem sêmen de Prochilodus lineatus, em que obtiveram 97% de espermatozoides móveis e uma taxa de fertilidade de 64% Diluidores Para que o sêmen possa ser criopreservado é necessário que seja adicionado uma solução diluidora, que é composta por um diluente, com a função de diluir e de fornecer nutrientes, e por crioprotetor intracelular e extracelular, com o intuito de permitir o

22 21 armazenamento adequado e proteger os espermatozoides contra o choque térmico (MARIA; CARNEIRO, 2012; SALMITO-VANDERLEY et al., 2012). As condições exigidas para que o diluidor possa atuar de forma eficaz são: isotonicidade (que não ative a motilidade espermática), estabilidade ao longo do armazenamento, que seja estéril e carreador de crioprotetores (MARIA, 2005). Os diluentes (Quadro 1) já utilizados no processo de criopreservação do sêmen de peixes Characiformes foram: glicose, cloreto de sódio (NaCl), Beltsville Thawing Solution (BTS), água de coco, água de coco em pó (ACP ), Saad, Merck III, Ringer e Kurokura. Observa-se na literatura, que o diluente glicose é o mais utilizado na criopreservação de sêmen de peixes Characiformes (SALMITO-VANDERLEY et al, 2012), conferindo elevado percentual de espermatozoides móveis. Isso pode ser observado em diversas espécies, como P. lineatus motilidade entre 63 a 92% (NASCIMENTO, A. et al., 2012), Prochilodus magdalenae motilidade entre 20 a 71% (MARTÍNEZ; TARAZONA- MORALES; PARDO-CARRASCO, 2012), Brycon orbignyanus motilidade entre 77 a 89% (NASCIMENTO, A. et al., 2012) e Brycon opalinus motilidade entre 18 a 88% (VIVEIROS et al., 2012b). Além de proporcionar bons resultados, a glicose é um diluente bastante simples e estável, que pode ser utilizado em fazendas sem nenhum equipamento de laboratório, uma vez que é adquirida como uma solução estéril e pronta para o uso (NASCIMENTO et al., 2010). Outro diluente que foi desenvolvido para o sêmen de suínos, mas que vem sendo amplamente utilizado em sêmen de peixes Characiformes é o BTS (SALMITO- VANDERLEY et al., 2012), que possui em sua composição glicose, citrato de sódio, ácido etilenodiamina tetra-acético (EDTA), bicarbonato de sódio, cloreto de potássio e sulfato de gentamicina. Foi testado com sucesso em Brycon insignis motilidade entre 23 a 77% (VIVEIROS et al., 2011a), B. orbignyanus motilidade entre 77 a 92% (NASCIMENTO, A. et al., 2012) e P. lineatus motilidade entre 69 a 92% (NASCIMENTO, A. et al., 2012). Já os crioprotetores irão atuar evitando a formação de cristais de gelo, diminuindo o estresse osmótico por meio da reposição de água necessária para manutenção do volume celular, interagindo com íons e macromoléculas, reduzindo o ponto de congelação da água, assim como servir como tampão ajustando as alterações do ph (MEDEIROS et al., 2002; SOARES; GUERRA, 2009). Eles podem ser classificados em intracelular, que é uma substância química não tóxica capaz de retirar a água da célula e diminuir a temperatura de congelação no seu interior, impedindo a formação de cristais de gelo internamente; ou em

23 22 extracelular, que revestem a célula externamente e estabilizam sua membrana, diminuindo os danos provocados pela congelação (CARNEIRO, 2007). Os crioprotetores mais utilizados (Quadro 1) em sêmen de peixes Characiformes foram: a) Intracelulares: Dimetilsulfóxido (DMSO), metil glicol (MG), metanol, propilenoglicol, dimetilacetamida (DMA), dimetilformamida (DMF) e metilformamida (MF); b) Extracelulares: gema de ovo e lactose. Entre os crioprotetores internos supracitados, os mais utilizados são o DMSO e o metil glicol. O DMSO já vem sendo testado com sucesso em diversas espécies de Characiformes, como B. insignis motilidade entre 23 a 46% (VIVEIROS et al., 2011a), B. opalinus motilidade entre 28 a 78% (VIVEIROS et al., 2012b), B. orbignyanus motilidade entre 77 a 89% (NASCIMENTO, A. et al., 2012), P. lineatus motilidade entre 63 a 92% (NASCIMENTO, A. et al., 2012) e P. magdalenae motilidade entre 20 a 71% (MARTÍNEZ; TARAZONA-MORALES; PARDO-CARRASCO, 2012). O metil glicol também apresenta resultados satisfatórios nas espécies B. insignis motilidade entre 77 a 82% (VIVEIROS et al., 2011a), B. opalinus motilidade entre 18 a 88% (VIVEIROS et al., 2012b), B. orbignyanus motilidade entre 78 a 88% (NASCIMENTO, A. et al., 2012) e P. lineatus - motilidade entre 70 a 85% (NASCIMENTO, A. et al., 2012). Já entre os crioprotetores externos supracitados, o mais utilizado na literatura é a gema de ovo. No entanto, Leite et al. (2011) ao criopreservarem sêmen de tambaqui (Colossoma macropomum) concluíram que a adição de gema de ovo ao diluidor seminal diminuiu a motilidade espermática após descongelação. Quadro 1. Lista de alguns peixes Characiformes e os crioprotetores, os diluentes e os equipamentos utilizados no processo de criopreservação seminal. Espécie Crioprotetores Diluentes Equipamento Autores Brycon 10% DMSO, gema V2e ; Glicose Caixa térmica Ninhaus - cephalus de ovo de poliestireno Silveira et al., 2006 Brycon 10% DMSO e 10% 0,9% NaCl, 5% glicose, Dry shipper Viveiros et insignis Metil glicol 5% BTS e 6% Merck al., 2011a III (M III)

24 23 10% Metil glicol Beltisville Thawing Solution (BTS) Dry shipper Viveiros et al., 2012a Brycon 10% DMSO e 10% NaCl 154mM, NaCl Dry shipper Oliveira et nattereri Metil glicol 200mM, Saad, BTS e al., 2007 glicose 277mM 10% Metil glicol BTS, 0,9% NaCl Dry shipper Viveiros et al., 2011b Brycon opalinus 10% DMSO e 10% Metil glicol NaCl e glicose Dry shipper Viveiros et al., 2012b Brycon 10% DMSO, 10% NaCl 154 mm, 5% BTS Dry shipper Maria et al., orbignyanus Metanol, 10% e 6% M III 2006 Metil glicol, 5% Gema de ovo Colossoma macropomum DMSO e gema de ovo Dimetilacetamida, DMSO, metanol, propilenoglicol e etilenoglicol Glicose Dry shipper Galo et al., Dry shipper Menezes et al., % DMSO, 10% ACP e Ringer Caixa térmica Vieira, 2010 Metil glicol de poliestireno 10% Dimetilsulfóxido e 5% e 10% gema de ovo 5% glicerol; 10% DMSO; e 2%, 5%, 8%, e 11% de ACP Dry shipper Leite et al., 2011 BTS Dry shipper Varela Jr. et al., 2012a

25 24 Dimetilacetamida, de Metilformamida, e de dimetilformamida 5, 10, 15 e 20% de DMSO BTS Dry shipper Varela Jr. et al., 2012b 10% DMSO, 10% 5%, 5,4%, 5,8%, 6,2% Dry shipper e Carneiro et Metil glicol e 10% e 6,6% de solução de Máquina de al., 2012 gema de ovo glicose Congelação Programada (TK 4000 ) Piaractus 10% DMSO e 10% ACP, 5% Glicose e Caixa térmica Velásquez- brachypomus Metil glicol Ringer de poliestireno Medina, e Dry shipper % DMSO e 10% Metil glicol 10% DMSO e 10% Metil glicol Gema de ovo, 10% de DMSO, 5% de etilenoglicol, ou 10% de metanol ACP e Ringer Dry shipper Melo, 2010 Glicose e BTS Dry shipper Nascimento et al., 2010 Glicose Dry shipper Ramírez- Merlano et al., 2011 Piaractus 20 % de gema de 5 % glicose, Zorlesco Dry shipper Streit Jr. et mesopotamicus ovo, 10 % DMSO, modificado al., ,16g de KCl mais 10% de glicerol. (ZOR), BTZOR (desenvolvido na UEM), Andro-Hepes,

26 25 BTS Gema de Ovo e DMSO Metanol 10% e dimetilsulfóxido (DMSO) 10% Glicose Dry shipper Streit Jr. et al., % BTS Dry shipper Paulino et al., Prochilodus 10% DMSO e 10% 0,9% NaCl, 5% glicose, Dry shipper Viveiros et lineatus Metil glicol 5% BTS e 6% M III al., % Metil glicol ACP e 5% de glicose Dry shipper Viveiros et al., % DMSO, metanol, 5% gema de ovo, lactose Metanol 8%, DMSO 8% e lactose 5% Metanol ou DMSO nas concentrações de 5%,7,5%,10% e 12,5%. 5% BTS Dry shipper Felizardo et al., 2010 BTS Dry shipper Felizardo et al., % BTS Dry shipper Miliorini et al., 2011 DMSO BTS Dry shipper Navarro et al., 2014 Prochilodus 12% Gema de ovo; 5,5%, 6% e 6,5% Dry shipper Martínez; magdalenae DMSO nas Glicose Tarazona- concentrações de Morales; 5%, 10% e 15% Pardo- Carrasco, 2012

27 26 12% gema de ovo, 10% DMSO 6% glicose Máquina de congelação programada (FreezeControl, CryoLogic Pty. Ltd., Victoria, AU) Martínez; Pardo- Carrasco, %, 10% e 12% de Dimetilacetamida e 12% gema de ovo 6% Glicose Dry shipper Atencio et al., 2013 De acordo com Watson (2000), o protocolo de criopreservação tem uma série de tensões potencialmente prejudiciais às células. Por um lado, a mudança de temperatura, que pode afetar as estruturas presentes nas membranas, como as proteínas; em segundo, as tensões osmóticas e tóxicas apresentadas pela exposição aos crioprotetores, e em terceiro, a formação de cristais de gelo e a dissolução de gelo no meio extracelular. Logo, a fim de verificar a eficiência do protocolo utilizado, Cabrita et al. (2010) ressaltaram a importância da avaliação da qualidade do sêmen usando as ferramentas disponíveis, tais como testes de viabilidade, o teor de ATP, a análise da motilidade, a integridade do DNA, entre outros. De fato, esta análise bem feita será decisiva para a seleção de amostras com um bom sêmen e para a padronização de protocolos de criopreservação adequados para cada espécie Equipamentos utilizados no processo de criopreservação Após a etapa de diluição do sêmen e envasamento do sêmen diluído em palhetas ou criotubos, o material é submetido à diminuição de temperatura, até serem finalmente mergulhados e armazenado em nitrogênio líquido (SALMITO-VANDERLEY et al., 2012). Pode-se observar na tabela 1 que os equipamentos utilizados para a redução da temperatura e, consequente, congelação do sêmen de peixes Characiformes são o dry

28 27 shipper, caixas térmicas de poliestireno, máquinas de congelação programada e botijões criogênicos. Nos três primeiros equipamentos de congelação citados, o sêmen diluído permanece por um período limitado até que seja transferido aos botijões criogênicos. Nestes, como a velocidade do metabolismo celular é quase nula a -196 ºC, o tempo de estocagem pode ser ilimitado em condições ideais, que compreende basicamente a manutenção do nível de nitrogênio líquido no botijão (CARNEIRO, 2007). Agora será detalhado cada um dos equipamentos utilizados no processo de resfriamento do sêmen para posterior congelação e transferência ao botijão Dry shipper O dry shipper é um equipamento de alumínio prático e seguro utilizado no processo de criopreservação, já que é fácil de ser transportado e possui em seu interior um material poroso que absorve o nitrogênio líquido e evitando assim o perigo de vazamento (CAROLSFELD et al., 2003). Esse equipamento atua liberando o nitrogênio na forma de vapor, fazendo assim que a congelação das células espermáticas ocorra de forma gradativa, em uma taxa de congelação de ºC/min com uma estabilização gradual a -181 ºC em 3 min. (TAITSON; CHAMI; GODINHO, 2008). As palhetas ou criotubos que foram introduzidos nesse equipamento permanecem por um curto período de tempo, que pode ser de alguns minutos a poucos dias, sendo assim transferidos posteriormente, de acordo com o protocolo, para os botijões criogênicos. O dry shipper já foi testado com sucesso em protocolos de criopreservação de diversas espécies de peixes Characiformes, como B. insignis (VIVEIROS et al., 2011a; VIVEIROS et al., 2012a), Brycon nattereri (OLIVEIRA et al., 2007; VIVEIROS et al., 2011b), B. opalinus (VIVEIROS et al., 2012b), B. orbignyanus (MARIA et al., 2006; GALO et al., 2011), C. macropomum (MENEZES et al., 2008; LEITE et al., 2011; CARNEIRO et al., 2012; VARELA JR. et al., 2012a; VARELA JR. et al., 2012b), Piaractus brachypomus (VELÁSQUEZ-MEDINA, 2008; MELO, 2010; NASCIMENTO et al., 2010; RAMÍREZ- MERLANO et al., 2011), Piaractus mesopotamicus (STREIT JR. et al., 2006; STREIT JR. et al., 2009; PAULINO et al., 2012), P. lineatus (VIVEIROS et al., 2009; FELIZARDO et al., 2010; VIVEIROS et al., 2010; FELIZARDO et al., 2011; MILIORINI et al., 2011; NAVARRO et al., 2014) e P. magdalenae (MARTÍNEZ; TARAZONA-MORALES;

29 28 PARDO-CARRASCO, 2012; ATENCIO et al., 2013), observando-se também que é o mais utilizado nos últimos anos na congelação de células espermáticas de peixes (Quadro 1) Caixa térmica de poliestireno A caixa térmica de poliestireno, conhecida popularmente como caixa de isopor, ainda não é amplamente utilizada no processo de criopreservação de peixes Characiformes, porém foi observado o seu uso nas espécies Brycon cephalus (NINHAUS - SILVEIRA et al., 2006), C. macropomum (VIEIRA, 2010) e P. brachypomus (VELÁSQUEZ-MEDINA, 2008), como observado na tabela 1. As principais vantagens da caixa de isopor são: fácil manuseio, fácil transporte e baixo custo de aquisição, sendo assim possível a utilização em locais que não há disponibilidade de tecnologias e em fazendas de criação de peixes. Entretanto, possui como desvantagens: difícil padronização das curvas de congelação e controle da temperatura. Tal equipamento é adaptado utilizando-se uma bandeja metálica, conhecida como rampa, que dista do fundo do recipiente alguns centímetros, geralmente 10 cm. Para a congelação das amostras é adicionada uma determinada quantidade de nitrogênio líquido, que altera de acordo com a temperatura desejada, a espécie de peixe e o tipo de diluidor utilizado. Então, as amostras diluídas são suspensas na bandeja e congeladas por um período específico (LINHARES, 2012). No trabalho realizado por Irawan, Vuthiphandchai e Nimrat (2010) com carpa comum (Cyprinus carpio) testando diferentes métodos de congelação para o sêmen de tal espécie, obtiveram que a utilização da caixa térmica de poliestireno (91% de motilidade total) é tão eficiente quanto à utilização de uma máquina de congelação programada (89% de motilidade total) Máquina de congelação programada No processo de criopreservação, a velocidade da queda da temperatura utilizada também pode influenciar os resultados. Logo, a utilização de uma técnica padronizada, como a máquina de congelação computadorizada, irá permitir a queda homogênea e gradual da temperatura. Há diversos modelos, em que o pesquisador programa a velocidade e a curva de refrigeração desejada.

30 29 Na literatura observa-se a utilização da máquina de congelação programada em diversas espécies de animais, como a humana (DOHLE et al., 2008) e a canina (NEVES et al., 2009), existindo poucos trabalhos que a utilizam no sêmen de peixes Characiformes, nas espécies C. macropomum (CARNEIRO et al., 2012) e P. magdalenae (MARTÍNEZ; PARDO-CARRASCO, 2013), como observado na tabela 1. Além das vantagens mencionadas, os congeladores programáveis são apropriados para a congelação de grandes quantidades de palhetas de sêmen (SOARES; GUERRA, 2009) permitindo assim a utilização em larga escala na Aquicultura ANÁLISE SEMINAL Para verificar a eficácia das variáveis do protocolo de congelação, como a utilização do diluente, do crioprotetor e do método de congelação empregado, é necessário utilizar mecanismos de avaliação da qualidade seminal pós-descongelação, em que os principais são: avaliação da morfologia e da cinética espermática, pois esses parâmetros estão relacionados diretamente com a taxa de fertilização Análise da cinética espermática O estudo da motilidade espermática serve de base para a avaliação do material fecundante (SALISBURY; VANDEMARK, 1964), uma vez que a motilidade e a sua duração são correlacionadas positivamente com as taxas de fertilização em peixes (RANA, 1996; VIVEIROS et al., 2010). Dessa forma, há necessidade de que se avalie o sêmen antes e após o processo de criopreservação, a fim de que se tenha um material com um possível potencial fecundante. Essa avaliação pode ser realizada de forma subjetiva ou objetiva. Na forma subjetiva, com o auxílio da microscopia óptica, o avaliador estima, por meio de uma escala arbitrária de 0 a 100%, a taxa de espermatozoides móveis (TAITSON; CHAMI; GODINHO, 2008). Apesar da subjetividade de tal técnica, Viveiros et al. (2010) comprovaram que essa análise é tão confiável quanto a realizada objetivamente. Nos últimos anos, os métodos objetivos são considerados mais relevantes para a pesquisa em reprodução (SALMITO-VANDERLEY et al., 2014), o Computer Assisted Sperm Analysis (CASA) é um sistema automático (hardware e software Sperm Class Analyzer -SCA) utilizado para visualizar, digitalizar e analisar imagens sucessivas, em que

31 30 se obtêm dados significativos do movimento individual de cada célula, bem como de subpopulações de células espermáticas (AMANN; KATZ, 2004). Com o auxílio do software Sperm Class Analyzer é possível avaliar objetivamente a porcentagem de espermatozoides móveis (ou taxa de motilidade), além da porcentagem de espermatozoides com velocidade rápida, média ou lenta (SALMITO-VANDERLEY et al., 2014), morfologia, morfometria, fragmentação do DNA, concentração e vitalidade. Além disso, avalia as velocidades espermáticas (Velocidade curvilínea - VCL - μm s -1, velocidade linear progressiva - VSL μm s -1 e velocidade média da trajetória - VAP μm s -1 ) que são correlacionadas com a taxa de fertilização em peixes (VIVEIROS et al., 2010 VCL: r = 0,8; VSL: r = 0,56; VAP: r = 0,72; CARVALHO, 2013 VCL: 79%; VSL: 69%; VAP: 78%). O CASA já foi utilizado para vários grupos animais, como em humano (CRAUSAZ et al., 2008), cão (RIGAU et al., 2001), coelho (LAVARA et al., 2005) e garanhão (QUINTERO-MORENO et al., 2003). Em peixes já foi utilizado em diversas espécies, como B. insignis (VIVEIROS et al., 2012a), C. macropomum (LEITE et al., 2011), P. brachypomus (MELO, 2010), P. lineatus (VIVEIROS et al., 2010) e P. magdalenae (MARTÍNEZ; PARDO-CARRASCO, 2013) Análise da morfologia espermática Além da motilidade espermática, outro fator que influencia a taxa de fertilização do sêmen pós-descongelação é a morfologia espermática, uma vez que o aumento das patologias espermáticas acarreta a diminuição na capacidade de fertilização (LAHNSTEINER et al., 1998). Do mesmo modo, estudos têm comprovado que a criopreservação pode afetar a qualidade espermática, influenciando negativamente as taxas de fertilização (RURANGWA et al., 2004). Na análise da morfologia espermática, observam-se as patologias primárias (flagelo dobrado, cabeça isolada, gotas citoplasmáticas proximal e distal), que são decorrentes do processo de espermatogênese e as patologias secundárias (flagelo quebrado, enrolado, degenerado, macrocefalia, microcefalia), que são oriundas de fatores ambientais ou do processo de manejo, como a coleta do sêmen ou confecção das lâminas para avaliação dessas patologias (HERMAN; MITCHELL; DOAK, 1994). Essa análise irá auxiliar o uso de sêmen com menor quantidade de patologias, a fim de favorecer uma taxa de fertilização (CBRA, 2013) e eclosão mais alta, contribuindo com o

32 31 aumento da produção em aquicultura. O padrão normal de morfoanomalias dos espermatozoides é preconizado pelo Colégio Brasileiro de Reprodução Animal para mamíferos: bovinos, equinos, ovinos e suínos, no entanto, em peixes, as referências ainda não foram estabelecidas (MILIORINI, 2006).

33 32 3. JUSTIFICATIVA Experimentos de criopreservação de sêmen de diversas espécies do gênero Prochilodus já foram descritos na literatura, no entanto, não foi encontrado nenhum trabalho com a espécie P. brevis, que é nativa da região Nordeste do Brasil. Possui grande relevância econômica e ecológica, além disso, o curimatã encontra-se como uma das espécies com grande probabilidade de entrar em extinção, em virtude da pesca predatória que antecede a desova, sendo assim de fundamental importância a determinação de protocolos de criopreservação com o sêmen de curimatã comum. Resultados satisfatórios já foram observados com a utilização dos diluentes BTS e Glicose associados aos crioprotetores Dimetilsulfóxido (DMSO) ou Metil glicol em P. lineatus, que obtiveram ótimas taxas de motilidade espermática do sêmen pós-descongelado e menores danos às células espermáticas, contribuindo dessa forma para a utilização em outras espécies próximas, como no caso P.brevis. Além disso, para a implantação da criopreservação em larga escala na aquicultura, é necessário que haja a padronização do protocolo de congelação, que pode ser alcançado por meio da utilização da máquina de congelação programada. Esse equipamento ainda não foi testado para o sêmen de curimatã e na literatura existem poucos trabalhos com a utilização na criopreservação de peixes Characiformes.

34 33 4. HIPÓTESES CIENTÍFICAS O diluente BTS associado ao Metil glicol confere taxas de motilidade e de espermatozoides normais de curimatã pós-descongelação superior aos demais tratamentos. A máquina de congelação programada é mais eficaz que o dry shipper para a criopreservação do sêmen de curimatã comum (P. brevis).

35 34 5. OBJETIVOS 5.1 OBJETIVO GERAL Avaliar a eficiência de diferentes diluidores e equipamentos de congelação na criopreservação do sêmen de curimatã (P. brevis). 5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Avaliar a motilidade espermática do sêmen fresco e pós descongelação por meio do CASA; Comparar a motilidade e morfologia espermática entre os diluidores, entre os tratamentos e entre o sêmen fresco e pós descongelação; Verificar a eficiência da máquina de congelação programada, comparado ao equipamento padrão (dry shipper) no processo de criopreservação do sêmen de curimatã; Avaliar se há interação entre diluente, crioprotetor e o equipamento de congelação quanto à motilidade, velocidades e morfologia espermáticas.

36 35 6 CAPÍTULO 1 Metodologias para criopreservação e mecanismos de avaliação do sêmen de peixes Characiformes Methodologies for cryopreservation and mechanisms of sperm evaluation in characiformes fish Periódico: Acta Veterinaria Brasilica, v.8, Supl. 2, p , 2014

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45 44 7 CAPÍTULO 2 Use of different extenders and equipment for the cryopreservation of sperm from common curimatã (Prochilodus brevis) Uso de diferentes diluidores e equipamentos na criopreservação de sêmen de curimatã comum (Prochilodus brevis) Periódico: Journal of Applied Ichthyology (Submetido em 18 de agosto de 2014).

46 45 Use of different extenders and equipment for the cryopreservation of sperm from common curimatã (Prochilodus brevis) João Paulo Silva Pinheiro 1, Mônica Aline Parente Melo-Maciel 1, Francisco Renan Aragão Linhares 1, Júlia Trugilio Lopes 1, Priscila Silva de Almeida 1, Rômulo Roberto Ribeiro Pinheiro 1, Thaís Maia Torres 1, Ana Gláudia Vasconcelos Catunda 1 & Carminda Sandra Brito Salmito- Vanderley 1. 1 State University of Ceará, Integrated Center for Biotechnology, Biotechnology of Fish Reproduction Laboratory, Av. Dr. Silas Munguba, 1700, Fortaleza, Ceará, Brazil. Resumo O estudo avaliou a eficiência de várias soluções e equipamentos de congelação sobre a cinética e morfologia do sêmen criopreservado de Prochilodus brevis. As amostras seminais foram diluídas em cada um dos quatro diferentes tratamentos (glicose + dimetilsulfóxido-dmso, glicose + metil glicol-mg, Beltsville Thawing Solution-BTS + DMSO e BTS + MG), envasadas em palhetas de 0,25 ml e submetidas a dois diferentes equipamentos de congelação (máquina de congelação programada e dry shipper). Após 10 dias, as amostras seminais foram descongeladas e avaliadas quanto à morfologia e cinética espermáticas. Os parâmetros físico-químicos do sêmen in natura foram similares aos observados em outros estudos de Characiformes, portanto permitindo a criopreservação do sêmen. A glicose, quando usada como diluente em associação com o crioprotetor MG (glicose + MG), conferiu maior percentual de espermatozoides móveis após congelação no equipamento dry shipper (76,88 ± 4,84%) e em máquina de congelação programada

47 46 (70,95 ± 1,76%) do que quando a glicose foi utilizada com DMSO. Além disso, esse tratamento (glicose + MG) conferiu velocidades espermáticas (VCL:79,52 ± 2,88 µm s -1 ; VSL:45,46 ± 3,01 µm s -1 ; VAP:67,92 ± 3,08 µm s -1 ) mais elevadas que os demais tratamentos estudados, e uma maior quantidade de espermatozoides normais (74,56 ± 0,77%) foi observada quando o sêmen foi criopreservado utilizando a máquina de congelação programada. A anormalidade espermática mais encontrada foi a de cauda dobrada. Dessa forma, é recomendável a utilização de glicose + MG, em combinação com o dry shipper ou com a máquina de congelação programada para a criopreservação do sêmen de P. brevis. A utilização de uma máquina de congelação programada é mais recomendada, porque os resultados obtidos são mais uniformes do que utilizando o dry shipper. Summary This study evaluated the efficiency of various freezing solutions and freezing equipment on the kinetics and morphology of cryopreserved Prochilodus brevis sperm. The semen samples were diluted with one of four different treatments (glucose+ dimethyl sulfoxide-dmso, glucose+methylglycol-mg, Beltsville Thawing Solution-BTS+DMSO, and BTS+MG), loaded into 0.25 ml straws and subjected to two different freezing processes (programmed freezing machine and dry shipper). After 10 days, the semen samples were thawed and evaluated for sperm morphology and kinetics. The physicochemical parameters of the semen in natura were similar to those observed in studies of Characiformes, thus permitting semen cryopreservation. Glucose, when used as a diluent in association with the cryoprotectant MG (glucose+mg), yielded higher percentages of mobile spermatozoa after freezing in an equipment dry shipper (76.88 ± 4.84%) and in a programmed freezing machine (70.95 ± 1.76%) than when glucose was used with DMSO. Moreover, this treatment (glucose+mg) yielded a higher sperm velocity (VCL:79.52 ± 2.88 µm s -1 ; VSL:45.46 ± 3.01 µm s -1 ; VAP:67.92 ± 3.08 µm s -1 ) than the other studied treatments, and a greater amount of normal sperm (74.56 ± 0.77%) was observed when semen was cryopreserved using a

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