Major Mouse Testing Program: Longevity

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1 Major Mouse Testing Program: Longévité Santé Longevity 10/03/2015 Mapeando efeitos a longo prazo na saúde: Teste em larga escala em camundongos idosos usando terapias promissoras contra o envelhecimento e doenças relacionadas 1

2 Dedicamos esta apresentação a L. Stephen Coles, M.D., Ph.D. (19/01/ /12/2014) pioneiro na área de gerontologia e na pesquisa do envelhecimento. Stephen Coles colocou em contato especialistas americanos em camundongos com o grupo de voluntários desse projeto para terem discussões técnicas e ver o que poderia ser feito. Por anos, Dr. Coles administrou a lista de Gerontology Research Group, que serviu como grande fonte de inspiração para esse projeto. 10/03/2015 Major Mouse Testing Program 2

3 Longevidade: A revolução Revolução ocorreu em nematoides ( C. elegans ) Descoberta revolucionária em 1980: 8 maneiras de aumentar a longevidade [1] 1993: Uma mutação dobra expectativa de vida e confere grande vitalidade [2] 2003: Milhares de testes realizados; ~10% aumenta a longevidade [3] 2008: Uma mutação aumentou a longevidade em quase 10 vezes! PASSADO Vermes e camundongos envelhecem de forma diferente Vermes têm um nº fixo de células: manter a viabilidade celular é a chave Camundongos são mamíferos e a regeneração tecidual é a chave A revolução da longevidade está ocorrendo em camundongos e é promissora para humanos A revolução está chegando em camundongos, mas poucos testes foram feitos Tratamentos conhecidos que aumentam a longevidade de camundongos tiveram efeitos benéficos em humanos (aspirina, metformina, metoprolol, rapamicina) Padrões genéticos de aumento de longevidade em camundongos foram encontrados em famílias humanas longevas (Larron-dwards, Foxo-3A, akt-1) Ajude-nos a realizar múltiplos testes em camundongos, para que possam ser aplicados para humanos futuramente PRESENTE 10/03/ Major Mouse Testing Program

4 Resumo do programa Duração 1ª série de experimentos em animais adultos com duração de 18 meses Na outra série será preciso construir novas linhagens, demorando 38 meses Resultados serão checados 3x para que possam ser testados em humanos. A maior parte dos resultados virá 5 anos após o início do programa. Pessoas envolvidas Contactamos diferentes pesquisadores e identificamos grupos de laboratórios com forte experiência em animais, teste de longevidade e em medicina regenerativa Orçamento Custo estimado para os 1000 diferentes testes é de 20M. Há uma correlação direta entre o financiamento, o nº de testes e o cronograma do projeto. D Benefícios esperados: Resultados esperados De 1000 testes esperamos 100 resultados positivos: -Nematoides:10% de testes positivos (muitos testes já feitos) - Em camundongos, ~10% (difícil de estimar: poucos testes feitos) 1. Mudar pensamento da sociedade em todos seus níveis 2. Resultados devem trazer uma visão global sobro que aumenta a longevidade 3. Esperamos atingir um robusto aumento da longevidade 4. Esperamos que alguns tratamentos sejam aplicáveis em humanos Aplicação em estudos de longevidade em humanos Iniciando o programa esse ano, esperamos resultados robustos em menos de 10 anos. 10/03/2015 Major Mouse Testing Program 4

5 O que testar: Intervenções por origem Resultados parciais Longevity DB: mais de 1000 intervenções Banco de dados lista genes humanos estatisticamente correlacionados com longevidade. Para muitos genes, a causalidade pode ser testada em camundongos: Lifespan Observation Database 3359 intervenções que aumenta longevidade: em roedores (114; alguns indefinidos, mas com resultados promissores), nematoides (2400), outras especies Confirmações futuras precisam ser feitas em camundongos: Outras ideias Grupo no Facebook: PotentialGerontodrugs Atualmente mais de 300 posts Cada post contém uma intervenção em potencial para ser testada em camundongos Outras fontes Outros bancos de dados parecidos foram encontrados. Fóruns e listas de s foram analisados. Circulamos também em conferências da área um trabalho para listarmos ideias.. O número total de intervenções é grande. Análises para determinar prioridades está em andamento 10/03/2015 Major Mouse Testing Program 5

6 O que testar: Intervenções por classe Variações genéticas em humanos Tratamentos com drogas já usadas em humanos Tratamentos já usados em humanos e que acabam favorecendo uma vida saudável. Conceito: Se camundongos viverem mais e melhor com certa droga, é um forte argumento para que esta esteja de forma causal melhorando a saúde de pessoas. Resultados de pesquisas Normalmente resultados in vitro e in vivo de camundongos, ratos, nematoides, ou mosca-da-fruta, precisam de confirmações de aumento robusto da longevidade e saúde para que possam ser extrapoladas para humanos Diversas terapias em camundongos Variações encontradas em populações humanas que acabam favorecendo uma vida saudável, podendo ser testadas através de terapia gênica em camundongos idosos. Conceito: Se camundongos viverem mais e melhor, é um forte argumento para que essa variação melhora a saúde humana de forma causal, e que futuramente terapia gênica pode ser efetiva também. Terapia gênica em camundongos Banco de dados 10/03/2015 Major Mouse Testing Program 6

7 Cronograma geral Fase I 1 ano Formação de times, financimento e investigação de técnicas Número de intervenções testadas depende do financiamento TESTES INICIANDO COM CAMUNDONGOS IDOSOS Fase II 2 meses Fase III 14 meses Fase IV 18 meses Fase V 18 meses Preparação de equipamentos Teste com 40 a 400 terapias Confirmação e otimização de resultados Início de protocolos em humanos TESTES INICIANDO COM NOVA LINHAGEM DE CAMUNDONGO 2 meses 38 meses 18 meses 18 meses Preparação de equipamentos Teste com 60 a 600 terapias Confirmação e otimização de resultados Início de protocolos em humanos O cronograma da Fase III está detalhado no próximo slide 2 m 100 terapias testadas 10 resultados positivos 20 m 1000 terapias testadas 100 resultados positivos A estimativa financeira encontra-se no slide 17. Contém também o número de testes previstos dependendo do financiamento obtido. 10/03/ Major Mouse Testing Program

8 preparação Fase III 6 meses 30 machos 30 fêmeas 18 meses 14 meses? Resultados positivos da Fase III levarão a Fase IV, que é parecida com a Fase IIIb : validação em roedores idosos de outros laboratórios + estudo dos diversos efeitos na saúde Nascimento Fase IIIa: Inicia-se criando linhagens novas. Maioria genética & muitas outras terapias. 18 meses de idade: Início do tratamento Fase IIIb: Teste Real! Drogas, genética, outros 32 meses de idade: Houve aumento da longevidade em relação ao grupo controle? Decisão para próximos passos 10/03/2015 Major Mouse Testing Program 8

9 Organização Geral Doadores Financiamento Resultados Grupo Longévité Santé, ILA Produtores de camundongos Camundongos Instalações/ Facilities 10/03/2015 Major Mouse Testing Program 9

10 Lista: Para-Fazer Escolher intervenções em potencial Em progresso Identificar fontes de financiamento Presente Refinar metodologia Em progresso Laboratórios necessários para realização do projeto e fazer acordos com estes Contactar investidores em potencial Fazer acordos gerais Calcular custos dos experimentos (equipamentos e mão-de-obra) Em progresso Negociações financeiras mais detalhadas Coletar o necessário para começo do programa Futuro 10/03/2015 Major Mouse Testing Program 10

11 Times e laboratórios Laboratórios: 1. Equipados com estrutura de altíssima qualidade para animais (gaiolas com filtros individuais com ventilação) e 2. Especializados em medicina regenerativa, e em áreas relacionadas com o envelhecimento Arlan Richardson 40 anos de experiência em testes de longo prazo com roedores (compostos e terapia gênica) Laboratory USA (Oklahoma) Alexandra Stolzing Medicina regenerativa & células-tronco Translational Centre for Regenerative Medicine Leipzig University (Leipzig) Jean-Marc Lemaitre Medicina regenerativa em camundongos e células humanas (células-tronco e terapia gênica) Inserm na França (Montpellier) 10/03/2015 Major Mouse Testing Program 11

12 Time de voluntários Agradecimento especial ao time de voluntários: Time principal: Edouard Debonneuil, Rached Messaoudi, Valentin Socolov, Martin Dinov, Daniel Krochmal, Maciej Michalak, Nicoleta Reinald Assistência de: Steve Coles (finado), Johnny Adams, Daria Khaltourina, Matthew Scholz, Didier Coeurnelle, Anton Kulaga, Paul Spiegel, Liz Parrish, Alexandru Chircu, Alexandre Blanc, Dmitri Borisoglebsky, Victor Björk, e tantos outros pesquisadores e voluntários da internet. Longévité & Santé: Encontros semanais para organizar o projeto em La Paillasse, Paris. contribuidores de diferentes países em diferentes ocasiões 10/03/2015 Major Mouse Testing Program 12

13 Obrigado por sua atenção! Versões atualizadas dessa apresentação: Caso queira ajudar, Doações via paypal em De outras maneiras através do IBAN: FR Contato para propor ajuda em pontos específicos O que precisamos mais especificamente: Se você tiver experiência em testes de longevidade em camundongos, ou terapia gênica in vivo, ou incorporação de drogas na comida, ou se pude ajudar nos desenhos experimentais do projeto. Se você souber fontes de financiamento em potencial que possam ajudar, ou se você estiver interessando em escrever projetos de financiamento por favor, não hesite em nos contactar Apresentação do projeto em conferências ou tradução dos slides para outras línguas. Contatos para organizações registradas em seu país, sem fins-lucrativos, pró-longevidade com vantagens fiscais para seus doadores, que possam querer financiar o projeto. P.S: Estamos cientes que alguns links e s desse slide não essão homogêneos. Estamos melhorando isso para as futuras versões. Para esclarecimentos, SLS é Sceaux Longévité Santé, e ALA é o American Longevity Alliance, afiliações sem fins-lucrativos da International Longevity Alliance localizada na França e nos EUA, respectivamente. 3/10/2015 Major Mouse Testing Program 13

14 Apêndice Recapitulação em 3 slides Lista de terapias para testar em camundongos Técnicas de terapia gênica Outros 10/03/2015 Major Mouse Testing Program 14

15 Hoje existem menos de 10 estudos de longevidade em camundongos por ano. Objetivo: 1000 testes em menos de 5 anos Em nematoides, 10% dos milhares de testes foram positivos Em camundongos, também 10% [5/67 por Spindler. S e 5/15 por ITP, 1-2 em comum]: Programa de intervenções, EUA: - NDGA (machos, +10%) - Rapamicina (machos, & fêmeas, %) - Acarbose (machos, +22%) - Aspirina (machos, +10%) - α-estradiol (machos, +10%) Aspirina: baixa mortalidade em humanos (80 mg/dia, 5 anos) Everolimo : em teste em idosos(resistência de vacina contra gripe) Metformina: diminui a mortalidade em humanos Outros resultados estão sendo checados em roedores (Fulereno) 10/03/2015 Major Mouse Testing Program 15

16 Resultados esperados Descobertas em camundongos têm grande potencial para avançar saúde humana a longo prazo 1 Alterar a forma que a sociedade pensa A biologia aplicada está emergindo em relação as inúmeras terapias que previnem ou revertem/silenciam o envelhecimento. Podemos então, aumentar a longevidade do camundongo de forma robusta? Quebra de paradigma na ciência da longevidade Guiar pesquisas para o que realmente aumenta a longevidade. Destacar mecanismos envolvidos. Em conjunto com estatísticas em humanos, esperamos que os resultados possam ser aplicáveis em até 5 anos Grande aumento da longevidade Dos muitos resultados, esperamos que alguns aumentem a longevidade de forma drástica Nova área farmacêutica: saúde a longo prazo Aplicação de drogas já existentes para o envelhecimento e doenças relacionadas 10/03/2015 Major Mouse Testing Program 16

17 Financiamento e Orçamento Nota: Custos estão sendo recalculados. De qualquer maneira, o número de testes será ditado pela quantidade de financiamento Fase III Consideremos que 400 terapias serão testadas em camundongos idosos e 600 terapias exijam novas linhagens; sendo que cada terapia precisa de 60 animais (30 machos e 30 fêmeas) e cada um dos dois sistemas (animais envelhecimentos/linhagens novas) precisam de um controle de 1000 camundongos (desenho assimétrico; 50% macho-fêmea). Consideremos que o manuseamento custa ~1.5 por animal/semana (dependendo das condições) e que cada animal viva em média 27 meses. Um cálculo rápido indica que o custo total do manuseamento é de 1.5*(27*(600* )+9*(400* ))*(30.5/7) = 8 M Consideremos que cada animal idoso custa 100 e que cada animal transgênico custa 30 para ser gerado. O custo inicial do camundongo é de (600* )*100+(400* )*30 = 4.5 M Custo total para a Fase III é de 12.5 M Fase IV Consideremos que 10% das terapias testadas na Fase III sigam para a Fase IV, e que em média, cada terapia na Fase IV custará 6 vezes o custo da Fase III (esse aumento de longevidade precisa ser confirmado e refinado). O custo total da Fase IV é de 12.5*10%*6 = 7.5 M Total O custo total das 1000 terapias seria então = 20 M, com os cáculos acima. As principais fontes de gastos foram detalhados acima. 10/03/2015 Major Mouse Testing Program 17

18 Terapias para testar em camundongos Exemplos de terapias extraídas do grupo do Facebook A L T A P R I O R I D A D E M É D I A Controles de aumento da longevidade: aspirina, metformina, rapamicina, estatinas Snell, Ames, mutações de IGF-1 em idade avançada TA-65, ativador de telomerase, e variante humana de telomerase TM5441(Aumenta 4x a longevidade em camundongos; reduz níveis de PAI, marcador de senescência) Centrofenoxino/Meclofenoxato: reduz níveis de lipofuscina e aumenta longevidade de ratos Farmacoperonas (inverte a mutação em GNRHR) Suplementação de Neuraminidase 1 (reduz parcialmente a doença de Alzheimer) Injeções de GDF11 (reduz parcialmente envelhecimento no coração e cérebro de camundongos) D-Glucosamina (mimético da restrição calórica, aumenta longevidade de camundongos idosos) Dimetilaminoetanol (aumenta longevidade; falta testar doses mais baixas) Trealose (induz autofagia; altera via de IGF-1; elimina proteínas neurodegenerativas) Destruição de 7-cetoColesterol com LysoSENS s (Em breve pronta pra testes) Estabilização genética da estrutura da transtiretina... [MUITAS OUTRAS] Bifosfonatos (usados contra osteoporose, mas parece reduzir a longevidade por outras vias) Suplementação de fulereno em ratos (90% de aumento da longevidade) Tafamidis (tratamento de doença familiar de transtiretina) Suplementação de NAD+... [MUITAS OUTRAS] 3/10/2015 Major Mouse Testing Program 18

19 Outras intervenções promissoras 1. Variações genéticas humanas terapia gênica em camundongos. Variações encontradas em populações humanas que acabam favorecendo uma vida saudável, e que podem ser testadas através de terapia gênica em camundongos idosos. Conceito: Se camundongos viverem mais e melhor, é um forte argumento que essa variação melhore a saúde humana de forma causal, e que a terapia gênica possa ser efetiva também. 2. Tratamento com drogas já usadas em humanas tratamento de drogas em camundongos. Tratamentos usados em humanos e que acabam favorecendo uma vida saudável. Conceito: Se camundongos viverem mais e melhor com certa droga, é um forte argumento para que esta melhore de forma causal a saúde de pessoas. 3. Resultados de pesquisas diversas terapias em camundongos. Normalmente resultados in vitro e in vivo de camundongos, ratos, nematoides ou moscas-da-fruta, precisam de confirmações de aumento robusto da longevidade e saúde para que possam ser extrapoladas para humanos 10/03/2015 Major Mouse Testing Program 19

20 Exemplo: transpor rs rs é uma variação genética humana codifica para a proteína tubulina beta4b. A variante corresponde em ter um T no lugar de um C em algum ponto. Foi encontrado no estudo Framingham Heart Study. Cidadões americanos com duas cópias desta variante tiveram menor risco de doenças cardiovasculares, de câncer e de morte prematura de maneira bastante significativa (p_value = 6e-53) Referência: Camundongos têm o mesmo gene! ("ortólogo") indicando que tem a mesma função. Naturalmente, eles tem um "C", e não um "T". Por isso, queremos dá-los essa mesma variante: parte do gene do camundongo é: "GCCGCATGTCTATGAAGGAGGTGGACGAACAGATGCTTAATGTCCAAAACA«, e o objetivo é transformá-lo em "GCCGCATGTCTATGAAGGAGGTGGATGAACAGATGCTTAATGTCCAAAACA" usando técnicas de CRISPR. Se isso aumentar sua longevidade (melhorar a saúde, etc) é uma confirmação de que funciona em humanos Objetivo é testar rs e também muitos outros candidatos (temos mais de 1400 candidatos!). O que vier de estudos em humanos e for confirmado em camundongos tem grandes chances de funcionar em nós - Depois de 5 anos algumas pessoas (primeiramente talvez pacientes e idosos) começarão a fazer a terapia gênica e serem monitorados quanto sua saúde. - Potencialmente em 10 anos será frequente usar terapia gênica para esses genes para melhora da saúde. 10/03/2015 Major Mouse Testing Program 20

21 Terapia Gênica em animais idosos: técnicas 1. Linhagens sensíveis a drogas Por que usar linhagens específicas e não tratar linhagenes normais? Especialistas nos disseram que técnicas existentes de terapia gênica afetam uma minoria do corpo: mesmo se o gene da longevidade for introduzido, é incerto se terá efeito pronunciado; usando essas técnicas, há o risco de desgastar o programa Eles sugeriram gerar linhagens sensíveis a drogas ( Técnica Passo 1 (6 meses): para cada variante genético a ser testado, uma linhagem será contruída; embriões incorporaram a variação com um promotor ativado por drogas usando a técnica de CRISPR e é implantado em fêmeas. A progenia que tiver a mutação é testada; se estiver OK é cruzada para gerar 30 machos e 30 fêmeas para análise da sobrevida. Passo 2 (18 meses): animais são mantidos e alimentados normalmente. Devem se comportar que nem o controle porque a variação não está expressa. Passo 3 (14 meses): Após 18 meses, são alimentados com a droga que ativa o gene. Curva de sobrevivência é comparada com o controle. P.S: Não abandonamos o tratamento de animais idosos normais: 30 machos 30 fêmeas a) Após esses 38 meses, fase IV: para os casos (10%?) com aumento estatístico da longevidade, a variação é testada em animais idosos usando técnicas diferentes (próximos slides) b) Em paralelo nesses 38 meses, técnicas de terapia gênica (próximos slides) já são testadas para genes estabelecidos de longevidade, sendo uma forma de treinar para a) 3/10/2015 Major Mouse Testing Program 21?

22 Terapia Gênica em animais idosos: técnicas 2. Terapia gênica com 18 meses: Alteração genética mediada por vírus Contexto Muitas técnicas podem alterar genes in vivo. Especialistas sugerem que usemos o Adeno- Associated Virus (AAV). Esses vírus incorporam parte de seu DNA no DNA do hospedeiro infectado. Nas últimas décadas, alguns desses foram selecionados para uso científico para serem aplicados em diferentes órgãos: AAV1,AAV2..AAV9. Ex: usaremos como padrão AAV9, por ter tropismo para tecido neural. Técnica Passo 1 (2 meses): Para cada variação genética a ser testada, o AAV incorpora o gene com a técnica de CRISPR sendo injetado em: 1.animais jovens para testar se espalha-se e 2. em 30 machos e fêmeas de 18 meses Passo 2 (14 meses): Sobrevida dos camundongos envelhecidos é comparada com o grupo controle. Limitantes Baixa eficiência: Uma pequena fração de células recebe AAVs e uma menor ainda tem o constructo no núcleo: a chance de agir de forma suficiente para aumentar a longevidade é baixa. Ainda assim, terapia gênica de telomerase já foi descrita com esse método. Aplicação terapêutica: Frequentemente, adultos são infectados por AAVs durante suas vidas. Para esses, a terapia poderia resultar em uma resposta imune que tornaria a terapia pouco eficaz. Pessoas saudáveis podem hesitar em usar essas terapias. (*) Bernardes de Jesus B. et al. (2002) 30 machos 30 fêmeas /10/2015 Major Mouse Testing Program 22 teste? AAV

23 Terapia Gênica em animais idosos: técnicas 3. Expressão transiente após 18 meses: Minicírculos contendo vetor lipossomal Contexto Minicírculos são círculos de DNA. Em camundongos, eles não afetam necessariamente um nº de células maior que AAVs, mas eles não geram respostas imunes tornando-se uma abordagem translacional mais eficaz. Um problema é que em células em divisão o efeito é transiente, necessitando do uso de constantes tratamentos. Técnica Passo 1 (2 meses): Para cada variação a ser testada minicirculos contendo o gene são produzidos em quantitade suficiente usando bactéria modificadas (um plasmidio é criado em E. coli, suas partes procarioticas são removidas = minicírculo: sem resposta imune); são então incorporados em vetores lipossomais (que tem minicírculos) e injectados em animais jovens para testar sua distribuição. Passo 2 (14 meses): Os minicírculos são injetados em 30 machos e 30 fêmeas, a cada duas semanas, iniciando aos 18 meses de idades. A sobrevida é comparada com a do grupo controle Nota Evoluções: A área está mudando rapidamente. Esses slides são, portanto, indicativos: nós podemos escolher melhores técnicas quando/se essas aparecerem e se tornarem robustas (microcírculos, elementos S/MAR ). teste E. coli 30 machos 30 fêmeas? /10/2015 Major Mouse Testing Program 23

24 Terapia Gênica em animais idosos: técnicas 4. Outros Uma questão de tecido-específico Para a maioria das variações genéticas que queremos testas, não sabemos à priori se afetar algum tecido em específico faria sentido. Ex: uma mutação familiar pode estar associada com aumento longevidade em diferentes população sem saber se esses efeitos são através de certos tecidos. Por isso, os slides anteriores eram sobre técnicas gerais: Ex: que são expressas em todo o corpo. Nesses casos, a não ser que já tenha sido demonstrado que o gene aumenta a longevidade, iniciaremos com a técnica longa #1: gerar a linhagem e esperar por sua longevidade. Para casos específicos que certo órgão deve ser afetado, a terapia gênica pode ser bem mais eficiente. Esse é o caso para célular do sangue e do fígado Uma área que cresce rápido Como dito no último slide, técnicas de terapia gênica estão melhorando Pode acontecer que após 6 meses do início dos experimentos, alguma técnica melhor apareça. Mas, seria muito pior esperar décadas para iniciar os experimentos. Pode acontecer também que a técnica #1 seja uma maneira artifical para modelar uma futura terapia gênica que estará disponível para idosos daqui cinco ou dez anos. Nessa perspectiva, essa técnica seria muito melhor que outras (AAVs, minicírculos, ou outras terapias pouco efetivas) 3/10/2015 Major Mouse Testing Program 24

25 Referências As seguintes referências correspondem ao slide nº3 A revolução da longevidade em C elegans [1] Klass MR (1983). "A method for the isolation of longevity mutants in the nematode Caenorhabditis elegans and initial results". MECHANISMS OF AGEING AND DEVELOPMENT 22 (3-4): PMID [2] Kenyon C, Chang J, Gensch E, Rudner A, Tabtiang R (1993). "A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type". Nature (journal) 366 (6454): PMID [3] Lee SS, Lee RY, Fraser AG, Kamath RS, Ahringer J, Ruvkun G (2003). A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity. NAT GENET. PMID [4] Ayyadevara S, Alla R, Thaden JJ, Shmookler Reis RJ (2008). "Remarkable longevity and stress resistance of nematode PI3K-null mutants". AGING CELL 7 (1): PMID A futura revolução da longevidade em camundongos Bartke A, Brown- Borg H (2004). Life extension in the dwarf mouse. CURR TOP DEV BIOL. 63: PMID Harrison, D. E., Strong, R., Sharp, Z. D., Nelson, J. F., Astle, C. M., Flurkey, K., Nadon, N. L., Wilkinson, J. E., Frenkel, K., Carter, C. S., Pahor, M., Javors, M. A., Fernandez, E. and Miller, R. A. (2009) Rapamycin fed late in life extends lifespan in genetically heterogeneous mice. NATURE 460: PMID Spindler SR, Mote PL, Li R, Dhahbi JM, Yamakawa A, Flegal JM, Jeske DR, Li R, Lublin AL (2013). β1-adrenergic receptor blockade extends the life span of Drosophila and long-lived mice. AGE. PMID Martin-Montalvo A, Mercken EM, Mitchell SJ, Palacios HH, Mote PL, Scheibye-Knudsen M, Gomes AP, Ward TM, Minor RK, Blouin MJ, Schwab M, Pollak M, Zhang Y, Yu Y, Becker KG, Bohr VA, Ingram DK, Sinclair DA, Wolf NS, Spindler SR, Bernier M, de Cabo R (2013). Metformin improves healthspan and lifespan in mice. NAT COMMUN. 4:2192. PMID /03/2015 Major Mouse Testing Program 25