TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÃO E FERTILIZAÇÃO IN VITRO (FIV) EM BOVINOS

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1 UNIVERSIDADE CASTELO BRANCO CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÃO E FERTILIZAÇÃO IN VITRO (FIV) EM BOVINOS Igor Nascimento Martinez Leandro César de Souza Rio de Janeiro. set. 2007

2 IGOR NASCIMENTO MARTINEZ Aluno do curso de Especialização em Medicina Veterinária da UCB Matrícula LEANDRO CÉSAR DE SOUZA Aluno do curso de Especialização em Medicina Veterinária da UCB Matrícula TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÃO E FERTILIZAÇÃO IN VITRO (FIV) EM BOVINOS Trabalho monográfico de conclusão do curso de Medicina Veterinária (TCC), apresentado à UCB como requisito parcial para a obtenção do título Especialização em Produção e Reprodução Bovina, sob a orientação do Professor: Marconi Gauttieri Abba Rio de Janeiro. set. 2007

3 TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÃO E FERTILIZAÇÃO IN VITRO (FIV) EM BOVINOS Elaborado por Igor Nascimento Martinez e Leandro César de Souza Alunos do Curso de Especialização em Medicina Veterinária da UCB Foi analisado e aprovado com grau:... Rio de Janeiro de de Membro Membro Professor Orientador Presidente

4 Rio de Janeiro. set RESUMO O objetivo desse estudo é o de contribuir para um melhor entendimento, aperfeiçoamento e expansão da transferência de embrião e fertilização in vitro (FIV). A metodologia utilizada para esse estudo é denominada análise teórica, onde foram feitas revisões bibliográficas sobre o tema, abrangendo a coleta de informações em livros, sites, revistas e artigos. O estudo do tema desenvolveu-se em três partes: Na primeira parte será descrito sobre a transferência de embriões compreendendo desde sua aplicação até seu rastreamento e avaliação. Na segunda parte será descrito sobre a fertilização in vitro observando desde suas vantagens até a classificação de embriões. Na terceira parte será descrito sobre a aspiração folicular guiada por ultra-sonografia (OPU-FIV), compreendendo desde a fisiologia ovariana até a sincronização da onda para superovulação. Conclui-se através desse estudo que são bem maiores as vantagens do que as desvantagens da transferência de embrião e fertilização in vitro em bovinos. Espera-se que este trabalho possa contribuir para um melhor entendimento, aperfeiçoamento e expansão da transferência de embrião e fertilização in vitro (FIV), pois foram descorridos vários procedimentos utilizados para transferência embrião e fertilização in vitro em bovinos (FIV). Palavras-chave: transferência embrião; fertilização in vitro ; bovinos.

5 ABSTRACT The objective of this study is to contribute for one better agreement, perfectioning and expansion of the embryo transference and fertilização in vitro (FIV). The methodology used for this study is called theoretical analysis, where bibliographical revisions on the subject had been made, enclosing the collection of information in books, sites, magazines and articles. The study of the subject it was developed in three parts: In the first part he will be described on the transference of embryos understanding since its application until its tracking and evaluation. In the second part in will be described on the fertilização in vitro observing since its advantages until the classification of embryos. In the third part he will be described on the aspiration to folicular guided for extreme-sonografia (OPU-FIV), understanding since the ovariana physiology until the synchronization of the wave for superovulação. It is concluded through this study that is well bigger the advantages of what the disadvantages of the embryo transference and fertilização in vitro in bovines. One expects that this work can contribute for one better agreement, perfectioning and expansion of the embryo transference and fertilização in vitro (FIV), therefore had been descorridos some procedures used for transference embryo and fertilização in vitro in bovines (FIV). Word-key: transference embryo; fertilização in vitro ; bovines.

6 SUMÁRIO RESUMO... iii LISTA DE TABELAS... ix LISTA DE FIGURAS... x 1. INTRODUÇÃO TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES Aplicações e Limitações Seleção da doadora Superovulação Esquema de tratamento para a superovulação ECG (ou PMSG) FSH...16

7 2.5 Fatores que interferem nos resultados da superovulação Dose do hormônio Idade da doadora Pureza do hormônio Condições estressantes Dia do inicio do tratamento Superovulação associada a implantes de progesterona Sincronização do estro Métodos de sincronização Luteolíticos Progestágenos Seleção das receptoras Coleta dos embriões Rastreamento e avaliação Classificação quanto ao estágio de desenvolvimento FERTILIZAÇÃO "IN VITRO" Vantagens Coleta de Ovócitos...30

8 3.3 Recuperação Ovocitária Utilizando doadoras superovuladas Utilizando doadoras não superovuladas Coleta in vitro Método in vitro Maturação do Ovócito Preparação Espermática Fecundação in vitro Cultivo de embriões in vitro Classificações dos embriões ASPIRACÃO FOLICULAR GUIADA POR ULTRASONOGRAFIA (OPU- FIV) Fisiologia ovariana Aplicações da técnica Produção de maior número de embriões Menor intervalo entre gerações Melhor aproveitamento dos animais Avaliação morfológica dos ovócitos...44

9 4.4. Pesquisas na área da embriologia Produção in vitro de embriões (PIV) Produtos obtidos de vacas que não respondem à superovulação Produtos obtidos de animais com problemas reprodutivos Utilização de animais mortos Pré-Seleção de Touros Recuperação Ovário de matadouro com ou sem identificação Colheita de ovários e ovidutos Colheita e seleção de oócitos Vacas "acidentadas" Fatores de variação em programas de OPU Técnica de aspiração folicular guiada por ultra-som Procedimentos Superovulação Vantagens Desvantagens Variações na recuperação Diferença entre animais...59

10 Variações entre operadores Variações do comportamento do animal Tipo de Animal Variações com o tipo de equipamento utilizado Freqüência da aspiração Amniocentese Sincronização da onda para Superovulação...62 CONSIDERAÇÕES FINAIS...65 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...67

11 LISTA DE TABELAS Tabela 1 Classificação dos embriões bovinos quanto ao estágio de desenvolvimento e idade aproximada...26 Tabela 2 - Classificação dos embriões bovinos quanto a sua qualidade...27 Tabela 3 Preparação de meios...63 Tabela 4 Meio de Transporte...63 Tabela 5 - *TCC 199 HEPES...64

12 LISTA DE FIGURAS Figura 1-Transferência de embriões...23 Figura 2 - Esquema de montagem dos embriões em palhetas...28 Figura 3 - Ovócito bovino imaturo, logo após a punção...33 Figura 4 - Embriões bovinos produzidos in vitro, 48h após a FIV...33 Figura 5 Mórula compactada...37 Figura 6 Blastocisto inicial...38 Figura 7 Blastocisto...38 Figura 8 Blastocisto expandido...39 Figura 9- Blastocisto eclodido...39

13 1. INTRODUÇÃO A técnica de transferência de embriões (T.E.) se desenvolve rapidamente na pecuária bovina brasileira. Com ela, o melhoramento genético pode ser efetuado com mais rapidez e eficiência, mesmo em pequenas populações de animais, com a disseminação do material genético de uma fêmea zootecnicamente superior. Com a finalidade de aproveitamento da capacidade reprodutiva de animais geneticamente superiores e tendo conhecimento da fisiologia ovariana, deu-se o desenvolvimento de protocolos hormonais possibilitando assim a ovulação múltipla seguida da transferência de embriões. Embora com grandes avanços nos últimos anos, o procedimento ainda é pouco difundido, quer pelo custo relativamente elevado, quer pela variação nos resultados (FERNANDES, 2001). O objetivo do presente trabalho tem como finalidade contribuir para um melhor entendimento, aperfeiçoamento e expansão da transferência de embrião e fertilização in vitro (FIV) em bovinos. A metodologia utilizada para esse estudo é denominada análise teórica, segundo Tachizawa (1989), esse método consiste em:

14 Uma simples, organização coerente de idéias originarias de bibliografia de alto nível, em torno de um tema específico; Uma análise crítica ou comparativa de uma obra, teoria ou modelo já existente, a partir de um esquema conceitual bem definido; O desenvolvimento de uma monografia realmente inovadora, a partir de fontes exclusivamente bibliográficas. Utiliza-se uma revisão bibliográfica sobre o tema, abrangendo a coleta de informações em livros, sites, revistas e artigos, englobando assim maiores informações sobre o tema proposto. O estudo do tema desenvolveu-se em três partes: Na primeira parte será descrito sobre a transferência de embriões compreendendo desde sua aplicação até seu rastreamento e avaliação. Na segunda parte será descrito sobre a fertilização in vitro observando desde suas vantagens até a classificação de embriões.

15 Na terceira parte será descrito sobre a aspiração folicular guiada por ultra-sonografia (OPU-FIV), compreendendo desde a fisiologia ovariana até a sincronização da onda para superovulação.

16 2. TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES 2.1 Aplicações e Limitações Assim como qualquer outra técnica aplicada à pecuária, a transferência de embriões apresenta vantagens ou aplicações e também algumas restrições e limitações à sua utilização. As principais são: Multiplicação rápida de um genótipo superior; Facilita transporte e estocagem de material genético; Permite controle de doenças; Controle do sexo do produto; Produção de descendentes de um animal jovem. As principais limitações são: Custo operacional; Condições mínimas. Existem algumas condições do animal e principalmente da propriedade, que devem ser levadas em consideração antes de se iniciar um programa de T.E.. As principais são descritas a seguir.

17 Doadoras geneticamente superiores; Aspecto sanitário do rebanho; Nutrição e reprodução; Mão-de-obra (FERNANDES, 2001). 2.2 Seleção da doadora Antes de iniciar um programa de T.E., a avaliação da doadora pode eliminar o risco de aborrecimentos futuros. As características principais a serem consideradas são as seguintes: Geneticamente superior; Não apresentar anomalias congênitas e/ou hereditárias; Histórico de boa fertilidade; Trato genital compatível com a técnica e sem alterações; Boa condição corporal; Livre de doenças infecto-contagiosas; Banho em tripsina limpa os embriões de patógenos; Fora de qualquer condição de estresse; CicIando regularmente (FERNANDES, 2001).

18 2.3 Superovulação Tem como objetivo estimular, através de administração de hormônios, o desenvolvimento de um grande número de folículos até o estágio no qual possa ovular. Estes folículos a mais que se tornam "ovulatórios", pertencem a uma onda de desenvolvimento, e normalmente sofreriam atresia. Com a indução hormonal, fornecemos a estes folículos também a condição de ovular. Desta forma, a afirmação que ocorre um desgaste reprodutivo da doadora, não é verdade. Geralmente não se utiliza hormônio visando a ovulação direta dos folículos. A onda pré-ovulatória de LH, que provocaria a ovulação de um folículo único no caso de um ciclo normal, geralmente é suficiente para luzir a ovulação de todos que possuam condição para tal, após um processo indução hormonal. A utilização de análogos do GnRH para melhorar a taxa ovulação apresenta resultados discordantes na literatura, porém pode ser alternativa para melhorar os resultados de determinados animais. É a etapa menos possível dentro da técnica de T. E. (FERNANDES, 2001). A variação dos resultados da superovulação é o principal fator limitante à grande contribuição que a técnica de transferência de embriões (T.E.) pode fornecer ao melhoramento genético é necessário um controle

19 rígido das variáveis possíveis, para que o processo de superovulação possa ser uma etapa mais previsível dentro do contexto da T.E.. O objetivo principal da superovulação é produzir um grande numero de ovulações e obter um número correspondente de embriões viáveis, que resultem em uma elevada taxa de gestação nas receptoras (FERNANDES, 2001). 2.4 Esquema de tratamento para a superovulação Independente do tipo de hormônio a ser utilizado, quando se visa a estimulação de um grande numero de folículos, devem-se ter em mente quando iniciar o tratamento, pois aqueles folículos que já entraram em atresia não podem ser mais estimulados a desenvolverem. Assim, os protocolos de superovulação devem iniciar numa fase da onda de desenvolvimento folicular onde o folículo dominante ainda não tenha provocado o início da atresia dos subordinados. As principais bases utilizadas são as seguintes: ECG (ou PMSG)

20 Trata-se de um hormônio denominado Gonadotrofina Coriônica Eqüina. É obtido do soro de éguas entre a 40.º e 100.º dia de gestação. Possui ação semelhante ao FSH e LH na mesma molécula FSH É a preparação hormonal mais utilizada para a superovulação de bovinos. Em sua maioria, os produtos hoje disponíveis no mercado, têm origem suína ou ovina, sendo extraído da hipófise destas espécies. Utilizam-se geralmente 8 aplicações, intervaladas de 12 horas. Alguns autores utilizam doses iguais, porém preferem dose total (100%) e divide a mesma em 8 doses menores, em regime decrescente. Este esquema pode ser usado para qualquer produto a base de FSH. A prostaglandina é aplicada simultaneamente a 7ª. e/ou 8ª. dose de FSH, e visa a regressão do corpo lúteo formado no dia 0 (cio base), levando a redução na taxa de progesterona, removendo o bloqueio na secreção de GnRH, dando início a um novo ciclo. Quando ocorrer a onda de LH, esta teoricamente encontrará uma série de folículos em condições de ovular, devido à indução hormonal (FERNANDES, 2001).

21 A aplicação de prostaglandina no terceiro dia de superovulação, como executada por alguns profissionais, às vezes faz com que o animal manifeste cio antes da última dose de FSH, que neste caso, não teria mais efeito. 2.5 Fatores que interferem nos resultados da superovulação Dose do hormônio Infelizmente é um fator que possui muita variação individual, e mesmo num animal, entre as coletas Idade da doadora com a idade que deve ser levada em consideração. Existe uma variação na resposta dos animais de acordo Pureza do hormônio

22 relação FSH: LH da preparação. Para produtos a base de FSH, a pureza diz respeito à Condições estressantes Além de qualquer condição patológica, como as descritas acima, um dos principais fatores estressantes, que existe em praticamente em todas as regiões do país, e o estresse térmico Dia do inicio do tratamento O tratamento superovulatório deve começar próximo ao início de uma onda de desenvolvimento folicular, porém os animais geralmente possuem duas ondas por ciclo, podendo inclusive, ter 3 ou até mesmo 4, sendo isto menos freqüente (FERNANDES, 2001). 2.6 Superovulação associada a implantes de progesterona

23 Trata-se de uma técnica desenvolvida recentemente, onde é possível iniciar o tratamento superovulatório das doadoras, independentemente do dia do ciclo estral no qual as mesmas se encontram. É um procedimento muito interessante por facilitar a programação de coletas, em diferentes propriedades e também de auxiliar no agrupamento de doadoras a serem coletadas no mesmo período. Para tal procedimento é necessária a sincronização previa da onda de crescimento folicular (GnRH ou Benzoato de Estradiol), além do uso de um implante de progesterona (Crestar ou CIDR), que vai funcionar como um corpo lúteo artificial, durante o processo de superovulação (FERNANDES, 2001). 2.7 Sincronização do estro A sincronização do estro tem sido amplamente utilizada, tanto em casos de monta natural ou inseminação artificial, como na técnica de transferência de embriões, para qual é imprescindível. O principal aspecto fisiológico da sincronização de estro entre doadoras e receptoras, é que devemos retirar o embrião de um ambiente (útero da doadora) e colocá-io em outro ambiente (útero da receptora), com condições o mais semelhantes possível, daquelas de origem. A transferência de embriões para receptoras não sincronizadas reduz drasticamente a taxa de gestação.

24 2.7.1 Métodos de sincronização Antecipando ou atrasando a próxima manifestação de estro. Qualquer uma destas formas necessita que os animais que vão ser sincronizados estejam ciciando regularmente. A relação dos métodos e drogas mais empregadas encontram-se nos subitens abaixo relacionados: Luteolíticos Age provocando uma antecipação do próximo estro (cio), pela regressão do corpo lúteo antes de um período normal (lise do CL = Luteolíticos). Em média, o estro ocorre de 36 a 72 horas após a aplicação. Quando sincronizamos o estro através de PGF2a, de uma doadora (durante superovulação) com um grupo de receptoras, estas últimas devem receber o luteolítico de 12 a 14 horas antes da doadora, pois a doadora geralmente manifesta estro mais cedo Progestágenos

25 É base de progesterona, atuam prolongando o ciclo estral e atrasando o próximo estro. Agem basicamente bloqueando o GnRH, funcionando como um CL artificial. Este tratamento deve ser utilizado por no mínimo 9 dias, quando então é interrompido abruptamente, removendo desta forma o bloqueio que a progesterona exógena exercia sobre a secreção de GnRH, dando condições para o inicio de um novo cicio, pela manifestação de estro (FERNANDES, 2001). 2.8 Seleção das receptoras Num programa de T.E., geralmente tem um cuidado extremado com as doadoras, e relegam-se as receptoras a um segundo plano. Porém um dos principais pontos de estrangulamento na difusão desta tecnologia diz respeito à taxa de gestação das receptoras. Os principais critérios a serem observados são os seguintes: A. Sem anomalias no trato genital

26 candidatas a futuras receptoras. Um exame ginecológico deve ser realizado em todas as B. Boa fertilidade, ciclos regulares plantel. As receptoras devem ser as fêmeas mais férteis do C. Boa condição corporal Esta associada a uma nutrição adequada. D. Sanitariamente perfeita Não é admissível que uma receptora, depois de gestante venha a perder a gestação devido a alguma doença infecto-contagiosa, que poderia ser facilmente diagnosticada durante o processo de seleção. E. Boa estatura

27 A importância deste fator vem da necessidade de um parto sem complicações. Caso haja mais receptoras que embriões, selecionar as mesmas por grau de sincronia: característica do corpo lúteo: escore corporal e fertilidade anterior (FERNANDES, 2001). 2.9 Coleta dos embriões A coleta dos embriões é feita pelo método não cirúrgico ou transcervical, em um período entre 6 a 8 dias após o estro, onde a doadora foi inseminada. A doadora deve estar bem contida. Inicialmente faz-se uma avaliação da resposta superovulatória, através da contagem por palpação via retal, do numero de corpos lúteos em cada ovário. Uma limpeza do reto também facilitará outros procedimentos. Feito isso, procede-se à anestesia epidural, com 6 a 7 ml de xilocaína a 2% sem vasoconstritor. Após a cauda estar relaxada, deve ser amarrada lateralmente ao animal. Prender a cauda para cima favorece a entrada de ar no reto e dificulta a manipulação. Após isto, uma higienização do períneo com água e sabão é necessária. Todo o sabão deve ser removido e a região seca. A vulva deve ser lavada somente com água. O cateter (FOLEY) é introduzido no útero com o auxilio de um mandril de aço. Este cateter é feito de borracha e possui duas vias. Uma que

28 dá aceso direto ao útero e a outra utilizada para inflar o balão existente na extremidade. Figura 1-Transferência de embriões (FERNANDES, 2001) Este esquema de lavagem é feito de 5 a 7 vezes em cada corno. Uma vez completado, o balonete é desinflado, retira-se o cateter e posiciona-se o mesmo no outro corno, repetindo todos os procedimentos. Em uma coleta (PBS), e cerca de 40 a 50 minutos. Terminada a coleta, o filtro é levado ao "laboratório", e antes de ser solta a doadora deve receber uma ou duas doses de PGF e se for necessário uma infusão com antibióticos para evitar a proliferação

29 bacteriana. Caso não apresente estro em 7 dias, deve ser novamente examinada e se necessário receber uma nova dose de PGF. Existem cateteres de vários modelos. Os mais comuns são de uso humano. O diâmetro também varia (tamanhos de 16 a 24), e deve ser adequado ao tipo de cérvix. Quando mais grosso o cateter mais difícil de passá-io pela cérvix, porém mais fácil é a coleta. Uma vez transposta a cérvix, o cateter deve ser posicionado, de forma que o balão seja inflado, com o líquido de coleta em um dos cornos. O enchimento do balão é feito lentamente, com o operador monitorado. Com o cateter posicionado, o circuito é conectado, e deixa-se o liquido de coleta entrar no útero até o enchimento do como. Este procedimento, caso possível, deve ser feito com o operador pressionando o limite entre o útero e tubas. O útero cheio é levemente massageado, deixando-se então sair o líquido de coleta (FERNANDES, 2001). Uma pessoa devera ficar responsável por este filtro durante toda a coleta, pois é onde os embriões ficarão retidos, controlando o volume de líquido no seu interior. Este deve ter sempre uma quantidade de líquido, e ser protegido de variações de temperatura e insolação direta. O líquido que sai do filtro é

30 coletado em um frasco estéril, para a avaliação posterior, quando necessário (FERNANDES,2001) Rastreamento e avaliação Refere-se a localização dos embriões e classificação dos mesmos. No laboratório o conteúdo do filtro de coleta é passado para uma placa de Petri, com diâmetro entre 10 e 15 cm, com fundo quadriculado, para facilitar a busca ou localização das estruturas, que é feito com microscópio estereoscópio, em aumento de 10 a 20 vezes. Em outra placa menor (3 cm de diâmetro), coloca-se uma das soluções de manutenção existentes, que podem ser compostas de PBS (liquido de coleta) com 10% de Soro Fetal Bovino (SFB), PBS com 0,4% de Albumina Bovina (BSA), ou ainda soluções prontas como Meio Holding. Estas soluções têm a função de proteger o embrião e evitar que o mesmo fique grudado nos recipientes ou instrumentos de manipulação, uma vez localizado na placa de procura, o embrião; é retirado desta por aspiração, é passado para a placa menor com uma das soluções acima descrita (FERNANDES, 2001).

31 Completada a busca quando todas as estruturas da placa de procura foram retiradas, procede-se então a classificação dos embriões que se encontram na placa menor com o mesmo aparelho óptico citado acima, porém em um aumento de 40 a 80 vezes. Esta é feita de acordo com dois parâmetros: estágio de desenvolvimento e qualidade (FERNANDES, 2001) Classificação quanto ao estágio de desenvolvimento Esta classificação leva em consideração o aspecto morfológico do embrião e as variações que ocorrem no mesmo durante seu desenvolvimento iniciai. Quando a coleta é feita entre 6 a 8 dias após o estro da doadora geralmente são encontradas estruturas assim calcificadas: 16 células (16 c); Mórula (M); Mórula compacta (Mc); Blastócito inicial (Bi); Blastócito (Bl); Blastócito expandido (Bex); Blastócito eclodido (Bec).

32 As anotações referentes à classificação dos embriões utilizam inicialmente a sigla do estágio de desenvolvimento e posteriormente a qualidade. Por exemplo, um blastócito inicial de qualidade excelente seria: Bi 1, e assim por diante. Este é um critério usado internacionalmente em T.E. (FERNANDES, 2001). Tabela 1 Classificação dos embriões bovinos quanto ao estágio de desenvolvimento e idade aproximada Estágio de desenvolvimento Idade aproximada (dias) Mórula 5 a 6 Mórula Compacta 6 Blastócito inicial 6 a 7 Blastócito 7 a 8 Blastócito expandido 8 Blastócito eclodido 9 Fonte: (FERNANDES, 2001) Classificação quanto a qualidade

33 A qualidade dos embriões é avaliada, também pelo seu aspecto morfológico, estando relacionada com a viabilidade dos mesmos. Os principais parâmetros considerados para avaliação da qualidade são os seguintes: Formato; Simetria; Coloração; Extrusão celular; Integridade da Zona Pelúcida. A classificação quanto à qualidade é feita atribuindo-se valores de 1 a 5, conforme a tabela 2. Tabela 2 - Classificação dos embriões bovinos quanto a sua qualidade Classificação Qualidade Comentários 1 Excelente Praticamente nenhuma alteração 2 Bom Pequenas alterações 3 Regular Alterações significativas 4 Ruim Bastante alterado (difícil avaliar) 5 Degenerado Comprometimento morfológico Fonte: (FERNANDES, 2001)

34 No caso de transferências não cirúrgicas, após a classificação e distribuição dos embriões pelas receptoras, estes devem ser envasados. É necessário mudá-ios de solução lavando-os pelo menos 4 vezes, para eliminação das impurezas presentes na Zona Pelúcida antes de colocá-ios nas palhetas. Utiliza-se uma outra solução idêntica aquela na qual estes foram classificados (PBS com 10% de SFB, ou com 0,4% de BSA, ou outra solução de manutenção). ar líquido + embrião líquido Figura 2 - Esquema de montagem dos embriões em palhetas Fonte: (FERNANDES, 2001) Os embriões são aspirados para o interior das palhetas de 0,25 ml, previamente identificadas (estágio e qualidade), com o mesmo líquido

35 onde estão (PBS + 10% de SFB ou 0,4% de BSA). Para impedir que fiquem presos no algodão da mesma, aspira-se, nesta ordem, uma coluna de liquido (1/4 do comprimento da palheta), uma pequena bolha de ar, uma segunda coluna de líquido (1/3 da palheta). Deve-se conferir na lupa se realmente o embrião se encontra dentro da palheta após o envase, evitando a contaminação da porção aberta da mesma (FERNANDES, 2001). Com os embriões nas palhetas, estas são montadas nos aplicadores, sendo então transferidos para as respectivas receptoras. Caso se trabalhe com inovulações cirúrgicas, o embrião é aspirado para o anterior de um pequeno cone plástico, chamado de Tom Cat, utilizado para esta finalidade, acoplado a uma seringa de insulina.

36 3. FERTILIZAÇÃO "IN VITRO" O primeiro bezerro nascido de FIV, a partir de um ovócito, cuja maturação foi realizada in vitro, ocorreu em 1981 (BRACKETT et ai, 1982). A fêmea bovina tem em seus ovários ao nascimento em tomo de folículos primordiais. Ao chegar a puberdade este número diminui para a , e destes somente poucos chegam a ovulação durante a vida desta fêmea, enquanto o restante sofre atresia (CAMPBELL et. ai, 1995). A técnica de punção folicular guiado por ultra-som permite maximizar o aproveitamento destes óvulos que fisiologicamente são produzidos nos ovários de uma fêmea, levando-os a um sistema de produção in vitro de embriões (PRETERSE et ai, 1988 ; PIVATO, et ai). 3.1 Vantagens Além do aumento e da maior velocidade de produção de bezerros, e conseqüentemente no ganho genético em carne ou leite, a produção

37 de embriões in vitro, a partir de material de vacas vivas, traz outros benefícios à pesquisa e à produção, tais como: Formação de banco de ovócitos criopreservados. O ovócito congelado permitirá, no futuro, a regeneração de raças em extinção, pela fecundação in vitro de tais ovócitos e transferência dos embriões para vacas receptoras. Avaliação simultânea de diferentes acasalamentos em programas comerciais de melhoramento animal. Recuperação de material genético de vacas que apresentam problemas reprodutivos adquiridos. Produção de embriões a partir de fêmeas imaturas, diminuindo assim o intervalo entre gerações. 3.2 Coleta de Ovócitos A coleta dos ovócitos pode ser realizada pelo método de Punção Folicular ou ovários provenientes de abatedouro. (Coleta in vitro). Este método permite coletar, de forma repetida, os ovócitos por punção dos folículos visualizados na tela de um ultra-som, podendo desta maneira otimizar a produção de embriões a partir de cultivo in vitro para vacas de elevado valor genético.

38 Material necessário para punção folicular: Ultra-som; Sonda transvaginal de 5 ou 7,5 MHz; Bomba à vácuo; Sistema de agulhas (18 G e 58 cm) e cânulas; Tubo de coleta. 3.3 Recuperação Ovocitária Utilizando doadoras superovuladas O número médio de ovócitos coletados em vacas superovuladas é de 13 estruturas. Em novilhas cíclicas a média é de 9,5 ovócitos recuperados. A utilização deste protocolo facilita a implantação desta técnica em um laboratório, visto que a recuperação ovocitária é maior e a visualização dos folículos para a punção é facilitado, quando comparado com doadoras não superovuladas. Entretanto, a produção final de blastocistos, ao longo de um ano, é significativamente menor.

39 3.4 Utilizando doadoras não superovuladas O número médio de ovócitos coletados em vacas e novilhas possui uma variação simples ou até dupla (desvio de 4,2 a 8,8 para as médias respectivas). Enfim, o número médio de ovócitos recuperados é de 6 (seis) estruturas por sessão de punção, podendo esta ser repetida a cada três dias, sem causar danos maiores ao ovário. Embora este protocolo necessite de uma dedicação maior (número de sessões), o número de produtos nascidos de uma doadora ao ano é também, significativamente, maior. 3.5 Coleta in vitro Os ovócitos podem ser coletados de ovários de abatedouro. Após o abate das fêmeas, os ovários são coletados e transportados ao laboratório, em solução PBS e são puncionados os folículos que medem entre 2-8 mm. de diâmetro Método in vitro

40 A maturação do ovócito é realizada em meio TCM 199, adicionado de Soro Fetal Bovino e de gonadotrofinas. Após 24 a 26 horas de cultivo, os ovócitos são fecundados com o sêmen de touro escolhido. A escolha do touro é baseada em critérios genéticos, mas igualmente sobre sua habilidade fecundante in vitro. A fecundação in vitro é realizada na presença de heparina, durante 18 horas, no meio TALP (Tyrode Albumina Lactato Piruvato). Os zigotos são em seguida cultivados in vitro, até a obtenção de embriões transferíveis. 3.6 Maturação do Ovócito A maturação envolve mudanças nucleares e citoplasmáticas no ovócito. O ovócito imaturo (ovócito primário) se encontra parado no estágio de prófase da primeira divisão meiótica.