UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

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1 UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS MAYARA SETÚBAL OLIVEIRA CRIOPRESERVAÇÃO DO SÊMEN DE TAMBAQUI: DILUIDORES E MÉTODOS DE CONGELAÇÃO FORTALEZA 2015

2 1 MAYARA SETÚBAL OLIVEIRA CRIOPRESERVAÇÃO DO SÊMEN DE TAMBAQUI: DILUIDORES E MÉTODOS DE CONGELAÇÃO Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Veterinárias. Área de concentração: Reprodução e Sanidade Animal. Linha de Pesquisa: Reprodução e Sanidade de Carnívoros, Onívoro e Aves. Orientadora: Dra. Carminda Sandra Brito Salmito Vanderley FORTALEZA 2015

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5 Com gratidão e amor, dedico Aos meus pais, Rogéria Oliveira e Jucivaldo Oliveira; Ao meu irmão, Valdo Oliveira; Ao meu noivo, Távio Araújo. 4

6 5 AGRADECIMENTOS A Deus, por ter me concedido o dom da vida e por ter me dados forças para trilhar o meu caminho e me ajudado a vencer os obstáculos, não me abandonando em momento algum e me ajudando a concretizar todos os meus sonhos. À Universidade Estadual do Ceará, pelo suporte desde a graduação e durante todo o mestrado, e por ter me proporcionado momentos de enriquecimento científico e social ao lado de pessoas maravilhosas. À Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico, por ter concedido a bolsa de mestrado. À Financiadora de Estudos e Projetos FINEP, pelo apoio financeiro fornecido ao LBRP, sendo assim possível a realização de todo o experimento. À minha orientadora Profa. Dra. Carminda Sandra Brito Salmito Vanderley, por ter me orientado desde a graduação, pelos seus conselhos, orientações, incentivos e paciência. Aos professores: Dra. Monica Rodrigues Ferreira Machado e Dr. Wladimir Ronald Lobo Farias por terem aceito prontamente a participar e a contribuir com seus conhecimentos na defesa dessa dissertação. Ao Dr. Marcelo José da Ascensão Feitosa Vieira por ter aceito participar como suplente da banca de defesa dessa dissertação. Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias - PPGCV por todo apoio, incentivo, experiências e conhecimentos fornecido durante o mestrado. Aos funcionários, em especial a Adriana Maria S. Albuquerque, pela paciência e ajuda em tornar as coisas mais simples de todo o funcionamento do programa. Ao Prof. Dr. Claudio Cabral Campello, pela realização, explicação da estatística da parte experimental e por toda paciência em responder os meus questionamentos. Aos meus amigos de pós-graduação do Laboratório de Biotecnologia da Reprodução de Peixes LBRP: Liliane Veras Leite, Júlia Trugílio Lopes, Larissa Teixeira Nunes, Jordana Sampaio Leite, Francisco Renan Aragão Linhares por terem me ajudado durante o período de realização do experimento e de construção do conhecimento desde a iniciação científica e pelo companheirismo no dia a dia. Em especial, Priscila Silva de Almeida-Monteiro, que se tornou uma grande amiga e fiel companheira no mundo científico, agradeço todos os conselhos, toda ajuda e todo tempo empregado para que tudo desse certo. A minha eterna mãe científica

7 6 Mônica Aline Parente Melo Maciel, que sempre me ajudou nas pesquisas e na experimentação, fornecendo dicas, críticas e elogios. Aos ex e atuais ICs do LBRP, Thais Maia Torres, Yasmim Maia Ferreira, Maria Eduarda Magalhães de Souza, Renata Vieira do Nascimento, Karen Emanuelly, Eric Silva, Cibele Castro, Vanessa Alves, Jéssica Castelo Branco, Edna Raquel, Thaís Nery, Deborah Queiroz, e Vanessa Sayonara, pelo companheirismo e por terem tornado os trabalhos menos laboriosos. Em especial, ao Rômulo Roberto Ribeiro Pinheiro e Filipe Oliveira Ferreira, por serem tão prestativo e terem me ajudado em todas as etapas, agradeço de coração tudo que vocês fizeram por mim. Obrigada a todos que me acompanharam nos finais de semana, feriado, etc, sempre com um sorriso no rosto e dispostos a me ajudar. Aos colegas da turma de mestrado, pela troca de experiências e conhecimentos. Aos membros e funcionários do Núcleo Integrado de Biotecnologia, pelo companheirismo e apoio, em especial, a Dona Maria Iraci Clemente de Melo, pelo carinho fornecido durante todos esses anos. A Henna Roberta Quinto (Henninha), por sempre estar presente em tudo, ser nossa companheira, e estar disposta a puxar as nossas orelhas quando precisamos estudar. A minha amiga de todas as horas Camila de Lima Rocha, por todos os conselhos e por todos esses anos de amizade, agradeço por estar sempre ao meu lado me dando forças e compartilhando comigo as alegrias da vida. Agradeço a Deus por sua amizade, minha amiga irmã, sei que posso contar com você para tudo que eu precisar na vida. A minha grande amiga Fátima Aurilane de Aguiar Lima, por ser sempre uma amiga tão maravilhosa, prestativa, carinhosa e uma pessoa capaz de me fazer feliz em tantos momentos. Obrigada por ser essa amiga irmã e estar sempre do meu lado nos dias alegres e nos difíceis me ajudando a não deixar a peteca cair, sempre com as palavras certas. Aos meus pais Jucivaldo Marques Oliveira e Rogéria Maria Setúbal Oliveira, por todos os sacrifícios, por todo amor e carinho dedicados durantes todos esses anos, procurando sempre me proporcionar a melhor educação, uma boa casa, uma boa alimentação, entre tantos esforços que só visaram o meu bem. Obrigada por me ensinarem o valor do respeito mútuo e do amorpróprio, por ter ajudado a moldar meu caráter, a ser uma pessoa humilde, simples e por me mostrarem como é importante ajudar ao próximo. Por respeitarem e apoiarem minhas escolhas e por todos os seus esforços e renúncias que me permitiram chegar até aqui.

8 7 Ao meu irmão Valdo Setúbal Oliveira, com quem aprendi a conviver com as diferenças, com inúmeras brigas sem sentido e a exercitar minha paciência, pelos momentos de descontração e alegrias vividas dentro de casa. Por ter nos presenteado com a nossa preciosa princesa Valentina Vicente Setúbal, nosso bem mais precioso. À minha tia Tatiana Setúbal e minha prima Letícia Setúbal, por me ajudar em momentos necessário e por todos os conselhos. Ao meu noivo, Távio Vieira Araújo, o meu grande companheiro e uma das melhores surpresas da minha vida, por todo o carinho, apoio, atenção e paciência dedicados a mim. Obrigada por sempre aguentar as minhas chatices e meus momentos de desespero. Obrigada por fazer cada dia valer a pena e por sempre me fazer rir em momentos mais improváveis. Por estar presente em todos os aspectos da minha vida, me incentivando, me confortando e fazendo de mim uma pessoa mais completa. Aos demais membros das famílias Setúbal e Oliveira, por todo o carinho e apoio até aqui.

9 8 RESUMO O tambaqui (Colossoma macropomum, Curvier 1818) é uma espécie nativa que representa a maior produção na aquicultura brasileira, despertando assim o interesse nos pesquisadores para criopreservação do sêmen dessa espécie. Porém para o emprego desta biotecnologia, é necessário que haja diluidores e equipamentos adequados no congelamento seminal. O presente trabalho teve por objetivo avaliar a eficiência de diferentes diluidores e métodos de congelação na criopreservação do sêmen de C. macropomum. Machos de tambaqui foram induzidos hormonalmente a espermiação. Após 14h da indução, foi realizada a coleta de sêmen e a análise da motilidade do sêmen, em seguida realizada a criopreservação. O sêmen de cada animal foi diluído em quatro diferentes tratamentos (Glicose + Dimetilsulfóxido -DMSO, Glicose + Metil glicol- MG, Beltsville Thawing Solution- BTS + DMSO e BTS + MG), envasados em palhetas de 0,25 ml e submetidos a dois diferentes equipamentos de congelação: máquina de congelação programada e Dry shipper. Após 10 dias, as amostras seminais foram descongeladas (45 ºC/ 8s) e avaliadas quanto à cinética, vitalidade e a morfologia espermáticas com auxílio do software SCA. O sêmen criopreservado com DMSO utilizando a máquina de congelação programada proporcionou maiores percentuais de espermatozoides móveis (15,44±1,04%) após a descongelação em relação ao Dry shipper (3,99±0,55%), independente do diluente utilizado. Além disso, DMSO proporcionou as melhores velocidades espermáticas em relação ao MG, independente do método de congelação e diluente empregado. Um maior percentual de espermatozoides vivos foi observado quando se utilizou Glicose (37,28±1,32%) como diluente, e DMSO (37,98±1,25%) em máquina de congelação programada. Para a morfologia espermática, uma maior quantidade de espermatozoides normais (46,10±1,82%) foi observada quando o sêmen foi criopreservado usando a máquina de congelação programada com o DMSO, para os crioprotetores, Glicose e BTS (38,16±1,9%; 39,26±1,87%, respectivamente), para os diluentes. Conclui-se que pode ser utilizado o crioprotetor DMSO 10% associado ao diluente Glicose 5% em Máquina de Congelação Programada, para a criopreservação do sêmen de C. macropomum. Palavras-chave: Peixes. Reprodução. Colossoma macropomum. Congelação celular. Métodos de conservação.

10 9 ABSTRACT The tambaqui (Colossoma macropomum, Curvier 1818) is a native species, and is the largest production in Brazilian aquaculture, arousing interest among researchers for cryopreservation of semen that species. But for the use of this biotechnology, is necessary to have extenders and appropriate equipment in the seminal freezing. Thus, this study aimed to evaluate the efficiency of different diluents and freezing methods in the sperm cryopreservation C. macropomum on the kinetics, sperm morphology and vitality. Tambaqui males were hormonally induced to spermiation. After 14 h of induction, the semen collection and the analysis of motility of the semen was performed then held cryopreservation. The semen samples from each animal were diluted in four different treatments (Glucose + DMSO -dimethyl sulfoxide, Glucose + MG - methyl glycol, Beltsville Thawing Solution- BTS + DMSO and BTS + MG) and packaged into 0.25 ml straws. Two different types of freezing equipment were used: a programmed freezing machine and a dry shipper. After 10 days, the semen samples were thawed (45 C / 8 s) and evaluated with regard to kinetics and sperm morphology with the aid of the Sperm Class Analyzer software. Semen cryopreservation with DMSO using the programmed freezing machine provided greater percentage of motile sperm (15.44 ± 1.04%) after thawing compared to Dry shipper (3.99 ± 0.55%), regardless of diluent. Additionally, DMSO showed better sperm velocity than MG, regardless of the freezing method and extender employed. A higher percentage of living spermatozoa was observed when glucose was used (37.28 ± 1.32%) (regardless of the freezing method and cryoprotectant), and DMSO (37.98 ± 1.25%) in programmed freezing machine. For morphology, a greater amount of normal spermatozoa (46.10 ± 1.82%) was observed when semen was cryopreserved using a freezing machine programmed with DMSO, as cryoprotectant and Glucose or BTS (± %, ± 1.87%, respectively), as extenders. Therefore, we suggest the use of the cryoprotectant DMSO 10% associated with the extender Glucose 5% in programmed freezing machine, for cryopreservation of C. macropomum semen. Keywords: Fish. Reproduction. Colossoma macropomum. Cell freezing. Methods of conservation.

11 10 LISTA DE FIGURAS Figura 1 Colossoma macropomum Capítulo 01 Figura 1 Média ± erro padrão da taxa de motilidade do sêmen pós-descongelação de tambaqui utilizando diferentes crioprotetores e métodos de congelação. Letras maiúsculas representam diferença entre equipamentos utilizando o mesmo crioprotetor. Letras minúsculas representam diferença entre os crioprotetores usando o mesmo método de congelação (P<0,05) Figura 2 - Média ± erro-padrão dos parâmetros cinéticos (Velocidade Curvilinear VCL; Velocidade em Linha Reta VSL; e Velocidade Média do Percurso VAP). Letras minúsculas distintas representam diferenças significativas entre crioprotetores, dentro de um mesmo parâmetro (P<0,05) Figura 3 - Média ± erro padrão da porcentagem de espermatozoides com a membrana intacta (Vitalidade) pós-descongelação do sêmen de Colossoma macropomum: A) Taxa de vitalidade do sêmen criopreservado utilizando os diluentes Glicose e BTS em função do efeito significativo do diluente; B) Taxa de vitalidade do sêmen criopreservado utilizandose os crioprotetores DMSO e MG em função da interação tratamento versos método de congelação. Letras maiúsculas representam diferença entre equipamentos utilizando o mesmo crioprotetor. Letras minúsculas representam diferença entre os diluentes e os crioprotetores usando o mesmo método de congelação. (P<0,05) Figura 4 - Média ± erro padrão da porcentagem de espermatozoides com cauda dobrada pós-descongelação do sêmen de Colossoma macropomum: A) Percentual de cauda dobrada do sêmen criopreservado utilizando os diluentes Glicose e BTS em função do efeito significativo do diluente; B) Percentual de cauda dobrada do sêmen criopreservado utilizando-se os equipamentos Dry shipper e máquina de congelação programa em função da interação com o método de congelação. Letras minúsculas representam diferença entre colunas dentro do mesmo parâmetro. (P<0,05)... 44

12 11 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Média ± desvio-padrão do peso e dos parâmetros do sêmen in natura de C. macropomum (n=30) Tabela 2 - Média ± erro padrão do percentual de espermatozoides morfologicamente normais avaliados no sêmen pós-descongelação de C. macropomum em função da interação entre crioprotetor método de congelação; e diluente método de congelação

13 12 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ANOVA Análise de Variâncias BTS Beltsville Thawing Solution CASA Computer Assisted Sperm Analyses (Análise do Sêmen Assitida por Computador) CCSE Solução a base de sais e açucares (0,3427g de NaCl e 3,4314g de sacarose) CEUA Comitê de Ética para o Uso de Animais CEBIAQUA - Centro de Biotecnologia Aplicada à Aquicultura DMSO Dimetilsulfóxido DNOCS Departamento Nacional de Obras contra as Secas DS Dry Shipper EDTA Ethlenediamine Tetraacetic Acid EHC Extrato Hipofisário de Carpa FSH Hormônio Folículo Estimulante LBRP Laboratório de Biotecnologia da Reprodução de Peixes LIN Linearidade MCP Máquina de Congelação Programada MG Metil glicol MPA - Ministério da Pesca e Aquicultura ph Potencial Hidrogeniônico SAS - Statistical Analysis System SCA Sperm Class Analyser SNK Student Newman Keus UECE Universidade Estadual do Ceará UFC Universidade Federal do Ceará VAP Velocidade média do percurso VCL Velocidade Curvilinear VSL Velocidade Progressiva Linear

14 13 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA ESPÉCIE TAXONOMIA (FISHBASE, 2014) CARACTERÍSTICAS DO SÊMEN DE TELEÓSTEOS DE ÁGUA DOCE CRIOPRESERVAÇÃO SEMINAL Soluções diluidoras Métodos de congelação empregados para sêmen de peixes AVALIAÇÃO DA MOTILIDADE E CINÉTICA ESPERMÁTICA ANÁLISE DA MORFOLOGIA E VITALIDADE ESPERMÁTICA JUSTIFICATIVA HIPÓTESES CIENTÍFICAS OBJETIVO GERAL OBJETIVOS ESPECÍFICOS CAPÍTULO CONCLUSÕES PERPESCTIVAS REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 47

15 14 1 INTRODUÇÃO O tambaqui (Colossoma macropomum, Curvier 1818) é uma espécie brasileira de peixe migratório pertencente à família Characidae, ordem Characiformes. Seu cultivo vem crescendo rapidamente, principalmente na região Norte do Brasil, em função da sua rusticidade. Os Characiformes apresentam importância comercial como espécies ornamentais, na pesca comercial ou esportiva e na aquicultura (GODINHO; VIVEIROS, 2011). Dentre os grupos de espécies cultivadas no Brasil, esta ordem apresenta destaque, pela textura e sabor de sua carne e ao bom rendimento de sua carcaça (VAL; ALMEIDA-VAL, 1995; BALDISSEROTTO; GOMES, 2005). O C. macropomum é a espécie nativa brasileira mais produzida comercialmente (MPA, 2011). Diante da importância econômica e ecológica, foi selecionada como uma das espécies aquáticas de maior interesse para pesquisa no Brasil (QUEIROZ et al., 2002). Diante dessa informação, surge o interesse nos pesquisadores em estudar a reprodução dessa espécie. Assim, a criopreservação seminal, reforçando simultaneamente a difusão e melhoria da genética de populações de peixes, é uma das áreas em ascensão para reprodução assistida, tanto para a produção em aquicultura como para preservação de material genético em programas de conservação (CAROLSFELD et al., 2003). Além disso, vários estudos mostram que a criopreservação é uma boa alternativa para a melhoria da reprodução de peixes, já que a técnica tem sido utilizada para auxiliar na manutenção da variabilidade genética, quando esta torna-se tão reduzida que as espécies se tornam incapazes de responder às condicionantes ambientais (RESENDE; MARQUES, 2009). Permite também a otimização do transporte de sêmen, bem como seu armazenamento em bancos de germoplasma, garantindo o intercâmbio entre as diversas instituições de pesquisa e pisciculturas. (CARNEIRO et al., 2006). Muitos estudos estabeleceram protocolos para criopreservação de sêmen para peixes Characiformes (GODINHO; VIVEIROS, 2011). Porém estes variam de acordo com a espécie, mas, independente disso, observa-se que a composição do diluidor e o método de congelação empregados são fatores determinantes no sucesso da criopreservação (SANSONE et al., 2002; DEGRAAF; BERLINSKY, 2004). Na literatura, observa-se que os métodos de congelação mais utilizados para sêmen de peixes nativos brasileiros são o Dry shipper e a caixa térmica de poliestireno (VIVEIROS;

16 15 GODINHO, 2009). Outro método que vem sendo empregad é o uso da máquina de congelação programada, no qual alguns estudos em que utilizaram este método na criopreservação de sêmen, obtiveram boas taxas de motilidade com as espécies Cyprinus carpio (IRAWAN; VUTHIPHANDCHAI; NIMRAT, 2010; SULTANA et al, 2010), Prochilodus magdalenae (MARTÍNEZ; TARAZONA-MORALES; PARDO-CARRASCO, 2013). O uso deste equipamento visa padronizar os protocolos de congelação, diminuindo a quantidade de variáveis que interfiram no sucesso da técnica de criopreservação, já que permite uma queda gradual, controlada e homogênea da temperatura. Diante do exposto, este trabalho objetiva avaliar a eficiência de diferentes diluidores e equipamentos de congelação na criopreservação do sêmen tambaqui (C. macropomum) quanto aos parâmetros: motilidade total, velocidades e morfologia espermáticas.

17 16 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 ESPÉCIE O tambaqui, C. macropomum, é um peixe de piracema nativo das bacias do rio Amazonas e seus afluentes, atingindo comprimentos de até 1,0 m e peso além de 30 kg (GOULDING, 1988), sendo considerado o segundo maior peixe de escamas da bacia amazônica, perdendo em porte apenas para o pirarucu (Arapaima gigas) (KUBITIZA, 2004). Figura 1 Colossoma macropomum Fonte: Google imagens Esta espécie foi introduzida no Nordeste do Brasil pelo Departamento Nacional de Obras contra as Secas (DNOCS) em 1972 (ALBUQUERQUE; BEZERRA; KOVÁKS, 1994). Em relação à aquicultura, C. macropomum é a espécie nativa brasileira mais produzida comercialmente e segundo o Boletim Estatístico da Pesca e Aquicultura do Ministério da Pesca e Aquicultura (MPA, 2011), a produção se elevou, de toneladas em 2007, para mais de toneladas em Devido a estes fatores, a Embrapa iniciou, em 2008, o programa de melhoramento genético de espécies aquáticas no Projeto Aquabrasil, que escolheu o tambaqui como uma das espécies a estudar, por representar grande potencial de desenvolvimento e apresentar bons resultados em diferentes tipos de criação intensiva (CHELLAPA et al., 1995; VALENTI et al., 2000). Isso se deve às excelentes características, tais como rusticidade, rápido crescimento e forte apelo esportivo e culinário (KUBITZA, 2004). A desova anual do tambaqui é total. Na natureza, esse evento acontece de outubro a março, período que coincide com a estação chuvosa e, consequentemente, com a cheia dos rios, quando o tambaqui realiza a piracema, fenômeno caracterizado pela migração do habitat de alimentação para o de reprodução (VIEIRA; ISAAC; FABRE, 1999). Essa migração é necessária, pois a maturação gonadal desta espécie é controlada por fatores externos: ambientais (temperatura, horas de luz e pluviosidade), sociais (presença

18 17 do sexo oposto); e fatores internos (hormonais). Em cativeiro, os peixes que realizam piracema não se reproduzem naturalmente, sendo necessária a indução hormonal para reprodução (ZANIBONI-FILHO; WEINGARTNER, 2007). No Brasil, o procedimento mais usual utiliza hipófises de carpa desidratadas, diluídas em soro fisiológico e aplicadas na base da nadadeira peitoral de cada reprodutor (HARVEY; CAROLSFELD, 1993). 2.2 TAXONOMIA (FISHBASE, 2014) Reino: Animalia Filo: Chordata Classe: Actinopterygii Ordem: Characiformes Família: Characidae Subfamília: Serrasalmininae Gênero: Colossoma Espécie: Colossoma macropomum (CUVIER, 1818) 2.3 CARACTERÍSTICAS DO SÊMEN DE TELEÓSTEOS DE ÁGUA DOCE A produção espermática dos peixes teleósteos é muito alta, quando comparada à de mamíferos, devido ao grande número de divisões espermatogoniais (BILLARD, 1990a), e, também, muito variada entre as espécies. Em algumas espécies, o macho chega a produzir 100 bilhões de espermatozoides/ano/kg do peso corporal ou mais de 1x10 9 espermatozoides/g de testículo/dia (BILLARD, 1990b). Em tambaqui, Menezes et al., (2008) e Vieira et al., (2011), relataram uma concentração espermática de 35x10 9 e de 22,93x10 9 espermatozoides/ml de sêmen, respectivamente. Os espermatozoides de peixes teleósteos de água doce, quiescentes na osmolaridade do plasma seminal (condição isotônica de aproximadamente 300mOsmol/kg) começam a se mover quando suspensos em solução hipotônica (300 mosmol/kg), e exibem sua mais alta

19 18 qualidade aproximadamente em 1000 mosmol/kg, que é o equivalente ao encontrado na água do mar (MORISAWA; SUZUKI, 1980). Ao final da espermatogênese, durante o período em que se encontram armazenados nos testículos, os espermatozoides encontram-se quiescentes, protegidos pelo plasma seminal (COSSON et al., 1999). A osmolaridade do plasma seminal dos teleósteos gira em torno de 300 mosmol/kg e a quiescência é mantida até o momento em que o sêmen entra em contato com uma solução hipotônica (<300 mosmol/kg), no caso dos peixes de água doce, ou com uma solução hipertônica (>300 mosmol/kg), para os peixes de água salgada (COSSON, 2004). Após a ativação, na maioria dos peixes de água doce, a motilidade espermática dura, em média, de 30 a 40 segundos, não sendo relatada na literatura tempo de sobrevivência superior à uma hora em espécies de fecundação externa (HINES; YASHOUV, 1971; BILLARD; MARCEL; MATEI, 1980). Outra peculiaridade dos espermatozoides de tambaqui, assim como para a maioria dos peixes, é o fato de não possuírem acrossoma (MARIA et al., 2010), pois não precisam desta estrutura para a fecundação porque, ao serem liberados no meio, entram diretamente no ovócito através de um orifício chamado micrópila. A duração da motilidade espermática e da permanecia da abertura micropilar têm grande importância para a fertilização na natureza, pois os espermatozoides expelidos na água precisam encontrar e penetrar a micrópila antes desta fechar-se pela hidratação (NAKATANI et al., 2001). 2.4 CRIOPRESERVAÇÃO SEMINAL A criopreservação do sêmen consiste na conservação, a longo prazo, dos gametas por meio de congelamento em nitrogênio líquido. Esta biotecnologia é bastante utilizada como uma alternativa para o aperfeiçoamento e melhoria da reprodução de peixes em cativeiro, já que seus benefícios são variados, dentre eles: sincronização na disponibilidade de sêmen, facilidade no transporte, retardo no envelhecimento dos gametas, conservação da variabilidade genética, eliminação dos custos com a manutenção dos machos (CARNEIRO, 2007; SUQUET et al., 2000). Além disso, o sêmen congelado pode ser mantido em bancos de sêmen por prazo

20 19 indeterminado, o que possibilita o estabelecimento de programas de melhoramento genético com a utilização de machos selecionados (GODINHO, 2007). Segundo Hunter (1982), existem fatores que podem influenciar na qualidade do sêmen criopreservado, levando a diminuição da viabilidade dos espermatozoides pósdescongelação, como taxa de diluição; o tempo e temperatura de equilíbrio; a curva de resfriamento; a curva de descongelação, dentre outros. Além disso, uma das maiores dificuldades na congelação do sêmen é evitar a formação de cristais de gelo intra e extracelulares, e o aumento da concentração de solutos (MATEOS-REX; AGUILLAR, 1996). Para evitar que isso ocorra e minimizar possíveis danos as células, é necessária a adição de soluções diluidoras como um crioprotetor interno ou externo, que tem como função proporcionar proteção aos espermatozoides contra choques térmicos (SALMITO- VANDERLEY et al., 2012). A técnica de congelamento celular, segundo Maria e Carneiro (2012), pode ser dividida em etapas como: 1. Coleta do sêmen; 2. Avaliação microscópica da qualidade seminal; 3. Adição de diluidores e crioprotetores; 4. Envase e tempo de equilíbrio; 5. Congelamento e armazenamento; 6. Descongelamento; 7. Fertilização e acompanhamento do desenvolvimento embrionário e larval Soluções diluidoras Para o sucesso da técnica de criopreservação do sêmen de peixes é necessária a adição de soluções diluidoras, geralmente composta por diluente(s) e crioprotetor(es). Essas soluções são responsáveis por manter a viabilidade da célula espermática e prevenir as crioinjúrias durante a congelação e descongelação seminal. Um bom diluidor seminal deve manter os espermatozoides inativos mesmo após a diluição antes da congelação, devido à estabilização das propriedades físico-químicas (OHTA; IZAWA, 1996). Hafez e Hafez (2004) sugerem que um diluidor deve ter as seguintes características: proporcionar nutrientes como fonte de energia; proteger os espermatozoides do efeito danoso do frio; proporcionar um meio tampão; manter a pressão osmótica adequada; inibir o crescimento bacteriano; aumentar o volume do ejaculado; proteger as células espermáticas durante a congelação.

21 20 As condições mínimas requeridas para um diluente adequado são: isotonicidade, para que não haja ativação prévia da motilidade espermática; estabilidade, pois suas características físico-químicas não devem ser alteradas durante o contato com o sêmen; condutividade térmica elevada, permitindo a rápida transferência de temperatura do meio externo para os espermatozoides; esterilidade, ou seja, não devem vincular microrganismos potencialmente nocivos às células espermáticas; e, finalmente, servir de carreador de crioprotetores (LEGENDRE; BILLARD, 1980). Com relação aos diluentes que já apresentaram bons resultados, destaca-se a glicose, facilmente adquirida como uma solução estéril, que pode ser manipulada em campo, sem a necessidade de estrutura laboratorial complexa (VIVEIROS et al., 2009). O BTS (Beeltsville Thawing Solution, MINITUB), um diluente bastante utilizado na criopreservação seminal de peixes, sendo incialmente utilizado na criopreservação de sêmen suíno. Em sua composição contém glicose, citrato de sódio, ácido etilenodiamina tetra-acético (EDTA), bicarbonato de sódio, cloreto de potássio e sulfato de gentamicina, que apresenta osmolaridade de 318 mosm.kg -1 (SALMITO-VANDERLEY et al., 2012). Outros diluentes utilizados são a água de coco in natura (FARIAS et al., 1999), água de coco em pó (PESSOA, 2009), solução salina NaCl 0,9% (ÓRFÃO et al., 2008), diluente de sêmen de carpa comum (CCSE) (IRAWAN; VUTHIPHANDCHAI; NIMRAT, 2010). O crioprotetor, por sua vez, tem como função proteger as células espermáticas dos efeitos deletérios provocados pela criopreservação. Deve possuir baixa toxicidade para as células e alta solubilidade em água (BATISTA et al., 2006). Essas substâncias podem ser classificadas em duas categorias: crioprotetores intracelulares e extracelulares. Os intracelulares são capazes de retirar a água da célula e diminuem a temperatura de congelação no seu interior, prevenindo a formação de cristais de gelo no interior da célula. Com relação aos extracelulares, possuem a função de revestir a célula externamente estabilizando a sua membrana, diminuindo os danos provocados pela congelação (CARNEIRO, 2007). Quanto aos crioprotetores internos, o dimetilsulfóxido (DMSO) é o agente crioprotetor utilizado, com sucesso, na criopreservação seminal para a maioria das espécies Characiformes da América do Sul (CAROLSFELD et al., 2003; VIVEIROS; GODINHO, 2009). Outro crioprotetor que vem sendo empregado com sucesso, funcionando como uma opção alternativa ao DMSO, é o metil glicol (MG). Tal substância já foi testada e apresentou

22 21 bons resultados na criopreservação de sêmen de Brycon orbignyanus (MARIA et al., 2006), Prochilodus lineatus (VIVEIROS et al., 2009), Piaractus mesopotamicus (ORFÃO et al., 2008), Piaractus brachypomus (NASCIMENTO et al., 2010) e Colossoma macropomum (VIEIRA, 2010). Os crioprotetores extracelulares funcionam de forma diferente; ao invés de entrarem na célula, eles recobrem a superfície celular e estabilizam a membrana, ajudando, portanto, a minimizar e reparar os possíveis danos celulares causados pelo processo de congelamento (CAROLSFELD; HARVEY, 1999). Os crioprotetores externos mais utilizados são a gema de ovo de galinha e o leite desnatado, já que a fosfatidilcolina (lecitina) e lipoproteínas da gema bem como a caseína do leite têm essa propriedade protetora (NAVARRO et al., 2004) Métodos de congelação empregados para sêmen de peixes Existem vários utensílios e equipamentos para congelar as amostras de sêmen, os mais utilizados são as caixas térmicas de poliestireno (rampas), dry shippers, botijões criogênicos e máquinas de congelação programada, dentro dos quais são introduzidas palhetas francesas plásticas, cujo volume pode ser de 0.25; 0.5 e 5 ml (MAISSE et al., 1998). A caixa térmica de isopor é adaptada onde se coloca uma bandeja metálica distante do fundo alguns centímetros acima da superfície do nitrogênio líquido. A temperatura na caixa pode variar de -100 a -130 C dependendo da quantidade de nitrogênio líquido despejado (ALVAREZ et al., 2003; URBÁNYI et al., 2006; BORYSHPOLETS et al., 2009; IRAWAN; VUTHIPHANDCHAI; NIMRAT, 2010). As principais vantagens da caixa de isopor são: fácil manuseio, fácil transporte e baixo custo de aquisição, sendo assim possível a utilização em locais que não há disponibilidade de tecnologias e em fazendas de criação de peixes. Entretanto, possui como desvantagens: difícil padronização das curvas de congelação e controle da temperatura (SALMITO-VANDERLEY, 2014a). O dry shipper é um equipamento de alumínio prático e seguro utilizado no processo de criopreservação, já que é fácil de ser transportado e possui em seu interior um material poroso que absorve o nitrogênio líquido, evitando assim o perigo de vazamento (CAROLSFELD et al., 2003). No Brasil, a criopreservação de sêmen de peixes tem sido realizada em dry shipper, que

23 22 apresenta velocidades de congelamento entre -25 e -40ºC/min e estabilização à -180ºC em aproximadamente 3 minutos (TAITSON; CHAMI; GODINHO, 2008). Este equipamento é um dos mais utilizados na criopreservação de sêmen de peixes Characiformes. (SALMITO- VANDERLEY et al., 2014b). A máquina de congelação programada controla o resfriamento de forma gradual de amostras biológicas antes de serem imersas no botijão criogênico. Nestes equipamentos, as palhetas ou criotubos são congelados por vapor de nitrogênio líquido. A temperatura no interior da câmara de refrigeração pode ser controlada com precisão e a evolução no da temperatura no tempo pode ser programado (FAO, 2010) A redução da temperatura é realizada durante um período determinado pelo programador estabelecendo um intervalo de temperatura inicial e final para o término do resfriamento. Este processo é chamado de curva de resfriamento e pode variar entre as taxas de resfriamento e intervalos de temperatura inicial e final (SALMITO-VANDERLEY et al, 2014b). Nahiduzzaman et al. (2012), utilizando a máquina de congelação programada, em apenas uma etapa, resfriou as amostras de 5 C a -80 C numa taxa de resfriamento de 10 C/min. Enquanto Irawan, Vuthiphandchai e Nimrat (2010) em seu trabalho, utilizaram a mesma taxa de resfriamento porém um intervalo de temperatura diferente de 25 C a -40 C. Sultana, Nahiduzzaman e Hassan (2010), utilizando duas etapas, primeiramente resfriou as amostras de 5 C a -4 C numa taxa de resfriamento de 4 C/min e em seguida prosseguiu o resfriamento de -4 C a -80 C sob uma taxa de 10 C/min. No entanto, Linhart, Rodina e Cosson, (2000) utilizaram um protocolo diferente resfriando primeiramente as amostras de 4 C a -9 C numa taxa de resfriamento de 4 C/min e em seguida continuou de -11 C a -80 C sob uma taxa de 11 C/min. Além das vantagens mencionadas, Salmito-Vanderley et al. (2014b) dizem que os congeladores programáveis são apropriados para a congelação de grandes quantidades de palhetas de sêmen, o que já foi demonstrado por Soares e Guerra (2009), permitindo, assim a utilização em larga escala na Aquicultura. 2.4 AVALIAÇÃO DA MOTILIDADE E CINÉTICA ESPERMÁTICA

24 23 A qualidade espermática está diretamente relacionada com a motilidade dos gametas masculinos, uma vez que esta característica constitui um pré-requisito para a fertilização dos ovócitos (RURANGWA et al., 2004). Viveiros et al. (2011) relataram que a taxa de motilidade do sêmen descongelado de dourado (Salminus brasiliensis) revelava o número de espermatozoides com membranas intactas, demonstrado a íntima relação da motilidade com a viabilidade espermática e com a capacidade fertilizante do sêmen de peixes. Geralmente essa avaliação é feita de forma subjetiva, na qual o avaliador deve estimar uma taxa de espermatozoides móveis numa escala de 0 a 100% (TAITSON; CHAMI; GODINHO, 2008). A técnica convencional, baseada na observação através de microscópio ótico, é utilizada pela maioria dos laboratórios para realizar análise seminal, embora sujeita a distintos graus de imprecisão, devido à subjetividade da avaliação a partir de escalas arbitrárias (CHAMBEYRON; ZOHAR, 1990). Para solucionar os problemas de subjetividade, um dos métodos utilizados em análises objetivas da motilidade é o Computer Assisted Sperm Analysis (CASA), um sistema automático (hardware e software Sperm Class Analyser -SCA) utilizado para visualizar, digitalizar e analisar imagens sucessivas, gerando informações precisas e significativas do movimento individual de cada célula e de subpopulações de células espermáticas (AMANN; KATZ, 2004). Com o auxílio do programa é possível avaliar a porcentagem de espermatozoides móveis (ou taxa de motilidade), além da porcentagem de espermatozoides com velocidade rápida, média ou lenta; assim como analisar as propriedades de trajetória e velocidade dos espermatozoides, sendo algumas delas: Velocidade curvilínea (VCL- μm/s), velocidade linear progressiva (VSL- μm/s) e velocidade média da trajetória (VAP- μm/s). Em Characiformes, o CASA já foi utilizado para analisar a motilidade espermática pós-descongelamento de pirapitinga (P. brachypomus) (MELO, 2010), piabanha (B. insignis) (SHIMODA, 2004), curimba (P. lineatus) (NASCIMENTO et al., 2010; VIVEIROS et al., 2010) e tambaqui (VIEIRA, 2010). 2.5 ANÁLISE DA MORFOLOGIA E VITALIDADE ESPERMÁTICA

25 24 A morfologia das células espermáticas é um fator relevante na avaliação da qualidade do sêmen, sendo que o aumento das patologias espermáticas provoca a diminuição na capacidade de fertilização (LAHNSTEINER et al., 1998). Estas patologias ocorrem naturalmente, contudo agravam-se devido aos processos de congelação (STREIT JR. et al., 2009), em que o espermatozoide sofre mudanças estruturais nas membranas. Neste tipo de análise da qualidade seminal observam-se as patologias primárias (flagelo dobrado, cabeça isolada, gotas citoplasmáticas proximal e distal), que são decorrentes do processo de espermatogênese e as patologias secundárias (flagelo quebrado, enrolado, degenerado, macrocefalia, microcefalia), que são oriundas de fatores ambientais ou do processo de manejo, como a coleta do sêmen ou confecção das lâminas para avaliação dessas patologias (HERMAN; MITCHELL; DOAK, 1994). Em procedimento de avaliação de sêmen de mamíferos, a morfopatologia dos espermatozoides é considerada um parâmetro importante, e o Colégio Brasileiro de Reprodução Animal (CBRA, 2013) recomenda não utilizar, na inseminação artificial ou monta natural de mamíferos, sêmen com índices de espermatozoides com anormalidade acima de 30%, em bovinos e equinos e de 20%, em ovinos e suínos. Para peixes essas referências ainda não foram estabelecidas. Apesar dos processos de criopreservação do sêmen provocarem danos à morfologia espermática, segundo Melo-Maciel et al. (2012), esse método de avaliação dos espermatozoides é pouco observado em estudos de criopreservação do sêmen de peixes. Sugere-se, portanto, que os exames morfopatológicos dos espermatozoides de peixes devem ser incorporados à rotina de avaliação do sêmen após a criopreservação (TADDEI et al., 2001). A percentagem de espermatozoides vivos também tem sido utilizada como uma ferramenta para avaliar a qualidade seminal pós-descongelação. A integridade pode ser avaliada pelo método de coloração utilizando corantes vitais, eosina-nigrosina (BLOM, 1950; KAVAMOTO; FOGLI DA SILVEIRA, 1986; MURGAS et al. 2003; VIVEIROS et al. 2011). Neste método, quando o sêmen é homogeneizado ao corante os espermatozoides mortos coramse em rosa ou vermelho, devido a membrana não está integra, o que permite a entrada do corante. Enquanto que as células vivas permanecem incolores, logo suas membranas encontram-se integras, sendo o espermatozoide considerado vivo (HILBIG et al. 2008). Mais recentemente, a utilização de corantes fluorescentes, tais como iodeto de propídio e SYBR 14 tornou-se popular, uma vez que podem ser utilizados em combinação com a citometria de fluxo.

26 25 3 JUSTIFICATIVA O tambaqui representa a maior produção na aquicultura brasileira, superado somente pelas espécies exóticas tilápia (Oreochromis niloticus) e carpa (Cyprinus carpio). Foi uma das primeiras espécies nativas a serem incluídas no Programa Brasileiro de Melhoramento Genético por conta de sua grande importância econômica e ecológica e por possuir tecnologia de propagação artificial, fator que favorece a consolidação da atividade de seu cultivo (LOPES, 2009; SUFRAMA, 2003). Além disso, para suprir a demanda desta espécie tem se investido em seu cultivo em cativeiro e no desenvolvimento de biotécnicas reprodutivas. Apesar da tecnologia da reprodução artificial de peixes nativos brasileiros se encontrar relativamente desenvolvida, estudos sobre alguns aspectos relacionados à otimização do uso dos reprodutores ainda devem ser realizados. Dessa forma, percebe-se ainda uma dificuldade no desenvolvimento desta técnica principalmente no estabelecimento de protocolos de criopreservação eficazes para cada espécie. Assim, segundo Carneiro et al. (2012), para desenvolver tais protocolos, é necessário padronizar as etapas e os parâmetros do processo, a amostragem de congelamento e de diluição do sêmen, a determinação dos melhores diluentes e crioprotetores, tempo de equilíbrio, taxas de resfriamento, congelação, descongelação, entre outros. Dentre os diluentes já testados com sucesso em várias espécies de Characiformes, a glicose e o BTS obtiveram boas taxas de motilidade quando combinados com os crioprotetores DMSO ou Metil glicol como meio de congelação (VIVEIROS; GODINHO, 2009). De fato, na literatura, existem várias metodologias de criopreservação de sêmen que foram testadas para diferentes espécies de peixes brasileiros. Entretanto, há pouca informação disponível sobre a utilização de equipamentos de congelação programado para sêmen de tambaqui associados aos diluidores supracitados. Diante disso, é necessária a realização de estudos sobre seu uso em sêmen de peixes, visando a padronização de protocolos de congelação que sejam eficientes, e por consequência, melhorar a qualidade do sêmen pós-descongelado.

27 26 4 HIPÓTESES CIENTÍFICAS O diluente BTS associado ao crioprotetor DMSO é mais eficiente na manutenção da qualidade do sêmen pós-descongelado de tambaqui do que o diluidor padrão Glicose + DMSO. A máquina de congelação programada é mais eficiente que o Dry shipper na criopreservação do sêmen de tambaqui.

28 27 5 OBJETIVO GERAL Analisar diferentes diluidores seminais e a eficiência da máquina de congelação programada no processo de criopreservação do sêmen de tambaqui, comparado ao equipamento padrão (Dry shipper) OBJETIVOS ESPECÍFICOS Comparar os efeitos da criopreservação utilizando a máquina de congelação programada ou equipamento padrão (Dry shipper) sobre a qualidade espermática de tambaqui. Avaliar a associação de diferentes diluidores sobre a motilidade, morfologia e vitalidade espermáticas antes e após criopreservação seminal utilizando os diferentes protocolos de criopreservação.

29 28 6 CAPÍTULO 1 Criopreservação do sêmen de Tambaqui utilizando máquina de congelação programada e dry shipper Cryopreservation of Tambaqui semen using programmed freezing machine and dry shipper Periódico: SEMINA: Ciências Agrárias (Submetido em 04 de junho de 2015).

30 29 Criopreservação do sêmen de Tambaqui utilizando máquina de congelação programada e dry shipper [Cryopreservation of Tambaqui semen using programmed freezing machine and dry shipper] M.S. Oliveira 1 ; P.S Almeida-Monteiro 1 ; L.T Nunes 1 ; F.R.A Linhares 1 ; J. P, Pinheiro 1 ; R.R.R Pinheiro 1 ; F.O Ferreira 1 ; C.C Campello 1 ; C.S.B. Salmito-Vanderley 1,2,3 1 Faculdade Veterinária, Universidade Estadual do Ceará, Fortaleza, Ceará, Brasil. 2 Centro de Ciências da Saúde, Universidade Estadual do Ceará, Ceará, Brasil. 3 Correspondência: Av. Dr. Silas Munguba, 1700, Campus do Itaperi, Fortaleza-CE. Telefone: Fax: sandra.salmito@uece.br. Resumo O tambaqui (Colossoma macropomum) é uma espécie nativa de peixe de água doce de grande importância para aquicultura brasileira. Devido a isso, diversas técnicas têm sido desenvolvidas para aperfeiçoar a reprodução desta espécie em cativeiro, dentre elas a criopreservação de sêmen de peixe. Como uma forma de melhorar os protocolos de criopreservação, tem-se buscado utilizar soluções diluidoras e métodos de congelação adequados, proporcionando uma boa qualidade seminal pósdescongelação. Dessa forma, este estudo objetivou avaliar a eficiência de diferentes diluidores e métodos de congelação na criopreservação do sêmen de tambaqui (C. macropomum). As amostras de sêmen in natura foram diluídas em diferentes tratamentos (Glicose 5% + 10% DMSO, Glicose 5% + 10% Metil glicol MG, BTS + 10% DMSO e BTS + 10% MG) na proporção 1:9 e congeladas em máquina de congelação programada e em Dry shipper. As amostras seminais foram descongeladas e avaliadas para vitalidade, morfologia e cinética espermáticas. O sêmen criopreservado com DMSO utilizando a máquina de congelação programada proporcionou maiores percentuais de espermatozoides móveis (15,44 ± 1,04%) após a descongelação em relação ao Dry shipper (3,99 ± 0,55%), independente do diluente utilizado. Além disso, DMSO proporcionou as melhores velocidades espermáticas em relação ao MG, independente do método de congelação e diluente empregado. Um maior percentual de espermatozoides vivos foi observado quando se utilizou Glicose (37,28 ± 1,32%) como diluente (independente do método e crioprotetor), e DMSO (37,98 ± 1,25%) em máquina de congelação programada. Para a morfologia espermática, uma maior quantidade de espermatozoides normais (46,10 ± 1,82%) foi observada quando o sêmen foi criopreservado usando a máquina de congelação programada com o DMSO, para os crioprotetores, Glicose e BTS (38,16 ± 1,9%; 39,26 ± 1,87%, respectivamente), para os diluentes. Portanto, sugere-se a utilização do crioprotetor DMSO 10% associado ao diluente Glicose 5% em Máquina de Congelação Programada, para a criopreservação do sêmen de C. macropomum.

31 30 Palavras-chave: Colossoma macropomum, teleósteos, diluidores, métodos de conservação, sperm class analyzer. Abstract Tambaqui (Colossoma macropomum) is native freshwater fish of great importance for Brazilian aquaculture. Because of this, several techniques have been developed to improve the reproduction of this species in captivity, among them the cryopreservation of sperm. Looking for increase de efficiency of cryopreservation protocols, researches have tried to determine suitable diluting solutions and freezing methods, providing good post-thaw sperm quality. Thus, this study aimed to evaluate the efficiency of different diluents and freezing methods in the sperm cryopreservation of tambaqui (C. macropomum). Samples of semen were diluted in natura in different treatments (Glucose 5% + 10% DMSO; Glucose 5% + 10% Methyl glycol MG; BTS + 10% DMSO e BTS + 10% MG) in a 1: 9 dilution rate and frozen in programmed freezing machine and Dry shipper. The semen samples were thawed and evaluated for vitality, sperm morphology and kinetics. Semen cryopreservation with DMSO using the programmed freezing machine provided greater percentage of motile sperm (15.44 ± 1.04%) after thawing compared to Dry shipper (3.99 ± 0.55%), regardless of diluent. Additionally, DMSO showed better sperm velocity than MG, regardless of the freezing method and extender employed. A higher percentage of living spermatozoa was observed when glucose was used (37.28 ± 1.32%) (regardless of the freezing method and cryoprotectant), and DMSO (37.98 ± 1.25%) in programmed freezing machine. For morphology, a greater amount of normal spermatozoa (46.10 ± 1.82%) was observed when semen was cryopreserved using a freezing machine programmed with DMSO, as cryoprotectant and Glucose or BTS (± %, ± 1.87%, respectively), as extenders. Therefore, we suggest the use of the cryoprotectant DMSO 10% associated with the extender Glucose 5% in programmed freezing machine, for cryopreservation of C. macropomum semen. Keywords: Colossoma macropomum, teleost, extenders, conservation methods, sperm class analyzer Introdução O tambaqui (Colossoma macropomum, Curvier 1818), pertencente à família Characidae, ordem dos Characiformes, é uma espécie brasileira de peixe migratório da bacia do rio Amazonas (GOULDING; CARVALHO, 1982). Devido à sua rusticidade, textura e sabor de sua carne e ao bom rendimento de sua carcaça, seu cultivo vem crescendo rapidamente, sendo, dentre as espécies nativas de água doce, a mais cultivada na aquicultura brasileira (MPA, 2011). A alta demanda de pescado dessa espécie vem causando o declínio das populações naturais e a expansão global da produção em aquicultura têm estimulado o interesse no desenvolvimento de biotecnologias para a reprodução de peixes (KOPEIKA; KOPEIKA; ZHANG, 2007). Dessa forma, a aquicultura surge como uma ferramenta para suprir a produção pesqueira (HUNTER; ROBERTS,

32 ), dentre as tecnologias usadas nessa área, a criopreservação de sêmen se destaca com uma boa alternativa para a melhoria da reprodução de peixes em cativeiro (RESENDE; MARQUES, 2009). Essa biotecnologia auxilia no melhoramento genético de estoques cultivados; proporciona um fornecimento contínuo de sêmen com boa qualidade (IRAWAN et al., 2010); possibilita e otimiza o transporte de sêmen por longas distâncias, garantindo o intercâmbio entre as diversas instituições de pesquisa e estações de piscicultura. (CARNEIRO, 2007). Entretanto, para o sucesso da técnica, é necessário elaborar protocolos de criopreservação adequados e padronizados para cada espécie (CARNEIRO et al., 2012). Para tanto, é necessário definir a melhor solução diluidora, composta por um diluente e um crioprotetor, responsáveis por manter a qualidade seminal após a descongelação, e o método de congelação a ser empregado. Quando não ocorre a interação entre a solução diluidora e o método de congelação, as células espermáticas podem sofrer danos durante o processo da criopreservação. Assim, faz-se necessário avaliar a qualidade seminal pós-descongelação, analisando alguns parâmetros que podem influenciar negativamente na taxa de fertilização, dentre eles a motilidade, a morfologia e a vitalidade espermáticas (RURANGWA et al., 2004; VIVEIROS et al., 2011). Dentre os diluentes já testados com sucesso para várias espécies de Characiformes, a Glicose e o BTS (Beltsville Thawing Solution) obtiveram boas taxas de motilidade quando combinados com os crioprotetores Dimetilsulfóxido (DMSO) ou Metil glicol (MG) como meio de congelação (VIVEIROS; GODINHO, 2009). Os métodos de congelação mais utilizados para sêmen de peixes nativos brasileiros são o Dry shipper e a caixa térmica de poliestireno (VIVEIROS; GODINHO, 2009). Outro método que vem sendo empregado é o uso de Máquina de Congelação Programada que visa diminuir a quantidade de variáveis que interfiram no processo de criopreservação, permitindo uma queda gradual, controlada e homogênea da temperatura. Contudo, há pouca informação disponível sobre a utilização de equipamentos de congelação programada associados aos diluidores supracitados para sêmen de tambaqui. Portanto, é necessária a realização de estudos sobre o uso de máquinas de congelação na criopreservação do sêmen desta espécie, contribuindo para o avanço tecnológico da sua produção em cativeiro. Diante do exposto, este trabalho teve como objetivo avaliar a eficiência de diferentes diluidores e métodos de congelação na criopreservação do sêmen de tambaqui (C. macropomum) sobre a cinética, morfologia e vitalidade espermáticas. Material e métodos Manejo dos animais, coleta e avaliação do sêmen. Todos os procedimentos deste estudo foram aprovados pelo Comitê de Ética para o Uso de Animais da UECE ( /2014). O experimento foi conduzido durante o mês de janeiro no Centro