RMN: Fundamentos e Aplicações - Biotecnologia e áreas afins
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- Thiago Ribeiro Nobre
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1 Ressonância Magnética Nuclear: fundamentos e aplicações em Biotecnologia e áreas afins Departamento de Física - UFES
2 Sumário Fundamentos e aplicações de RMN: Princípios físicos. Detalhes experimentais. RMN de líquidos e de sólidos. Aplicações de RMN em Biotecnologia e áreas afins: Bioquímica. Fármacos. Alimentos. Produtos vegetais.
3 Fundamentos de RMN Precessão de Larmor: Frequência de Larmor: ωl = γb 0 (~10 7 rad/s) fl = γb / 2 0 π (~MHz) radiofrequência (RF) µ Momento magnético nuclear. = γi
4 Energias de interação ordens de grandeza Interação nuclear: E n kev = 10 3 ev Interação magnética entre um núcleo e um campo magnético externo: E m µev = 10-6 ev Agitação térmica: E T kt 10-2 ev
5 Alguns núcleos de interesse para RMN Nuclídeo Abundância natural (%) Spin nuclear Frequência de RMN a (MHz) Sensibilidade b 1 H 99,99 1/2 100,000 1, C 1,07 1/2 25,145 1, N 99, ,226 1, O 0,038 5/2 13,556 1, Na 100 3/2 26,452 9, Si 4,683 1/2 19,867 3, P 100 1/2 40,481 6, S 0,76 3/2 7,676 1, K 93,258 3/2 4,666 4, Ca 0,135 7/2 6,730 8, Xe 26,44 1/2 27,810 5, a Para um campo magnético de 2,35 T (espectrômetro de 100 MHz). b Com relação ao nuclídeo 1 H. Harris et al., Pure Appl. Chem. 2001;73(11):
6 Alguns núcleos de interesse para RMN
7 Interação nuclear combinada: magnética e elétrica
8 Fundamentos de RMN Núcleo atômico na presença de um campo magnético estático: ω = mgr L ωl = γb 0
9 Magnetização nuclear 2 Nµ B 3kT 0 M0 = E n n = + = µ B = γmħb = mħω ( e 0 ħω L / kt ) 0 L
10 Transições de spin nuclear ħω Absorção ħω L Relaxação Equilíbrio Saturação Equilíbrio Probabilidade de transição apreciável: ω ω L
11 Excitação do sistema de spins B 0 ~ 1T f L ~ 43 MHz ( 1 H) f L ~ 28 GHz (elétron) Campo de RF: B 1 ~ 10G = 10-3 T Campo da Terra: B T ~ 10-5 T B 0 = B 0 zˆ B ( 2B cos t) xˆ 1 = 1 ω
12 Efeitos do campo de RF sobre a magnetização Z M 0 υ 1 FIG.3 B 1 z z M 0 υ 0 B 0 M 0 Direction of rotation of M 0 about B 1 FIG.4 FIG.5 x B 1 y
13 Pulsos de RF a) z b) c) z z M 0 90 o M o M 0 θ = γ Β 1 t y y y B 1 M xy B 1 B 1 M xy x x x FIG.6 M xy = M 0 M xy = 0 M xy < M 0 Pulso π/2 Pulso π Pulso θ Controle Duração ( ~ µs) Amplitude ( ~ 10 2 khz) Fase (0, 90, 180, 270 )
14 Detecção do sinal de RMN Bobina posicionada no plano transversal: dφ S( t) = B µ 0ωLM0 cos ωlt dt S max = S(0) I ( I 1) ħ B0 µ Nγ + 3kT Hoult & Bhakar (1997)
15 Detecção do sinal de RMN FID = decaimeno livre de indução ω L f L Transformada de Fourier (FT) f L FID Espectro
16 Método da transformada de Fourier
17 Obtenção do espectro de RMN por TF Exemplos: Spin dynamics, M. H. Levitt. John Wiley & Sons, 2002.
18 Espectros de RMN de 1 H - etanol Packard et al, (1951) CH 3 CH 2 OH Deslocamento químico: ( 1 ~ = σ ) B f B loc γbloc = = f (1 σ ) 2π obs L iso 0 δ = f obs f ref f ref Valores típicos ( 1 H): f ref 400MHz (TMS) f obs f ref Hz δ 10-6 : partes por milhão (ppm)
19 Detecção do sinal de RMN FID = decaimeno livre de indução ω L f L Transformada de Fourier (FT) f L FID Espectro
20 M z = M 0 Relaxação do sistema de spins M z = 0 x ω L y x y x y M z < M 0 M z = M 0 x M x, M y = 0 y x y
21 Relaxação do sistema de spins Relaxação longitudinal (T 1 ): Trocas de energia entre spins e rede. Existência de campos flutuantes com freqüências ~ ω L. Restauração do equilíbrio térmico. Relaxação transversal (T 2 ): Perda de coerência entre os spins no plano transversal. Distribuições de freqüências de precessão. Interações entre os spins. Magnetization FIG.24 M 0 Longitudinal relaxation M z = M 0 ( 1 - e - t / T 1 ) 0.63 M 0 Líquidos: T 1 T M 0 Transverse relaxation Sólidos: T 1 >> T 2 T 1 T 2 90 o pulse T 1 = T 2 M y = M 0 e - t / T 2 t
22 Técnica dos ecos de spin ( spin-echoes ) Hahn (1950)
23 Medida de T 2 : sequência spin-eco
24 Espectrômetro de RMN
25 Espectrômetro de RMN RMN: Fundamentos e Aplicações -
26 Sonda de RF ( probe )
27 Magneto supercondutor
28 Magnetos supercondutores
29 Interações de spin nuclear f L fl = γb / 2 0 π Núcleo atômico isolado: medida de f L fornece B 0 ou γ. Núcleo atômico na matéria: espectros de RMN (contendo vários valores ou distribuições de f L ) fornecem informações sobre a estrutura da matéria.
30 Interações de spin nuclear Materiais isolantes e diamagnéticos: Deslocamento químico: Termo isotrópico + parte anisotrópica. Interação dipolar direta: Homonuclear ou heteronuclear. Acoplamento escalar (J): Termo isotrópico. Interação quadrupolar: I > 1/2.
31 Deslocamento químico ( chemical shift ) Em líquidos: ω = γb = γ(1 σ ) B loc iso δ = ( f f ) / f obs ref ref 0 ppm TMS Spin dynamics, M. H. Levitt. John Wiley & Sons, 2002.
32 Deslocamento químico ( chemical shift ) Faixa de deslocamentos químicos para 1 H: frequência blindagem magnética
33 Deslocamento químico ( chemical shift ) Faixa de deslocamentos químicos para 13 C: frequência blindagem magnética
34 Deslocamento químico em sólidos Monocristal B loc = ~ ( 1 σ ) B 0 B loc (1 σ ) B zz 0 σ = σ + σ θ zz iso 2 (3cos 1) Sólido policristalino ou pó
35 Interação dipolar internuclear B ( loc) z = µ r 3 ij 2 (3cos θ 1) Interação através do espaço
36 Acoplamento escalar ou indireto (J ) Interação através de ligações químicas
37 Interação quadrupolar elétrica Núcleos quadrupolares (I > ½): 2 H, 23 Na, 25 Mg, 27 Al, 35 Cl, 55 Mn,... +q (0,0,d) z θ z -q -q -q y x -q (d,0,0) +q (0,d,0) EQ = 3 2 ( eqq / d )(3cos θ 1)
38 Interações de spin nuclear: resumo
39 Interações de spin nuclear: resumo
40 RMN em sólidos policristalinos Alargamento inomogêneo: interações anisotrópicas. Algumas técnicas de alta resolução: Desacoplamento dipolar. Rotação em torno do ângulo mágico (MAS). Polarização cruzada (CP). Objetivo: obtenção de espectros em sólidos com resolução similar à de líquidos, permitindo a medida de deslocamentos químicos isotrópicos.
41 Rotação em torno do ângulo mágico (MAS) B 0 θ θ m 1H 13C 3cos 2 θ cos 2 θ m 1 = 0 θ m = cos 1 (1/ 3) = 54,74º Andrew (1959), Lowe (1959).
42 Rotação em torno do ângulo mágico (MAS) RMN de 13 C (glicina) Estático MAS 1kHz MAS 12kHz
43 RMN no estado sólido: probes e rotores Rotores menores: Frequências de MAS maiores, 7mm: f MAS < 8 khz. 2,5mm: f MAS < 35 khz. Menor sensibilidade.
44 Polarização cruzada (CP) γhb1 H = γcb1 C B 1H 13C 0 B 0 B 1H π/2 x RF y RF y B 1C RF contato DEC contato aquisição Pines (1973) Ressonância dupla: Excitação de 1 H (f 1H ) e de 13 C (f 13C ). Detecção de 13 C (f 13C ). Aumento do sinal de 13 C por um fator de no máximo γ( 1 H) / γ( 13 C) ~ 4. Redução no tempo de repetição: T 1 ( 1 H) < T 1 ( 13 C). Detecção seletiva de grupos hidrogenados ( edição de espectros ).
45 Aplicações de RMN em Biotecnologia e áreas afins Metabolômica. Fármacos. Produtos naturais. Materiais derivados de matérias-primas vegetais. Biomateriais. Tecnologia do biodiesel. Alimentos.
46 RMN de 29 Si e 31 P em materiais bioativos
47 RMN de 29 Si e 31 P em materiais bioativos
48 RMN de 25 Mg em bacterioclorofilas
49 RMN de 25 Mg em bacterioclorofilas
50 RMN de 13 C em materiais lignocelulósicos
51 RMN de 13 C em materiais lignocelulósicos RMN de 13 C CP/MAS
52 RMN de 13 C em materiais lignocelulósicos
53 RMN de 13 C em carvões
54 RMN de 13 C em materiais lignocelulósicos
55 RMN de 13 C em materiais lignocelulósicos
56 RMN de 29 Si sílica de origem biogênica
57 RMN de 29 Si sílica de origem biogênica RMN de 29 Si no estado sólido com CP ( 1 H 29 Si) em sílica biogênica:
58 RMN de 29 Si sílica de origem biogênica
59 RMN de 29 Si sílica de origem biogênica Casca de arroz Endocarpo de babaçu Si-O-C Si-O-Si Si-O-C Si-O-Si
60 RMN de 29 Si em produtos derivados da casca de arroz
61 RMN de 29 Si em produtos derivados da casca de arroz
62 RMN de 1 H em biodiesel
63 RMN de 1 H em biodiesel
64 Aplicações ao estudo de fármacos Caracterização de substâncias amorfas. Identificação e quantificação de fases: polimorfos cristalinos, componentes amorfas, etc. Detecção de pequenas quantidades de componentes individuais usando enriquecimento isotópico. Investigação da interação entre agentes ativos e excipientes. Investigação de processos dinâmicos.
65 Aplicações ao estudo de fármacos
66 Aplicações ao estudo de fármacos
67 Aplicações ao estudo de fármacos
68 RMN aplicada em estudos de metabolômica
69 RMN aplicada em estudos de metabolômica
70 Formação de imagens por RMN (MRI) Utilização de gradientes de campo magnético: Discriminação espacial de freqüências. Distribuição de densidade de prótons.
71 Técnicas de contraste Contraste pela densidade de prótons. Contraste por T 1 (relaxação longitudinal). Contraste por T 2 (relaxação transversal). Tórax Pele Fígado Pulmão Próstata Ossos T 1 (s) Tumoral 1,08 1,05 0,83 1,11 1,11 1,03 T 1 (s) Normal 0,37 0,62 0,57 0,79 0,80 0,55
72 Exemplo de contraste por T 1
73 Exemplo de contraste por T 2 AVC (corte transversal)
74 MRI aplicada ao estudo de fármacos
75 Aplicações ao estudo de alimentos Presença de poros em queijos, Determinação da fração cristalina em margarinas, Existência de defeitos em frutas e legumes, Difusão e retenção de água em géis (especialmente em leites e derivados), Processos de transformação em produtos alimentares (fritura, congelamento, etc,), Determinação de teores de gordura em sementes, carnes, etc,
76 RMN aplicada ao estudo de alimentos
77 RMN aplicada ao estudo de alimentos
78 RMN aplicada ao estudo de alimentos RMN de 31 P in vivo sementes:
79 RMN aplicada ao estudo de alimentos
80 RMN aplicada ao estudo de alimentos RMN de 1 H sucos de maçã:
81 RMN aplicada ao estudo de alimentos
82 RMN aplicada ao estudo de alimentos
83 Bibliografia recomendada Fundamentos de RMN: Spin Dynamics, M. H. Levitt, John Wiley & Sons, 2002, Didático, excelentes figuras!!! Principles of nuclear magnetic resonance in one and two dimensions, R. R. Ernst, G. Bodenhausen, A. Wokaun, Oxford, 1987, Material de referência para uma descrição aprofundada. Ressonância magnética nuclear: fundamentos, métodos e aplicações, V. M. S. Gil, C. F. G. C. Geraldes, Fundação Calouste Gulbekian, 1987, Razoavelmente simples mas completo, em português (de Portugal).
84 Bibliografia recomendada Aplicações em biotecnologia artigos de revisão: NMR tools for biotechnology, P. A. Keifer, Current Opinion in Biotechnology, 10, 34-41, NMR-based plant metabolomics: where do we stand, where do we go?, H. K. Kim, Y. H. Choi, R. Verpoorte, Trends in Biotechnology, 29, , NMR in biotechnology, M. A. Hemminga, J. Wisser, Journal of Biotechnology, 77, 1-3, 2000.
85 Bibliografia recomendada Aplicações na pesquisa de fármacos: Solid-state NMR spectroscopy in pharmaceutical resarch and analysis, R. Berendt et al., Trends in Analytical Chemistry, 25, , Aplicações na ciência de alimentos: Magnetic resonance imaging in food science, B, Hills, Wiley, Imagens por RMN: Novas Imagens do Corpo, H. Panepucci et al., Ciência Hoje, 4, 46-56, 1985.
86 Contato: dúvidas, comentários, sugestões, etc, Departamento de Física - UFES jairccfreitas@yahoo.com.br RMN: Fundamentos e Aplicações -
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