UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

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1 UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS LILIANE VERAS LEITE DOSE INSEMINANTE, EMBRIOGÊNESE E CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN DE TAMBAQUI (Colossoma macropomum) FORTALEZA - CEARÁ 2011

2 LILIANE VERAS LEITE DOSE INSEMINANTE, EMBRIOGÊNESE E CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN DE TAMBAQUI (Colossoma macropomum) Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Veterinárias. Área de concentração: Reprodução e Sanidade Animal. Linha de Pesquisa: Reprodução e Sanidade de Carnívoros, Onívoro e Aves. Orientador: Prof. Dr. José Ferreira Nunes FORTALEZA - CEARÁ 2011

3 Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Estadual do Ceará Biblioteca Central Prof. Antônio Martins Filho L533d Leite, Liliane Veras Dose inseminante, embriogênese e criopreservação de sêmen de tambaqui (Colossoma Macropomum) / Liliane Veras Leite f. : il. color., enc. ; 30 cm. Dissertação (Mestrado) Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Medicina Veterinária, Curso de Mestrado Acadêmico em Ciências Veterinárias, Fortaleza, Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal. Orientação: Prof. Dr. José Ferreira Nunes. Co-orientação: Profª. Drª. Carminda Sandra Brito Salmito Vanderley. 1. Peixe. 2. Fertilização. 3. Congelação seminal. 4. ACP CASA. I. Título. CDD:

4 AGRADECIMENTOS Quero agradecer primeiramente a Deus, pois Ele foi o meu verdadeiro orientador, não só do mestrado, mas de toda minha vida. Por conceder a benção de poder concluir mais esta etapa, dando-me sabedoria nas escolhas e força para continuar. Por isso, eu dedico á Ele todos os elogios e aplausos. À minha família, por acreditar e investir em mim, dando amor, a base de tudo, e educação. Mãe, Valdeliz C. Veras Leite, por seu cuidado e dedicação. Pai, Antônio Carlos P. Leite, pelas suas palavras de ensinamento, segurança e certeza de que nunca estou sozinha. Minhas irmãs, Aline, Vivian e Quezia Veras Leite, pelo carinho e apoio. Ao Júlio Cesar de Castro Júnior, pelo amor, carinho e paciência durante as fases mais decisivas da minha vida. Amo minha família! Ao meu orientador, Dr. José Ferreira Nunes, por ter confiado em mim e pelo apoio. À minha co-orientadora, Dr. Carminda Sandra B. Salmito-Vanderley, pela orientação em cada etapa e amizade. Às minhas amigas, Fátima de Cássia E. de Oliveira e Mônica Aline P. Melo pela colaboração em tudo, companhia de todos os dias, conselhos, preocupações e alegrias dividas. Em especial à querida Cássia, pois não sei como eu teria conseguido sem ela. Aos queridos alunos de iniciação científica, Júlia Trugílio Lopes; João Paulo S. Pinheiro; Jordana Sampaio Leite; Larissa Teixeira Nunes, e mais recentemente, Mayara Setúbal Oliveira; Maria Eduarda M. de Souza e Rômulo Roberto, que se dedicaram em auxiliar cada etapa deste trabalho. Não posso esquecer do José Gonzaga da S. Júnior e do Felipe S. Maciel que participaram do início do projeto. À Dra. Cristiane Clemente de M. Salgueiro e à doutoranda Maria Audália M. de Carvalho pelo apoio e ensinamentos. Ao Dr. Marcelo José Ascensão Feitosa Vieira e José Agenor Galvão pelos indispensáveis ensinamentos na parte prática. Aos funcionários e professores do Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV), à Universidade Estadual do Ceará (UECE) e ao Departamento Nacional de Obras Contra as Secas (DNOCS), por terem disponibilizado as condições técnica e pessoal. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo apoio financeiro. Enfim, essa vitória não é apenas minha, e sim de todos aqueles que participaram da sua conquista. Muito obrigada a todos.

5 RESUMO O Colossoma macropomum (tambaqui), por suas características produtivas e organolépticas, está sofrendo os efeitos da sobrepesca, o que suscita o conhecimento de sua biologia reprodutiva assim como o desenvolvimento e aprimoramento de biotecnologias visando a otimização da reprodução desta espécie. Os objetivos deste trabalho foram determinar a dose inseminante e acompanhar o desenvolvimento embrionário de tambaqui, bem como realizar a criopreservação do sêmen em diferentes tratamentos e avaliar in vitro e in vivo a qualidade seminal pós-descongelamento. Para isso o trabalho foi dividido em dois experimentos: (1) Determinação da dose inseminante e acompanhamento do desenvolvimento embrionário de C. macropomum; (2) Criopreservação do sêmen de C. macropomum em diferentes diluidores e avaliação da qualidade seminal pós descongelamento in vitro (através do CASA) e in vivo (capacidade fertilizante). Em ambos os experimentos foram utilizados reprodutores do plantel do Departamento Nacional de Obras Contra as Secas (DNOCS) induzidos hormonalmente com extrato pituitário de carpa. Para o experimento 1 foi feito um pool com sêmen de cinco machos e um pool de ova de duas fêmeas para a fertilização artificial com diferentes proporções de espermatozóides/ovócito (D ; D ; D ; D ; D espermatozóides/ovócito). O desenvolvimento embrionário foi acompanhado através de observações periódicas em estereoscópio até a eclosão dos ovos. Quando os embriões alcançaram a fase de fechamento do blastóporo foi calculada a taxa de fertilização nas diferentes doses inseminantes. Foi estimada uma equação de regressão para determinar a proporção ideal dos gametas. Para o experimento 2, foram formados seis pools de sêmen que foram diluídos em diferentes diluidores gerados da combinação de três diluentes (Água de coco em pó-acp ; Ringer e Glicose) e dois crioprotetores (dimetilsulfóxido-dmso e metilglicol). Após a diluição o sêmen foi envasado em palhetas de 0,5 ml, mantidas a 4 C por 5 minutos, congelados em vapor de nitrogênio líquido (Dry shiper) por 5 minutos, e mergulhados em nitrogênio líquido (-197 C). Após o descongelamento o sêmen foi avaliado quanto a cinética (através do Computer Assisted Sperm Analyzer-CASA). Os três melhores tratamentos foram avaliados quanto à morfometria no CASA, e capacidade fertilizante. Os resultados do experimento 1 mostraram que a percentagem de fertilização aumentou de forma linear segundo a equação Ŷ =0, , X (R 2 =97,5) atingindo um platô em 84% na proporção de espermatozóides/ovócito, sendo portanto, esta dose recomendada para a fertilização artificial de tambaqui. Os embriões apresentaram segmentação meroblástica discoidal, típica de ovos telolécitos, com eclosão dos ovos ocorrendo 357 horas-grau após a

6 fertilização. No experimento 2 os melhores resultados de taxa de motilidade foram observados quando o sêmen foi diluído com DMSO associado ao ACP (39%) ou à Glicose (44%), sendo estas ainda inferiores à motilidade do sêmen fresco (98%) (P<0.05). As velocidades (VCL, VAP e VSL) dos espermatozóides não diferiram entre os tratamentos (P>0.05). A cabeça dos espermatozóides do sêmen descongelado apresentaram-se maiores às do sêmen fresco (P<0.05) independente do diluente utilizado. O ACP e a glicose apresentaram taxas de fertilização acima de 50%, sendo portanto recomentados para a criopreservação de sêmen de C. macropomum. Palavras-chave: 1.Peixe. 2.Fertilização. 3.Congelação seminal. 4.ACP CASA

7 ABSTRACT The Colossoma macropomum (tambaqui), for their productive characteristics and organoleptic, is suffering the effects of overfishing, which raises the knowledge of their biology and the development and improvement of biotechnology in order to optimize the reproduction of this species. Our objectives were to determine the insemination dose and monitor the embryonic development of tambaqui, as well as perform cryopreservation of semen in different treatments and assess in vitro and in vivo post-thaw semen quality. For this, the work was divided into two experiments: (1) Determination of the insemination dose and monitoring the embryonic development of C. macropomum, (2) Cryopreservation of semen of C. macropomum in different thinners and evaluation of semen quality after thawing in vitro (by CASA) and in vivo (fertilization). In both experiments were used players in the squad from the National Department of Works Against Drought (DNOCS) hormonally induced with carp pituitary extract. For the first experiment was done with a pool semen from five males and one pool of two females ova for artificial fertilization with different proportions of spermatozoa/oocyte (D ; D ; D ; D ; D spermatozoa/oocyte). Embryonic development was monitored through periodic observations in stereoscopic until hatching. When embryos reached the stage of blastopore closure was calculated fertilization rate in the different insemination doses. We estimated a regression equation to determine the ideal proportion of the gametes. For the second experiment, six were formed pools of semen were diluted in different extenders generated from the combination of three solvents (water, coconut powder-acp TM, Ringer and glucose) and two cryoprotectants (dimethyl sulfoxide, DMSO and metilglicol). After dilution the semen was stored in straws of 0.5 ml, kept at 4 C for 5 minutes, frozen in liquid nitrogen vapor (Dry ship) for 5 minutes, and immersed in liquid nitrogen (-197 C). After thawing the semen was evaluated for the kinetics (via the Computer Assisted Sperm Analyzer-CASA). The three best treatments were evaluated for morphometry in CASA, and fertilizing capacity. The results of experiment 1 showed that the percentage of fertilization increased linearly according to the equation Y = X (R 2 = 97.5) reaching a plateau at 84% the proportion of 102,486 sperm / oocyte, and this recommended dose IVF for tambaqui. The embryos showed segmentation meroblastic discoidal typical telolécitos eggs with hatch occurring to 357 hours-degree after fertilization. In experiment 2 the best results in motility rate were observed when semen was diluted with DMSO associated with ACP TM (39%) or glucose (44%), and these are still inferior to fresh semen (98%) (P <0.05 ). The speed of the

8 sperm did not differ between treatments (P> 0.05). The head of the thawed sperm were higher to those of fresh semen (P <0.05) independent of the diluent. The ACP TM and glucose showed fertilization rates above 50%, therefore encouraged method for cryopreservation of semen from C. macropomum. Keywords: 1.Fish. 2.Fertilization. 3.Freezing semen. 4.ACP CASA

9 LISTA DE FIGURAS Figura1 Tambaqui (Colossoma macropomum) Figura 2 Figura 3 Figura 4 Ovos de C. macropomum em estágio inicial de dois blastômeros (A), estágio mais avançado (B) destacando as principais estruturas, e ovo inviável (C) (estereomicroscópio, 40X) Imagem do monitor do sistema CASA durante análise da motilidade destacando a porcentagem de espermatozóides estáticos (amarelo), com velocidade rápida (vermelho), média (verde) ou lenta (azul) do sêmen de C. macropomum pós-descongelamento Representação das velocidades medidas pelo sistema CASA. VCL= velocidade curvilinear; VSL= velocidade em linha reta; VAP = velocidade média Capítulo 1 Figura 1-17 Fases do desenvolvimento embrionário de C. macropomum. (1) diferenciação do citoplasma; (2) um blastômero; (3) dois blastômeros; (4) quatro blastômeros; (5 e 6) oito blastômeros; (7) 16 a 32 blastômeros; (8) blástula; (9) gástrula inicial ; (10) 50% de epibolia; (11) 95% de epibolia; (12) fechamento do blastóporo; (13) cefalização e início da formação dos somitos; (14) formação da vesícula óptica e aumento dos somitos; (15) dorso do embrião evidenciando os somitos; (16) cauda parcialmente solta; (17) Cauda completamente solta Figura 18 Taxas de fertilização artificial de ovócitos de tambaqui (C. macropomum) fertilizados artificialmente com diferentes relações espermatozoide/ovócito. Para x , y=7,73*10-6 x + 0,050. Para x> , y=0,8420 (R 2 =97,54) Capítulo 2 Figura 1 Images of fresh semen (a) and post-thaw (b) obtained through the light microscope (1600X) and digitalized with SCA TM

10 LISTA DE TABELAS TABELA 1 Characiformes brasileiros alvos de estudo sobre criopreservação seminal Capítulo 1 TABELA 1 Taxa de fertilização (%) de ovos de tambaqui fertilizados com diferentes proporções de espermatozóides (sptz) por ovócito Capítulo 2 TABELA 1 TABELA 2 TABELA 3 Parameters referring to the shape of the sperm heads analyzed in the CASA - SCA TM Mean ±DP percentage of mobile sperm post-cryopreservation of tambaqui sperm using three extenders (ACP, Ringer s or glucose 5%) associated to two cyroprotectants (DMSO or Methylglycol) through the objective evaluation with CASA-SCA TM The morphometry of the sperm heads was evaluated by CASA- SCA TM after cryopreservation in comparison to semen before cryopreservation (fresh semen)... 54

11 LISTA DE ABREVIATURAS ACP : Água de Coco em Pó ANOVA: Análise de Variância CASA: Análise da motilidade espermática auxiliada por computador CEUA: Comitê de Ética para o Uso de Animais CPAq: Centro de Pesquisas em Aquicultura DMSO: Dimetilsulfóxido DNOCS: Departamento Nacional de Obras Contra as Secas EPC: Extrato Pituitário de Carpa MAF: Minutos após a fertilização MG: Metilglicol µl: microlitro mm: milimolar NIB: Núcleo Integrado de Biotecnologia SCA : Sperm Class Analyser SNK: Student-Newman-Keuls UECE: Universidade Estadual do Ceará

12 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO GERAL REVISÃO DE LITERATURA Espécie e Reprodução Características gerais dos gametas Fertilização artificial e dose inseminante Desenvolvimento embrionário Importância da criopreservação de sêmen Diluidores e crioprotetores para criopreservação de sêmen Utilização do CASA para avaliar a qualidade do sêmen pós-descongelamento Capacidade fertilizando do sêmen pós-descongemanto JUSTIFICATIVA HIPÓTESES CIENTÍFICAS OBJETIVOS Objetivo Geral Objetivos específicos CAPÍTULO CAPÍTULO CONCLUSÕES PERSPECTIVAS REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS GERAL... 63

13 11 1. INTRODUÇÃO GERAL O tambaqui (Colossoma macropomum) é um peixe migrador pertencente á ordem Characiformes, composta por espécies oriundas da bacia Amazônica e do rio Orinoco. Entre as espécies nativas brasileiras de água doce, o tambaqui representa a maior produção na aquicultura brasileira, superado somente pelas espécies exóticas tilápia (Oreochromis niloticus) e carpa (Cyprinus carpio) (IBAMA, 2007). Diante da importância econômica e ecológica, o tambaqui foi selecionado como uma das espécies aquáticas de maior interesse para pesquisa no Brasil. Apesar da fertilização artificial do tambaqui ser uma técnica já bem dominada (Kubtza, 2004), outros estudos estão sendo realizados visando a aplicação de novas tecnologias na reprodução desta espécie, como a criopreservação de gametas (Maria et al., 2011). Porém a aplicação desta ou de outras tecnologias podem alterar a capacidade dos gametas produzirem embriões saudáveis, comprometendo assim o sucesso reprodutivo (Lanes et al., 2008). Portanto, informações básicas sobre o desenvolvimento embrionário de tambaqui são necessárias para a identificação de possíveis alterações do padrão do desenvolvimento, qualidade e viabilidade dos embriões impostas pela aplicação de novas tecnologias. Além disso, estudos sobre a embriologia são importantes para a identificação dos locais de desova em ambiente natural, a taxonomia e o conhecimento da biologia do desenvolvimento da espécie em questão (Nakatami et al., 2001). A aplicação de novas tecnologias na fertilização artificial visa a maior eficiência reprodutiva por meio da otimização do uso dos reprodutores e de seus gametas. Portanto, fertilizar o maior número de ovócitos com a menor quantidade de espermatozóides é uma alternativa para garantir a máxima fertilidade, com maior economia (Rinchard et al., 2005). Essa proporção mínima de espermatozóides por ovócito, também conhecida como dose inseminante, já foi determinada para algumas espécies da família Characidade (Shimoda et al., 2007; Sanches et al., 2009), porém para o tambaqui ainda são utilizados volumes indeterminados de sêmen na fertilização artificial. Ainda visando a otimização do uso dos reprodutores, vários estudos mostram que a criopreservação é uma boa alternativa para a melhoria da reprodução de peixes. Dentre os benefícios da utilização desta técnica destacam-se: a sincronização da disponibilidade dos gametas; facilitação do transporte; conservação da variabilidade genética; redução dos custos

14 12 de manutenção do plantel de reprodutores; a possibilidade de trocas de material genético entre laboratórios; dentre outros (Carneiro, 2007). O sucesso da criopreservação de sêmen depende de muitos fatores, como a composição do diluidor, que afeta diretamente a qualidade do sêmen pós-descongelamento (Mansour et al., 2006). Um exemplo de diluente comumente usado para Characiformes é a solução de glicose 5%, porém é uma solução simples e geralmente deve ser associada à crioprotetores externos de origem animal, como a gema de ovo, além dos crioprotetores internos (Viveiros e Godinho, 2009). Diluentes mais complexos com diferentes concentrações de íons podem fornecer maior nutrição e proteção aos espermatozóides, dispensando a necessidade de crioprotetores externos, como o Ringer modificado para peixes, que já foi testado para outras espécies de água doce (Rana, 1989). Outro diluente que vem sendo testado com sucesso é a água de coco em pó (ACP ), pois é uma solução composta de sais, proteínas, açúcares, vitaminas, gorduras neutras, antioxidantes além de indutores da divisão celular e eletrólitos diversos (Laguna et al., 1997). Portanto, este diluente fornece os nutrientes necessários para a conservação de células espermáticas Vale salientar que a ACP adaptado para sêmen de peixes (ACP-104) já foi testado em varias espécies Characiformes (Godinho e Viveiros, 2011). Em relação aos crioprotetores internos, o dimetilsulfóxido (DMSO) é o composto mais utilizado para sêmen de peixe. Nos últimos anos o metilglicol também tem se destacado como crioprotetor para algumas espécies deste grupo (Godinho e Viveiros, 2011). Em tambaqui o ACP associado à crioprotetores internos já foi testado obtendo bons resultados de motilidade espermática pós-descongelamento (Vieira, 2010), porém não foram realizados testes de fertilização para garantir a eficiência do método de criopreservação estudado. Diante disso, este trabalho teve como objetivos determinar a dose inseminante e descrever o padrão de desenvolvimento embrionário de C. macropomum, além de avaliar a qualidade do sêmen após criopreservação em diferentes tratamentos utilizando o ACP como diluente seminal.

15 13 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Espécie e Reprodução O tambaqui Colossoma macropomum, (Cuvier, 1818), pertence à ordem dos Characiformes e à família Characidae, é um peixe originário da bacia amazônica, nativo dos rios Solimões, Madeira, Orenoco e seus afluentes, ocorrendo no Brasil, Venezuela, Colômbia, Peru e Bolívia. Na natureza, há registros de que esse peixe atinge peso médio de 30 kg, sendo considerado o segundo maior peixe de escamas da bacia Amazônica, perdendo em porte somente para o pirarucu (Arapaima gigas) (Kubtza, 2004). A introdução do tambaqui no Nordeste do Brasil foi realizada pelo Departamento Nacional de Obras Contra as Secas (DNOCS) em 1972, quando 74 alevinos oriundos de Iquitos (Peru) foram introduzidos nos viveiros do Centro de Pesquisas Ictiológicas (DIPIS/P) do DNOCS, localizado em Pentecoste, Ceará, Brasil (Albuquerque et al., 1994). Entre as espécies nativas de água doce, o tambaqui representa atualmente a maior produção na aquicultura brasileira, superado somente pelas espécies exóticas tilápia (Oreochromis niloticus) e carpa (Cyprinus carpio) (IBAMA, 2007), isso devido às suas excelentes características, como rusticidade ao manejo, rápido crescimento, além do forte apelo esportivo e culinário (Kubtza, 2004). Diante da importância econômica e ecológica, o tambaqui foi selecionado como uma das espécies aquáticas de maior interesse para pesquisa no Brasil (Queiroz et al., 2002). A desova do tambaqui é anual e total, e, na natureza, ocorre de outubro a março, correspondente á época das enchentes dos rios, onde irão migrar do habitat de alimentação para o habitat reprodutivo (piracema), caracterizando-o como um peixe reofílico (Vieira et al., 1999). Essa migração é necessária, pois a maturação gonadal desta espécie é controlada por fatores externos ambientais (temperatura, horas de luz e pluviosidade) e sociais (presença do sexo oposto); e fatores internos (hormonais). Os estímulos ambientais e/ou sociais são captados pelos receptores sensoriais que encaminham essas informações via cerebral, ativando as glândulas endócrinas que agem, principalmente, nas gônadas, estimulando a produção de hormônios esteroides. Se tais estímulos não acontecem, há um bloqueio da ovulação nas fêmeas e uma baixa produção de sêmen nos machos (Honji et al., 2009). Portanto, em cativeiro, os peixes reofílicos não reproduzem naturalmente, sendo necessária a indução hormonal da reprodução (Zaniboni-Filho e Weingartner, 2007). Técnicas de indução da reprodução de peixes por meio da aplicação hormonal já vêm sendo estudadas há algumas décadas (Woynarovich e Horváth, 1983; Zohar, 1988; Harvey e

16 14 Carosfeld, 1993; Behr et al., 2000; Valdebenito, 2008). Atualmente um dos principais agentes indutores da maturação final e desova, aplicados em reprodução artificial de espécies nativas brasileiras, é o extrato bruto de pituitária de carpa (EPC) (Zaniboni-Filho e Weingartner, 2007). No Brasil, o procedimento mais usual utiliza hipófises de carpa desidratadas, diluídas em soro fisiológico e aplicadas na base da nadadeira peitoral de cada reprodutor, numa dosagem de 5 a 6 mg de EPC por quilo nas fêmeas, e de 2 e 3 mg de EPC/kg nos machos (Harvey e Carolsfeld, 1993). O tratamento com EPC é muito eficiente para tambaqui (Maria et al., 2010b), inclusive permitindo a desova mais de uma vez num único período reprodutivo, quando mantidos em condições especiais de nutrição e qualidade de água em tanques de piscicultura (Pinheiro e Silva, 1988). Figura 1 Tambaqui (Colossoma macropomum) 2.2 Características gerais dos gametas Os peixes telolécitos produzem grande quantidade de gametas, e as características dessas células estão relacionadas ao tipo de estratégia reprodutiva, na qual os gametas são liberados no meio aquático onde são fertilizados (fecundação externa), e os embriões se desenvolvem (Coward et al., 2002). Os espermatozóides de peixes teleósteos de água doce são quiescentes na osmolaridade do plasma seminal (condição isotônica de aproximadamente 300mOsmol/kg), começam a se mover quando suspensos em solução hipotônica (<300 mosml/kg) e exibem alta mobilidade em água doce (~4 mosml/kg). Outra peculiaridade dos espermatozóides de tambaqui, assim como para a maioria dos peixes, é o fato de não possuírem acrossoma (Maria et al., 2010a), pois não precisam desta estrutura para a fecundação porque, ao serem liberados no meio, entram diretamente no ovócito através de um orifício chamado micrópila. Os ovócitos de tambaqui são ricos em reserva nutritiva (vitelo) necessária para o desenvolvimento do embrião e da larva que se acumula no polo vegetal, permanecendo uma

17 15 pequena parcela do ovo com citoplasma e organelas no polo animal (citoplasma ativo), caracterizando um ovo do tipo telolécito. São envoltos por uma cápsula conhecida como córion, e possuem um orifício (micrópila) para a entrada do espermatozóide. A micrópila permanece pouco tempo aberta, se fechando em poucos minutos, ao hidratar-se no momento em que entra em contato com a água (Nakatani et al., 2001). A duração da motilidade espermática e da permanecia da abertura micropilar têm grande importância para a fertilização na natureza, pois os espermatozóides expelidos na água precisam encontrar e penetrar a micrópila antes desta fechar-se pela hidratação. 2.3 Fertilização artificial e dose inseminante As técnicas de fertilização artificial visam o melhoramento da reprodução. Em reprodução artificial de peixes, a técnica utilizada, chamada de fertilização a seco, minimiza a necessidade de uma grande motilidade por parte do espermatozóide para encontrar a micrópila, pois os gametas são inicialmente misturados, e só posteriormente é acrescentado água para ativação dos espermatozóides e hidratação dos ovócitos. Assim, a fertilização fica otimizada pela aproximação prévia dos gametas (Carneiro, 2007). Ainda visando a otimização do uso dos reprodutores na fertilização artificial, estudos têm sido realizados afim de definir a proporção entre espermatozóides e ovócitos que garanta uma máxima fertilidade e, assim, produzir mais embriões com maior economia de gametas. Em trabalhos realizados em busca da dose inseminante ideal para algumas espécies, foi observada uma tendência à estabilização da taxa de fertilização a partir de uma determinada proporção de espermatozóides por ovócito. Ou seja, foi encontrada uma proporção mínima capaz de alcançar a máxima taxa de fertilização, a qual permanece constante independentemente do aumento do número de espermatozóides. Linhart et al., (2004); Bart e Dunham (1996); Bombardelli et al., (2006) e Ciereszko et al., (2000) evidenciaram este efeito sobre a taxa de fertilização de ovócitos de Catfish europeu (Silurus glanis), Lampreia (Petromyzon marinus), jundiá (Rhamdia quelen) e Bagre do Canal (Ictalurus punctatus) alcançando a máxima fertilidade nas doses inseminantes de 8x10 2 ; 5x10 4 ; 8,9x10 4 e 1,25x10 5 espermatozóides/ovócito, respectivamente. Em estudo com piabanha (Brycon insignis), espécie da mesma família do tambaqui (Characidae), também foi evidenciado o mesmo efeito, demostrando que doses acima de espermatozóides/ovócito mantinham a taxa máxima de fertilização de 88% (Shimoda et al., 2007). Dentre estes trabalhos, as faixas de doses testadas foram variáveis, sendo a maior delas testada por Bombardelli et al., (2006) em Rhamdia quelen, que utilizou desde

18 16 doses pequenas (6x10 2 ) até doses extremas (2x10 7 ). Neste trabalho, a taxa de fertilização aumentou linearmente até alcançar o valor máximo de 87% na dose ideal (8,9x10 4 espermatozóide/ovócito) e permaneceu constante até a dose extrema, que foi mais de 200 vezes maior que a dose ideal. Em outras espécies de peixes o excesso de espermatozóides pode promover uma diminuição nas taxas de fertilização devido ao acúmulo de espermatozóides na abertura micropilar ou à competição (Kwantong e Bart, 2009). Esse efeito negativo do excesso de espermatozóides já foi relatado em estudo com Dourado (Salminus brasiliensis), espécie também pertencente á família Characidae, onde doses inseminantes superiores á ideal ( espermatozóides/ovócito) promoveram a redução das taxas de fertilização, a ponto de proporcionar resultado nulo para a dose de espermatozoides/ovócito (Sanches et al., 2009). É notório que a proporção ideal de espermatozóides por ovócito é espécie-específica, dependendo provavelmente das características individuais de cada gameta. Segundo Lahnsteiner (2000), essa proporção depende do diâmetro dos ovócitos, de forma que espécies com ovócitos maiores necessitam de mais espermatozóides para a fecundação do que espécies com ovócitos menores. Além do tamanho do gameta feminino, outro fator ligado ao gameta masculino, como o tempo de motilidade espermática, também pode influenciar na fertilização, de forma que espécies com tempo de motilidade espermática maior necessitariam de menos espermatozóides para fecundar uma determinada massa de ovócitos (Suquet et al., 1995). A necessidade de otimizar o uso do sêmen se torna mais evidente quando se trata de sêmen de alto valor, como por exemplo sêmen criopreservado de espécies em sobrepesca ou em perigo de extinção. 2.4 Desenvolvimento embrionário Após a fertilização, o ovo absorve água formando um espaço perivitelínico entre o córion e a membrana vitelínica. Esse espaço perivitelínico tem as funções de prevenir a poliespermia, proteção mecânica e regulação osmótica para o embrião além de permitir a flutuação do ovo (Laale, 1980). No caso de ovócitos telolécitos, como na maioria dos peixes teleósteos, as segmentações ocorrem apenas no disco de citoplasma ativo do polo animal, por isso a segmentação é chamada de parcial ou meroblástica discoidal, e o polo vegetal permanece indivisível durante todo o desenvolvimento embrionário formando posteriormente o saco vitelínico (Kimmel et al., 1995) (Figura 2 A e B).

19 17 O desenvolvimento embrionário de algumas espécies de teleósteos já foi descrito, e classificado em fases comuns neste grupo de peixes. Essas fases são definidas a partir do estágio de segmentações mitóticas do embrião, e são relacionadas ao número de blastômeros (2 a 32 blastômeros), ou à modificações morfológicas que caracterizam as fases de blástula (aumento da espessura do polo animal), gástrula (movimentos de epibolia e fechamento do blastópoto), organogênese (surgimento de somitos e vesícula optica) e a eclosão (quando a larva torna-se livre). Dentre os estudos de embriogênese destacam-se as pesquisas realizadas por Kimmel et al (1995) e Shardo (1995) que descreveram com riquezas de detalhes as fases do desenvolvimento embrionário de Brachidanio rerio e Alosa sapidíssima, e têm servido como base para estudos até os dias atuais. Estudos mais simplificados, mas de grande importância científica, foram realizados para as espécies Brachidanio rerio (Hisaoka e Firlit, 1960), Catostomus commersoni (Long e Ballard, 1976), Rhamdia sapo (Matkovic et al., 1985; Cussac et al., 1995), Oreochromis niloticus (Galman et al., 1989), Misgurnus anguillicaudatus (Fujimoto et al., 2004), Glossolepis incisus (Ferreira, 2006), Betta splendens (Duarte, 2009), entre outros. No caso de espécies Characiformes brasileiras, o estudo sobre desenvolvimento embrionário é mais restrito, podendo-se destacar as pesquisas com Prochilodus lineatus (Castellani et al., 1994), Piaractus mesopotamicus (Ribeiro et al., 1995), B. insignis (Andrade-Talmelli et al., 2001), Brycon orbignyanus (Ganeco, 2003; Reynalte-Tataje et al., 2004; Menin, 2010), Leporinus macrocephalus (Reynalte-Tataje et al., 2001) e Leporinus piau (Boçato et al., 2004). Nestas espécies os ovos permanecem com um aspecto transparente devido ao espaço perivitelínico preenchido de água contendo um embrião sem pigmentação no seu interior, caracterizando um ovo viável. Os ovos que apresentam-se opacos são inviáveis, também conhecidos como ovos gorados (Lopes, 2010). Assim, a diferenciação entre ovos transparentes e opacos facilita a avaliação da viabilidade dos ovos (Figura 2 C). O estudo da embriologia é importante para a identificação dos locais de desova em ambiente natural, a taxonomia e o conhecimento da biologia do desenvolvimento da espécie em questão (Nakatami et al., 2001). Segundo Maciel (2006), as pesquisas sobre o estudo do desenvolvimento embrionário de peixes tem fornecido subsídios às pesquisas de grande repercussão e inovação no meio científico, pois gera informações básicas necessárias para a identificação de possíveis alterações do padrão do desenvolvimento, qualidade e viabilidade dos embriões causadas pela aplicação de novas tecnologias, como a utilização de sêmen criopreservado.

20 18 Córion Blastômeros (Polo animal) Vitelo (Polo vegetal) Membrana plasmática Espaço perivitelínico A Somitos Vesícula óptica Córion Vitelo Saco vitelínico B Córion Conteúdo degenerado C Figura 2: Ovos de C. macropomum em estágio inicial de dois blastômeros (A), estágio mais avançado (B) destacando as principais estruturas, e ovo inviável (C) (estereomicroscópio, 40X). 2.5 Importância da criopreservação de sêmen A criopreservação do sêmen consiste na conservação a longo prazo dos gametas através do congelamento em nitrogênio líquido. O primeiro trabalho sobre congelamento de sêmen de peixe foi realizado por Blaxter (1953) com o objetivo de viabilizar o cruzamento de

21 19 dois tipos de arenque (Clupea harengus) que desovam em épocas diferentes do ano. Além deste primeiro objetivo, são muitas as razões que justificam a importância do uso de técnicas para o armazenamento de sêmen de peixes, tanto ligadas às questões ambientais quanto econômicas. A pesca em período de reprodução e construções de barragens são alguns dos fatores que estão levando ao declínio dos estoques de peixes, especialmente das espécies de piracema (migratórias). A utilização e a implantação de bancos genéticos, incluindo o congelamento de sêmen, constituem soluções potenciais para minimizar perdas decorrentes da ação do homem sobre os peixes nativos, garantindo a diversidade genética tanto para os programas de repovoamento, como para a produção comercial. Além disso, amostras de sêmen de peixes obtidos na natureza poderiam ser criopreservadas e utilizadas nos procedimentos de reprodução artificial para repovoamento. O restante poderia ser mantido em bancos genéticos para a conservação desses materiais (Shimoda, 2004). Segundo Viveiros (2005), uma série de benefícios relacionados ao desenvolvimento das técnicas de criopreservação de gametas, tais como: a) a recuperação de estoques silvestres ameaçados de extinção; b) a redução do número de reprodutores (machos) utilizados em programas de propagação artificial com conseqüente redução dos custos; c) a eliminação do problema da assincronia na maturidade gonadal entre reprodutores, principalmente das espécies migratórias quando machos e fêmeas não estão preparados simultaneamente para a reprodução; d) o estabelecimento de programas de melhoramento genético com a utilização de machos selecionados ou manipulados geneticamente (transgênicos); e) a facilidade de transporte, difusão e troca de material genético entre organizações atuantes na área, com risco reduzido de transmissão de patógenos; f) o fornecimento de materiais genéticos para a identificação de populações ou estoques por meio de técnicas de biologia molecular; e g) o estabelecimento de programa de hibridização utilizando espécies com períodos reprodutivos diferentes. Portanto, o congelamento de sêmen em nitrogênio líquido constitui uma forma de manutenção dos gametas masculinos por longos períodos. Este fato torna a criopreservação espermática, cada vez mais, uma importante técnica para a aquicultura. De fato, esta técnica vem produzindo importantes resultados na preservação, a longo prazo, do sêmen de algumas espécies de peixes Characiformes das família Prochilodontidae; Anostomidae e Characidae (Tabela 1).

22 20 Tabela 1: Characiformes brasileiros alvos de estudo sobre criopreservação seminal. Família Prochilodontidae Espécie Prochilodus lineatus Nome popular Curimba Referência Miliorini et al., 2006 Murgas et al., 2007 Viveiros et al., 2009b Viveiros et al., 2010 Anostomidae Leporinus obtusidens Piapara Taitson et al., 2008 Leporinus macrocephalus Piau-açu Ribeiro e Godinho 2003 Characidae Salminus brasiliensis Dourado Viveiros et al., 2009ª Piaractus mesopotamicus Pacu Streit Jr et al., 2006 Piaractus brachipomus Pirapitinga Nascimento, 2010 Melo, 2010b Ramirez-Merlano et al., 2011 Brycon elongatus Piapara Carvalho, 2001 Brycon orbignyanus Piracanjuba Murgas et al., 2003 Maria et al., 2006 Brycon cephalus Matrinxã Ninhaus-Silveira et al., 2006a Brycon orthotaenia Matrinxã Melo e Godinho, 2006 Brycon amazonicus Matrinxã Velasco-Santamaria et al., 2006 Brycon nattereri Pirapitinga Oliveira et al., 2007 Brycon opalinus Pirapitingado-sul Orfão et al., 2010 Brycon insignis Tiete tetra Viveiros et al., 2011 Colossoma macropomum Tambaqui Meneses et al., 2008 Vieira, 2010 Presente estudo 2.6 Diluientes e crioprotetores para criopreservação de sêmen Para o congelamento do sêmen faz-se necessária a adição de um diluidor, composto por diluente(s) e crioprotetor(es). O diluidor deve manter a viabilidade da célula e prevenir as crioinjúrias durante o congelamento e descongelamento. Portanto, condições mínimas são requeridas para que um diluente seja adequado, tais como: a) isotonicidade, para que não haja ativação prévia da motilidade espermática; b) estabilidade, pois suas características físicoquímicas não devem ser alteradas durante o contato com o sêmen; c) condutividade térmica elevada, permitindo a rápida transferência de temperatura do meio externo para os espermatozóides; d) esterilidade, ou seja, os diluidores não devem vincular microrganismos potencialmente nocivos às células espermáticas; e) servir de carreador de crioprotetores. É

23 21 importante que a motilidade dos espermatozóides não seja ativada antes do congelamento e nem durante o descongelamento, pois a mesma pode exaurir a reserva energética necessária à fertilização (Legendre e Billard, 1980). O diluente deve proporcionar, ainda, nutrientes como fontes de energia, além de aumentar o volume do sêmen. É de vital importância para a criopreservação do sêmen que a composição do diluidor seja ajustada para cada espécie em particular, pois cada grupo de animais possui especificidade e exigências diferentes (Watson, 1995). Para proteger os espermatozóides dos efeitos maléficos do congelamento, soluções crioprotetoras devem ser acrescentadas. Tais crioprotetores podem ser classificados como intracelulares (permeáveis) ou extracelulares (impermeáveis). Os crioprotetores intracelulares são indispensáveis para o sucesso da criopreservação, pois atuam desidratando e reduzindo o ponto crioscópio do interior da células dificultando a formação de cristais de gelo intracelulares que danificam a célula. Os crioprotetores extracelulares podem ser ou não adicionados ao meio de congelamento, e auxiliam na proteção celular recobrindo a superfície da célula e estabilizando a membrana (Watson, 1995). Em estudo de criopreservação de sêmen de Characiformes, o crioprotetor interno mais utilizado é o dimetilsulfóxido (DMSO), que já foi testado com sucesso para várias espécies, tais como: B. amazonicus (Cruz-Casallas et al., 2006; Ninhaus-Silveira et al., 2006b; Velasco- Santamaría et al., 2006), B. insignis (Shimoda, 2004), B. cephalus (Ninhaus-Silveira et al., 2006a), B. orbignyanus (Bedore, 1999; Melo e Godinho, 2006; Viveiros et al., 2008), P. brachypomus (Fresneda et al., 2004), P. mesopotamicus (Bedore, 1999, Carolsfeld et al., 2003, Streit Jr et al., 2006), C. macropomum (Vieira, 2010), S. brasiliensis (Viveiros et al., 2009a; Nascimento et al., 2008). Nos últimos anos o metilglicol também tem se destacado como crioprotetor para algumas espécies como P. brachypomus (Nascimento et al., 2010; Ramirez-Merlano et al., 2011), P. mesopotamicus (Orfão et al., 2008), B. opalinus (Orfão, 2010); B. insignis (Viveiros et al., 2011), B. nattereri (Oliveira et al., 2007), P. lineatus (Viveiros et al., 2009b, Viveiros et al., 2008, Viveiros et al., 2010) L. obtusidens (Koch et al., 2007 ; Viveiros et al., 2008). Poucos trabalhos avaliaram a qualidade de sêmen utilizando os crioprotetores etilenoglicol (Meneses et al., 2008) e propilenoglicol (Navarro et al., 2004). Em relação aos diluentes, o mais utilizado é a solução de glicose 5%, porém, por ser um diluente simples, geralmente é necessária a adição de crioprotetores externos, sendo comum a utilização de gema de ovo (Godinho e Viveiros 2011). Aparentemente diluentes mais complexos podem promover uma maior proteção ao espematozóide dispensando a necessidade da adição de crioprotetores externos. Uma das

24 22 inovações mais recentes da biotecnologia do sêmen de peixe é a utilização de água de coco como meio diluente seminal, pois é um meio natural e estéril composto por sais, proteínas, açúcares, vitaminas, gorduras neutras, além de indutores da divisão celular e diversos eletrólitos, podendo exercer uma ação benéfica sobre a conservação celular. Trabalhos realizados por Nunes (1987) demonstraram a viabilidade da água de coco como diluente de refrigeração e congelação do sêmen caprino, o que levou à elaboração de um meio comercial de conservação, padronizado e estabilizado, à base de água de coco em pó (ACP - ACP Biotecnologia, Brasil). A água de coco sob a forma de pó apresenta os mesmos constituintes bioquímicos da forma in natura, porém é padronizada e mais eficazmente conservada, o que facilita sua comercialização para regiões onde o fruto não existe (Silva et al., 2006). A ACP foi testado inicialmente como diluidor de sêmen de caprino (Salgueiro et al., 2002), e mais recentemente foi adaptado para a criopreservação de sêmen de peixes, recebendo a classificação de ACP-104 (específico para peixes). O ACP-104 já foi testado com sucesso em várias espécies como B. orbignyanus, P. lineatus, L. obtusidens (Viveiros et al., 2010), P. brachypomus (Velásquez-Medina, 2008) e C. macropomum (Vieira, 2010). Portanto a ACP tornou-se mais uma inovação tecnológica como alternativa mercadológica para a área de reprodução de peixes (Melo et al., 2010a). Na maioria dos trabalhos, observa-se que a combinação dos dois agentes (crioprotetores e diluentes) é bastante variável, o que torna muito difícil a tarefa de distinguir qual é o fator ideal para cada espécie, já que eles atuam de forma distinta. 2.7 Utilização do CASA para avaliar a qualidade do sêmen pós-descongelamento A taxa de espermatozóides móveis é o critério mais utilizado para avaliar a qualidade seminal após o descongelamento. Viveiros et al. (2011) relatou que a taxa de motilidade do sêmen descongelado de dourado (Salminus brasiliensis) revelava o número de espermatozóides com membranas intactas, demonstrado a intima relação da motilidade com a viabilidade espermática e com a capacidade fertilizante do sêmen de peixes. Geralmente essa avaliação é feita de forma subjetiva, na qual o avaliador deve estimar uma taxa de espermatozóides móveis numa escala de 0 a 100% (Taitson et al., 2008). Atualmente os métodos objetivos de avaliação da motilidade seminal têm sido considerados mais relevantes na pesquisa em reprodução. O Computer Assisted Sperm Analysis (CASA) é um sistema automático (hardware e software Sperm Class Analyser -SCA) utilizado para visualizar, digitalizar e analisar imagens sucessivas, fornecendo informações acuradas, precisas e significativas do movimento individual de cada célula, bem como de

25 23 subpopulações de células espermáticas (Amann e Katz, 2004). Este método tem sido amplamente utilizado para examinar a qualidade do sêmen de aves e mamíferos, sendo a sua aplicação recente em estudos nos peixes (Rurangwa et al., 2001). Com o auxílio do programa é possível avaliar objetivamente a porcentagem de espermatozóides móveis (ou taxa de motilidade), além da porcentagem de espermatozóides com velocidade rápida, média ou lenta (Figura 3). Figura 3: Imagem do monitor do sistema CASA durante análise da motilidade destacando a porcentagem de espermatozóides estáticos (amarelo), com velocidade rápida (vermelho), média (verde) ou lenta (azul) do sêmen de C. macropomum pós-descongelamento. Usando imagens digitalizadas da trajetória de cada célula espermática, o CASA pode analisar as propriedades de trajetória e velocidade dos espermatozóides, segundo Verstegen et al. (2002) (Figura 5): Velocidade curvilínea (VCL- μm/s): É a velocidade da trajetória real do espermatozóide. É sempre a maior das três velocidades e serve como elemento de cálculo para a linearidade. Velocidade linear progressiva (VSL- μm/s): É a velocidade média em função da linha reta estabelecida entre o primeiro e o último ponto da trajetória do espermatozóide. É sempre a mais baixa das três velocidades. Velocidade média da trajetória (VAP- μm/s): é a velocidade da trajetória média do espermatozóide. Em casos onde a trajetória da cabeça espermática é muito regular e linear com pouco movimento lateral da cabeça, a VAP é quase a mesma que a VSL, porém com trajetórias irregulares, não lineares ou onde existe um alto grau de movimento lateral, a VAP será maior que a VSL.

26 24 Amplitude de deslocamento lateral da cabeça (ALH - μm): é a amplitude do deslocamento médio da cabeça do espermatozóide em sua trajetória real. Freqüência de batimento flagelar cruzado (BCF- Hz): É o número de vezes que a cabeça do espermatozóide cruza a direção do movimento. A BCF pode ser subestimada se existirem mais batimentos/segundo que imagens/segundo. Retilinearidade (STR - %): É a relação percentual entre VSL e VAP. Estima a proximidade do percurso da célula a uma linha reta. Linearidade (LIN - %): Relação percentual entre VSL e VCL, ou seja, quanto mais o espermatozóide se afasta da velocidade em linha reta, menor será sua linearidade. Figura 4: Representação das velocidades medidas pelo sistema CASA/SCA. VCL= velocidade curvilinear; VSL= velocidade em linha reta; VAP = velocidade média. Alguns estudos foram realizados em peixes utilizando o programa CASA para registrar o movimento dos espermatozóides depois do processo de conservação do sêmen de algumas espécies como catfish africano (Clarias gariepinus) (Rurangwa et al., 2001) e pargo japonês (Pagrus major) (Liu et al., 2007). Outros estudos utilizaram o CASA para avaliar a motilidade do sêmen coletado post mortem e depois da anestesia (truta arco íris - Oncorhynchus mykiss) (Dietrich et al., 2005), ou para caracterizar o movimento espermático do sêmen in natutra (peixe zebra, Danio rerio) (Wilson e Ingerman, 2007). Em Characiformes, o CASA já foi utilizado para analisar a motilidade espermática pósdescongelamento de pirapitinga (P. brachypomus), piabanha (B. insignis), curimba (P. lineatus) e tambaqui (C. macropomum), (Nascimento et al., 2010; Melo, 2010b; Shimoda, 2004; Viveiros et al., 2010; Vieira, 2010).

27 25 Nesses estudos, os parâmetros mais avaliados são taxa de motilidade e velocidades (VCL, VSL e VAP), e vêm sendo relacionadas com a capacidade fertilizante do sêmen de peixes, principalmente a VCL (Viveiros et al., 2010; Rurangwa et al., 2001). O CASA também pode ser utilizado para avaliação de aspectos ligados à morfologia dos espermatozóides, mais especificamente às dimensões e formato da cabeça dos espermatozóides, o que é chamado de morfometria. A análise da morfometria espermática assistida por computador, também denominada de ASMA (Automated Sperm Morphology Analysis), foi desenvolvida inicialmente para avaliação do sêmen humano (Monserrat et al., 1995) e tem sido progressivamente adaptada a outras espécies mamíferas (Gravance et al., 1996) demonstrando níveis altos de precisão e confiança (Verstegen et al., 2002). Os parâmetros referentes ao tamanho da cabeça dos espermatozóides avaliados pelo ASMA são: comprimento C (µm, maior eixo da cabeça do espermatozóide); largura - L (µm, menor eixo da cabeça do espermatozóide); perímetro - P (µm, distância que circunda a cabeça do espermatozóide); e área - A (µm 2 ). A partir dessas informações foram calculados, pelo programa, parâmetros referentes ao formato da cabeça dos espermatozóides: elipticidade (C/L); elongação (C-L/C+L); rugosidade (4πA/P 2 ) e regularidade (πcl/4a). Em peixes, esta técnica foi utilizada para descrever mudanças na forma dos espermatozóides da enguia européia causada pela indução hormonal da espermiação (Asturiano et al., 2007) e observados efeitos da taxa de diluição, crioprotetores e suplementação do meio de criopreservação (Marco-Jiménez et al., 2006), uma vez que crioprotetores e protocolos de criopreservação são conhecidos por causar danos a morfologia dos espermatozóides (Billard, 1983). Para Characiformes apenas Melo (2010b) realizou tal técnica em sêmen fresco e após criopreservação de pirapitinga (P. brachypomus). Essa técnica permite a avaliação da morfometria de um grande número de espermatozóides de forma rápida e objetiva, sem qualquer interferência do avaliador. 2.8 Capacidade fertilizante do sêmen pós-descongelamento Embora a motilidade e, em menor frequência, a morfologia espermática tenham sido usadas como critério de qualidade do sêmen, nem sempre representam um bom indicativo da capacidade de fertilização. Portanto, o teste de fertilização constitui o método que melhor permite avaliar a qualidade seminal, sobretudo do sêmen congelado, pois avalia as condições do sêmen in vivo (Rana e MacAndrew 1989). Vale a pena ressaltar que, no caso de sêmen criopreservado, a proporção de espermatozóides por ovócito é geralmente superior à utilizada para o sêmen fresco devido a

28 26 diminuição da qualidade espermática após o descongelamento. Viveiros et al. (2009a) observaram que a proporção ideal de espermatozóides pós-descongelamento por ovócito foi 20,5 vezes superior á proporção ideal para sêmen fresco em Salminus brasiliensis (1,4x10 5 espermatozóides/ovócito para o sêmen fresco versos 28,7 x 10 5 espermatozóides/ovócito para sêmen descongelado). Maria (2005) utilizou uma proporção 10 vezes maior em relação ao sêmen fresco de Brycon orbignyanus (4,6 x 10 5 espermatozóides/ovócito para o sêmen fresco versos 46 x 10 5 espermatozóides/ovócito para o sêmen descongelado). Por outro lado, alguns pesquisadores afirmam que o excesso de espermatozóides para fertilização encobre a qualidade dos espermatozóides criopreservados, dificultando as comparações entre protocolos (Viveiros et al., 2000). No caso de sêmen descongelado com motilidade semelhante à do sêmen fresco, alguns autores utilizam a mesma proporção de espermatozóides/ovócito tanto para o sêmen fresco quanto para o descongelado (Viveiros et al., 2010). Outros fatores como a qualidade dos ovócitos, o método de fertilização artificial, o meio de ativação utilizado, entre outros, podem interferir nos resultados das taxas de fertilização, portanto estas variáveis devem ser controladas nos estudo de avaliação da capacidade fertilizante do sêmen descongelado.

29 27 3 JUSTIFICATIVA Apesar da tecnologia da reprodução artificial de peixes nativos brasileiros se encontrar relativamente desenvolvida, estudos sobre alguns aspectos relacionados à otimização do uso dos reprodutores ainda devem ser realizados, especialmente para definição da proporção mínima de espermatozóides por ovócitos, que é de suma importância para proporcionar uma máxima fertilidade e produção de embriões com maior economia de gametas, bem como para o emprego de métodos de conservação dos gametas. Além disso, estudos sobre o padrão de desenvolvimento embrionário da espécie são necessários para gerar informações básicas para a identificação de possíveis alterações do padrão do desenvolvimento, qualidade e viabilidade dos embriões causadas pela aplicação de novas tecnologias, como a utilização de sêmen criopreservado. Atualmente os métodos de criopreservação de sêmen de C. macropomum utilizam diluentes simples acrescidos de gema de ovo como crioprotetor externo, porém, diluentes mais complexos podem gerar uma maior proteção à célula espermática dispensando a necessidade de crioprotetores externos de origem animal. A água de coco em pó adaptada para peixes (ACP-104) é uma solução complexa composta por sais, proteínas, açúcares, vitaminas, gorduras neutras, além de indutores da divisão celular e diversos eletrólitos, podendo exercer uma ação benéfica sobre a conservação celular. A ACP-104 já foi testada como diluente para criopreservação seminal de C. macropomum, demonstrando resultados satisfatórios de motilidade espermática pós-descongelado (Vieira, 2010), porém ainda não foram realizados testes de fertilização para avaliar a capacidade do sêmen descongelado fertilizar ovócitos e produzir embriões saudáveis. Esses testes in vivo são necessários para garantir a eficácia do método de criopreservação estudado.