SALVADOR VIANA GOMES JUNIOR

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1 UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO GRANDE DO NORTE FACULDADE DE ENFERMAGEM PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SAÚDE E SOCIEDADE MESTRADO ACADÊMICO EM SAÚDE E SOCIEDADE PLASTICIDADE INDUZIDA PELA ADIÇÃO DO MEIO CONDICIONADO DE NERVO ISQUIÁTICO NA PRESENÇA DA METILPREDNISOLONA EM CULTURA DA MEDULA ESPINAL DE RATOS NEONATOS SALVADOR VIANA GOMES JUNIOR Mossoró-RN 2015

2 SALVADOR VIANA GOMES JUNIOR PLASTICIDADE INDUZIDA PELA ADIÇÃO DO MEIO CONDICIONADO DE NERVO ISQUIÁTICO NA PRESENÇA DA METILPREDNISOLONA EM CULTURA DA MEDULA ESPINAL DE RATOS NEONATOS Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Saúde e Sociedade, da Universidade do Estado do Rio Grande do Norte, como requisito final para obtenção do grau de Mestre em Saúde e Sociedade. Orientador: Profº. Drº. Fausto Pierdoná Guzen Mossoró-RN 2015

3 Catalogação da Publicação na Fonte. Universidade do Estado do Rio Grande do Norte. Gomes Junior, Salvador Viana Plasticidade Induzida Pela Adição Do Meio Condicionado De Nervo Isquiático Na Presença Da Metilprednisolona Em Cultura Da Medula Espinal De Ratos Neonatos / Salvador Viana Gomes Junior Mossoró, RN, f. Orientador(a): Prof. Dr. Fausto Pierdoná Guzen Dissertação (Mestrado). Universidade do Estado do Rio Grande do Norte. Mestrado Acadêmico Em Saúde E Sociedade 1. Metilprednisolona. 2. Nervo Isquiático. 3. Plasticidade Neuronal. I. Guzen, Fausto Pierdoná. II. Universidade do Estado do Rio Grande do Norte. III.Título. UERN/ BC CDD Bibliotecário: Sebastião Lopes Galvão Neto CRB - 15/486

4 UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO GRANDE DO NORTE FACULDADE DE ENFERMAGEM PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SAÚDE E SOCIEDADE MESTRADO ACADÊMICO EM SAÚDE E SOCIEDADE A COMISSÃO ABAIXO ASSINADA APROVA A DISSERTAÇÃO INTITULADA PLASTICIDADE INDUZIDA PELA ADIÇÃO DO MEIO CONDICIONADO DE NERVO ISQUIÁTICO NA PRESENÇA DA METILPREDNISOLONA EM CULTURA DA MEDULA ESPINAL DE RATOS NEONATOS Elaborado por, SALVADOR VIANA GOMES JUNIOR COMO REQUISITO FINAL PARA OBTENÇÃO DO TITULO DE MESTRE EM SAÚDE E SOCIEDADE BANCA EXAMINADORA: Prof. Dr. Fausto Pierdoná Guzen (Orientador) Prof. Thales Allyrio Araújo de Medeiros Fernandes UERN/RN Prof. Dr. João Marcelo Azevedo de Paula Antunes UFERSA/RN Mossoró-RN 2015

5 DEDICATÓRIA À minha família, especialmente aos meus pais Salvador Viana e Helania de Oliveira, dedico a vocês este trabalho. Obrigado pelo exemplo de luta e trabalho, pelos valores de vida ensinados, pela confiança e amor.

6 AGRADECIMENTOS Primeiramente a Deus, pelas incontáveis vezes que fraquejei e ele me deu forças para continuar, por sua proteção e bênçãos em minha vida, Aos meus pais Salvador Viana e Helania de Oliveira, por todo incentivo, apoio e suporte durante este período, sem o qual não teria sido possível prosseguir. Obrigado pelo apoio incondicional. A minha esposa Mônica Ferreira pelo, por sua paciência, amor e respeito que a cada dia nos une mais. Ao meu irmão Bruno Viana pelo estímulo ao meu estudo. Ao meu professor e orientador, Fausto Pierdoná Guzen, por ter abraçado a proposta, por ter me ensinado muito mais que ciência, me deu exemplos de caráter humano, de conquistas fruto do trabalho. Obrigado por essa experiência enriquecedora e inesquecível. Ao professor Eudes Euler, pelos vários ensinamentos das técnicas realizadas, pelo companheirismo, por me ensinar o caminho para ser um verdadeiro cientista. Ao amigo Cleber Mahlmann, pela parceira na pesquisa, pelo exemplo de competência e profissionalismo que você trás. A todos os companheiros de pesquisas do laboratório de Neurologia Experimental. Em especial ao professor Rodolfo Lopes pela amizade e conhecimento compartilhado, meu muito obrigado. Ao professor Worgelsanger Pereira, por disponibilizar o acesso ao laboratório de biologia molecular. Pelos convites de palestra, muito obrigado.

7 A todos os professores do Programa de Pós-Graduação em Saúde e Sociedade, pelo conhecimento compartilhado durante esse tempo de convivência. Foi um privilégio a oportunidade de participar de nossos encontros e discutir saúde com vocês. A todos os professores e profissionais da Universidade Potiguar UnP. Em especial as amigas Claudielly Ferreira e Kísia Melo pelo apoio proporcionado e pelas longas conversas de incentivo, pelas várias vezes que foram um ombro solícito, meu muito obrigado. Aos combatentes do departamento de Radiologia João Lindemberg, Kellyson Lopes e Fábio Correa vocês foram peças chaves para conclusão desse trabalho. Obrigado por tudo amigos. A todos os profissionais, bem como aos pacientes do departamento de Fisioterapia da prefeitura municipal de Baraúna, parceiros de trabalho diário, obrigado por compreender as ausências. Aos amigos encontrados no programa em especial a Lorenna Karen que com sua irreverência fazia de nossos encontros uma alegria total. E ao amigo Márcio Barreto detentor de simplicidade e carisma invejável, vocês tornaram-se inestimáveis. Aos meus inestimáveis amigos de minha terra, obrigado pelos momentos de descontração frente a tanta tensão, pelos momentos felizes que tenho ao lado de vocês. E agradeço em especial aos amigos Jéssica Lemos e Júnior Leví que me auxiliaram diretamente no desenvolvimento deste trabalho. Por fim quero agradecer aos meus queridos alunos, o estímulo final para buscar essa conquista. A vocês meus sinceros agradecimentos.

8 SUMÁRIO RESUMO ABSTRACT I INTRODUÇÃO O Problema Objetivos Objetivo Geral Objetivo Específico Justificativa II REVISÃO DE LITERATURA Organização Morfológica e Funcional do Nervo Isquiático Aspectos Anatômicos e Fisiológicos da Medula Espinal Lesões do Sistema Nervoso Plasticidade e Regeneração do Sistema Nervoso Central e Periférico Metilprednisolona III MATERIAIS E MÉTODOS Desenho Experimental Extração e Cultivo das Células da Medula Espinal Extração e Cultivo dos Explantes de Nervo Isquiático Subcultivos das Células da Medula Espinal e os Grupos Experimentais Marcações Imunocitoquímica Dosagem dos Íons Análises dos Dados IV RESULTADOS Mudanças Morfológicas e Expansão das Células Gliais Mudanças Morfológicas e Expansão das Células Neuronais Fenótipo das Células Gliais e Neuronais Dosagem dos Íons no Meio de Cultura V DISCUSSÃO VI CONCLUSÂO VII REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 89

9 LISTA DE QUADROS E TABELAS TABELAS Tabela 1. Descrição da amostra dos grupos de acordo com número de células gliais...49 Tabela 2. Descrição da amostra dos grupos de acordo com área de células gliais...52 Tabela 3. Descrição da amostra dos grupos de acordo com perímetro de células gliais...55 Tabela 4. Descrição da amostra dos grupos de acordo com número de células neuronais...61 Tabela 5. Descrição da amostra dos grupos de acordo com área de células neuronais...64 Tabela 6. Descrição da amostra dos grupos de acordo com perímetro de células neuronais...67 QUADROS Quadro 1. Lista de anticorpos primários...38

10 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Aspectos anatômicos do nervo isquiático...21 Figura 2: Membranas de revestimento nervoso...22 Figura 3: Vias de comunicação...24 Figura 4: Fases de regeneração nervosa...28 Figura 5. Estrutura química da Metilprednisolona...30 Figura 6. Extração da medula espinal e preparados da medula para a suspensão celular...33 Figura 7. Troca de meio de cultura celular...34 Figura 8. Acesso cirúrgico ao nervo isquiático...34 Figura 9. Nervo isquiático dissecado...35 Figura 10. Remoção do Epineuro e Perineuro do nervo isquiático...35 Figura 11. Placas P60 com explantes de nervo isquiático...36 Figura 12. Células precipitadas após centrifugação...37 Figura 13. Delineamento do estudo: Formação dos grupos e observação celular...37 Figura 14. Campos de observação celular nas P Figura 15. Identificação dos meios de cultura para dosagem de íons...41 Figura 16. Células com morfologia fibroblastóide...42 Figura 17. População de células de Schwann...43 Figura 18. Aspectos Morfológicos das células gliais e células...44 Figura 19. Morfologia das células após formação dos grupos experimentais...45

11 Figura 20. Número de células gliais observadas em cada grupo experimental de acordo com o dia de observação...50 Figura 21. Número de células gliais observadas nos dias 1,2 e 3 de acordo com o grupo experimental...51 Figura 22. Área de células gliais observadas em cada grupo experimental de acordo com o dia de observação...53 Figura 23. Área de células gliais observadas nos dias 1,2 e 3 de acordo com o grupo experimental...54 Figura 24. Perímetro de células gliais observadas em cada grupo experimental de acordo com o dia de observação...56 Figura 25. Perímetro de células gliais observadas nos dias 1,2 e 3 de acordo com o grupo experimental...57 Figura 26. Número de células neuronais observadas em cada grupo experimental de acordo com o dia de observação...62 Figura 27. Número de células neuronais observadas nos dias 1,2 e 3 de acordo com o grupo experimental...63 Figura 28. Área de células neuronais observadas em cada grupo experimental de acordo com o dia de observação...65 Figura 29. Área de células neuronais observadas nos dias 1,2 e 3 de acordo com o grupo experimental...66 Figura 30. Perímetro de células neuronais observadas nos dias 1,2 e 3 de acordo com o grupo experimental...68 Figura 31. Perímetro de células neuronais observadas em cada grupo experimental de acordo com o dia de observação...69 Figura 32. Células do G 2 submetidas a imunofluorecência do anticorpo β Figura 33. Células do G2 submetidas a imunofluorecência do anticorpo GFAP...71

12 Figura 34. Células do G2 submetidas a imunofluorecência do anticorpo NF Figura 35. Células do G3 submetidas a imunofluorecência do anticorpo GFAP...72 Figura 36. Células do G3 submetidas a imunofluorecência do anticorpo NeuN...72 Figura 37. Células do G3 submetidas a imunofluorecência do anticorpo OX Figura 38. Células do G4 submetidas a imunofluorecência do anticorpo GFAP...73 Figura 39. Células do G4 submetidas a imunofluorecência do anticorpo NeuN...74 Figura 40. Células do G5 submetidas a imunofluorecência do anticorpo OX Figura 41. Micromol por litro de sódio de acordo com cada grupo experimental...76 Figura 42. Micromol por litro de cálcio de acordo com cada grupo experimental...77 Figura 43. Micromol por litro de potássio de acordo com cada grupo experimental..78

13 LISTA DE ABREVIATURAS AVL: Analisador de eletrólitos c: grau Celsius μg: Micrograma μl: Microlitro μm: Micromolar μmol/l: micromol por litro μm2: Micrômetro quadrado BDNF: Fator neurotrófico derivado do cérebro BSA: Albumina de soro de boi β Tubulina: marcador neuronal Ca: Cálcio CNTF: Fator neurotrófico ciliar CO2: Gás Carbônico CS: Célula de Schwann CEEA: Comissão de Ética de experimentação animal D-10: Meio de cultura DMEM: Dulbeco s Modified Eagle s Medium EDTA: Ácido etilenodiamino tetra-acético ELA: Esclerose Lateral Amiotrófica FGF: Fator de crescimento fibroblástico GDNF: Fator neurotrófico derivado da glia GFAP: Proteína ácida fibrilar glial K: Potássio HRTM: Hospital Regional Tarcísio Maia IGF: Fator de crescimento tipo insulina IL-1: Interleucina-1 L-15: Meio Leibovitz 15 ml: Mililitro MAP-2: Proteína associada ao Microtúbulo 2 mm: Milímetro ME: Medula Espinal MEC: Matriz Extra Celular

14 MCNI: Meio condicionado de nervo isquiático MP: Metilprednisolona Na: Sódio NeuN: Marcador nuclear neuronal NF-200: Neurofilamento 200 NGF: Fator de crescimento do nervo NT3: Neurotrofina 3 OX-42: Anticorpo primário PBS: Tampão fosfato P60: Placas de petri 60 milímetros rpm: Rotações por minuto SNC: Sistema nervoso central SNP: Sistema nervoso periférico TGF: Fator transformador de crescimento UERN: Universidade do Estado do Rio Grande do Norte UFRN: Universidade Federal do Rio Grande do Norte

15 RESUMO O traumatismo se configura como uma importante causa de morbidade e mortalidade em todo o mundo. Um crescente problema que vem afetando a população jovem que gozam de boa saúde e estão economicamente ativos. Como consequência desse evento surge à lesão Medular (LM). Sua fisiopatologia consiste em injúrias divididas em duas etapas: lesão primária que consiste no dano mecânico proporcionado pelo mecanismo de trauma. Enquanto que a segunda lesão trata-se de um processo patológico ocasionado pela cascata de eventos bioquímicos provenientes da lesão, os quais podem ser minimizados pela ação de drogas neuroprotetoras. Evidências mostram a influência da Metilprednisolona (MP) como um forte componente anti-inflamatório, combatendo a oxidação lipídica e reduzindo assim a degeneração do nervo. Associado a esse fármaco utilizamos o meio condicionado de nervo isquiático (MCNI) o qual propicia um ambiente rico em substância que influênciam no crescimento de fibras nervosas lesadas no Sistema Nervoso Periférico (SNP). Nessa perspectiva, esse estudo teve como objetivo analisar a plasticidade celular da medula espinal na presença de MCNI de ratos diante da adição da MP. O crescimento e a morfologia celular foram avaliados ao longo de 72 horas. Além disso, a avaliação fenotípica foi feita a partir da imunocitoquímica para GFAP, OX-42, MAP-2, β-tubulina III, NeuN e NF-200 no terceiro dia de cultivo na oportunidade também foi realizada a dosagem de íons presente no meio de cultura. As células cultivadas com meio condicionado sozinho ou combinado com MP demonstraram características morfológicas semelhantes a neurônios e células gliais e uma significativa atividade proliferativa nos grupos experimentais ao longo dos dias. As células cultivadas com meio condicionado desprovido de tratamento com MP adquiriram fenótipo neuronal e glial demostrando imunorreatividade para GFAP, β-tubulina III e NF-200. As células cultivadas com meio condicionado com adição de MP expressaram GFAP, OX-42 e NeuN. O estudo possibilitou a plasticidade de células da medula espinal em linhagens neuronal e glial e abriu perspectivas para busca de novas técnicas com terapia e transdiferenciação celular. PALAVRAS CHAVE: Metilprednisolona, Nervo Isquiático, Plasticidade Neuronal; Técnicas de Cultura de Células.

16 ABSTRACT Trauma is configured as an important cause of morbidity and mortality worldwide. A growing problem that is affecting young people who are in good health and are economically active. As a result of this event comes to the Spinal Cord injury (SCI). Its pathophysiology is divided injuries into two stages: primary lesion consisting of mechanical damage provided by the trauma mechanism. While the second lesion it is a pathological process caused by the cascade of biochemical events arising from the injury, which can be minimized by the action of neuroprotective drugs. Evidence shows the influence of methylprednisolone (MP) as a strong anti-inflammatory component, fighting lipid oxidation and thereby reducing nerve degeneration. Drug use associated with this conditioned medium of sciatic nerve (CMSN) which provides an environment rich in substance that influence the growth of injured nerve fibers in the peripheral nervous system (PNS). From this perspective, this study aimed to analyze the cellular plasticity of the spinal cord in the presence of CMSN rats before the addition of the MP. Growth and cell morphology were assessed over 72 hours. In addition, phenotypic analysis was performed from immunocytochemistry for GFAP, OX-42, MAP-2, β-tubulina III, NeuN and NF-200 the third day of cultivation was also carried out on the opportunity of dosing ions present in the culture medium. Cells cultured with conditioned medium alone or combined with MP showed morphological features similar to neurons and glial cells and a significant proliferative activity in experimental groups over the day. Cells cultured with conditioned medium devoid of treatment with MP acquired neuronal and glial phenotype demonstrating immunoreactivity for GFAP, β-tubulina III and NF-200. Cells cultured with conditioned medium with added MP expressed GFAP, OX-42 and NeuN. The study enabled the plasticity of spinal cord cells in neuronal and glial lineages and opened prospects to pursue new techniques with cell therapy and transdifferentiation. Keywords: Cell Culture Techniques; Methylprednisolone; Neuronal Plasticity; Sciatic Nerve.

17 16 I INTRODUÇÃO A Lesão Medular (LM) constitui-se um evento problemático na esfera da saúde pública, por se tratar de uma das lesões mais devastadoras do ponto de vista orgânico, psicológico e social, configurando-se como um grande desafio, no âmbito da saúde, devido suas múltiplas facetas e seu poder incapacitante (LIM; TOW, 2007). Sua incidência é alta e afeta todos os países, sejam desenvolvidos ou não, sendo que nos Estados Unidos, por exemplo, são descritas taxas de incidências de 906 por milhão de habitantes/ano (SINGH et al., 2014), fator este que demanda custos com o tratamento nas cifras de 9,7 bilhões de dólares/ano (WYNDAELE; WYNDAELE, 2006). Já No Brasil as taxas de incidência no final do século passado permeavam em torno de 40 casos por milhão de habitantes/ano (GREVE, 1997). Já no início do novo século percebe-se um aumento na incidência para 71 novos casos por milhão de habitantes/ano (MASINI, 2001). Embora ainda não muito bem definidos, os gastos públicos com essa população giram em torno de 9 bilhões de reais/ano quase um terço de todo o investimento em saúde pública no país (FRISON et al., 2013). Estima-se que anualmente no Brasil ocorram mais de 10 mil novos casos de LM, com o trauma sendo a causa predominante (MASINI, 2000; CITERO; MEDERDRUT; FONTES, 2012). Esta afecção acomete principalmente jovens do sexo masculino entre 30 anos de idade, acarretando grande impacto econômico (SINGH et al., 2014), pois retira do mercado de trabalho esta população que se encontrava na plenitude da idade produtiva e independência funcional, e posteriormente ao evento passam para um estágio em que necessitam da ajuda de terceiros, redução da autoestima e aumento do custo de vida com os tratamentos (Cristante; Taricco; Colares, 2010). A principal causa da LM é o traumatismo, oriundos de acidentes automobilísticos (SINGH et al., 2014), mas há ainda outras causas como lesões diretas por feridas penetrantes (armas brancas, projéteis) ou lesões indiretas como consequências de fraturas ou deslocamentos vertebrais (RUBIN; et al, 2006). A fisiopatologia da lesão nervosa consiste em injúrias que estão divididas em duas etapas: lesão primária e secundária. A primeira consiste no dano mecânico proporcionado pelo mecanismo de trauma. Enquanto que a segunda trata-se de um processo patológico iniciado pela primeira lesão, mas, com apresentação clínica

18 17 tardia, ocasionados pela cascata de eventos bioquímicos (BOTELHO et al., 2009). Indivíduos com essas afecções podem cursar com várias disfunções que interferem negativamente nas atividades funcionais e na qualidade de vida, tais como: déficits de equilíbrio, tônus muscular e flexibilidade que consecutivamente interferem na marcha (CITERO; MEDERDRUT; FONTES, 2012). Como consequência essa população pode vir apresentar complicações secundárias necessitando de um maior tempo de contato com os serviços de saúde. Dentre as complicações estão inclusas: déficits musculoesquelético, respiratório, gastrintestinal e distúrbios urológicos, que posteriormente levam a novos processos de hospitalização e atendimento domiciliar (CHIKUDA et al., 2014). O que demanda mais gastos aos cofres públicos com o tratamento e cuidado a estes pacientes (FRISON et al., 2013). A capacidade regenerativa dos neurônios, após uma lesão, depende muito do seu microambiente, uma vez que após a lesão do nervo por esmagamento ou axotomia, o coto distal do nervo periférico sofre degeneração Walleriana. A regeneração ainda depende de alguns fatores, como: intervenções terapêuticas composta de transplantes regenerativos, drogas neuroprotetoras, fatores neurotróficos, eliminação de moléculas inibidoras, estimulação muscular (HOULE; COTE, 2013) mielinização do axônio, espessura da bainha de mielina, dentre outros (POWERS et al., 2013). As células do sistema imune migram para o local da lesão onde juntamente com as células Schwann auxiliam na depuração de detritos, degeneração do coto distal e regeneração do coto proximal, este processo leva à remoção e reciclagem de fragmentos derivados do axônio gerando um ambiente permissivo para a regeneração axonal (MAKWANA; RAIVCH, 2005). Dessa forma é importante lembrar que a regeneração nervosa da parte central difere da periférica, uma vez que no central há estimulação de genes de proliferação e crescimento, porém, não há microambiente favorável a este crescimento, e os própios oligodendrócitos produzem fatores que inibem o crescimento axonal, as células da glia formam uma cicatriz glial que também inibe o crescimento axonal. E ainda tem-se o déficit na atuação dos astrócitos e micróglia que falham na remoção de restos de mielina, levando meses para serem removidos, dificultando o processo de regeneração. Já quando ocorre lesão nervosa periférica, há imediata ação genética e bioquímica para reorganização celular, iniciando com a ativação de genes do desenvolvimento até a reorganização do citoesqueleto. Por fim

19 18 salienta-se a síntese de diversas proteínas de crescimento para a reabilitação funcional na região afetada, e síntese de neurotransmissores, canais iônicos e receptores moleculares no intuito de se restabelecer a função da fibra periférica lesionada (LENT, 2014). No campo farmacológico têm surgido propostas consideráveis a serem analisadas. O National Spinal Cord Injury Study (NASCIS) publicou que altas doses de succinato sódico de metilprednisolona (MP), administradas até oito horas após a lesão, 30 mg/kg no início, sendo essa dose seguida de infusão de 5,4mg/kg/h, durante 23h, melhoravam a recuperação neurológica (CRISTANTE; TARICCO; COLARES, 2010; BRACKEN, 2012). Contudo, a aplicabilidade da MP é cercada de discussões, onde esta apresenta vários fatores negativos como complicações por imunossupressão (DIMAR et al., 2010), mas também há estudo que evidenciam os benefícios no aumento da estimulação de fatores neurotróficos, aumento da produção de proteínas essenciais a recuperação neuronal, entre outras ações (MENG et al., 2011). 1.1 PROBLEMA A LM é uma importante e crescente causa de deficiência no mundo. Acomete o tecido nervoso que possui uma capacidade mínima de regeneração, com isso a chance de ter alguma recuperação motora ou neurológica é, assim, mínima. Além da lesão física primária há a lesão bioquímica secundária que pode agravar ainda mais a situação do paciente. Contudo, as células nervosas se esforçam na busca pela regeneração após a lesão, principalmente as células nervosas periféricas. Nesse contexto surge a ideia de trabalhar um meio celular contendo extratos proteicos do nervo periférico e sua associação a uma droga capaz de inibir a exacerbação inflamatória da lesão nervosa e observar às implicações da adição desses compostos no ambiente da lesão celular.

20 OBJETIVOS OBJETIVO GERAL Analisar a plasticidade celular da ME na presença de MCNI, na adição ou não, de MP OBJETIVOS ESPECÍFICOS Avaliar a plasticidade das células da ME promovida pelo MCNI e pela adição de MP a partir dos seguintes parâmetros: Evolução de número, área, perímetro e morfologia celular por 72 horas; A imunorreatividades das proteínas gliais: proteína ácida fibrilar glial (GFAP), marcador microglial OX-42 através da imunocitoquímica das células gliais da ME; A imunorreatividades da proteína associada ao microtúbulo-2 (MAP-2), β- tubulina III, das proteínas neuronais de neurofilamentos 200 (NF-200) e da proteína nuclear neuronal (NeuN) através da imunocitoquímica das células da ME; A dosagem dos íons e sódio, potássio e cálcio no meio de cultura utilizado. 1.3 JUSTIFICATIVA A relevância desse estudo decorre da necessidade na neurociência de entender e propiciar um microambiente que possibilite a regeneração axonal central, com posterior reversão das sequelas tão abundantes na clínica neurológica. Por esse motivo é que este trabalho se propõe a modificar um meio celular de nervo periférico, associá-lo a uma droga reconhecida pelo seu potencial inibidor do processo inflamatório e peroxidação lipídica, com um potencial efeito neuroprotetor e observar seus efeitos sob a plasticidade celular do sistema nervoso central (SNC).

21 20 II REVISÃO DE LITERATURA 2.1 ORGANIZAÇÃO MORFOLÓGICA E FUNCIONAL DO NERVO ISQUIÁTICO O nervo isquiático (NI) faz parte da rede neural denominada Sistema Nervoso Periférico (SNP) que por sua vez compreende os nervos, gânglios e terminações nervosas. Este nervo configura-se o maior nervo do corpo, suas ramificações abrangem o epitélio do pé, perna, os músculos da coxa, todos os músculos da perna e pé, e ainda faz participação das articulações dos membros inferiores. Sua origem está no plexo lombossacral, denominação esta ao conjunto de todas as divisões primárias ventrais dos nervos lombares, sacrais e coccígeos. Sendo o nervo a continuação da principal parte do plexo sacral, originando-se de L4, 5 e S1, 2, 3 (VAN DE GRAAFF, 2003), (figura 1). Emerge da pelve através do forame isquiático maior, estendendo-se da borda inferior do músculo piriforme até o terço distal da coxa, aqui por sua vez ele subdivide-se em duas grandes divisões terminais, os nervos: tibial e fibular comum. Na parte principal de seu trajeto ele repousa sobre a superfície posterior do osso ísquio. Entre o túber isquiático e o trocanter maior do fêmur, cruzando os músculos obturatório interno, os gêmeos e o quadrado do fêmur. É acompanhado pelo nervo cutâneo posterior da coxa e artéria glútea inferior, e coberto pelo glúteo máximo. Mais distalmente, situa-se sobre o adutor magno e é cruzado obliquamente pela porção longa do bíceps femoral (Gray; Goss, 1998), (figura 1).

22 21 Figura 1: Aspectos anatômicos do nervo isquiático. Adaptado: Maier, Os nervos por sua vez são feixes de fibras nervosas, compostos por axônios e circundados por células de Schwann. Devido em seu conteúdo possuir mielina e colágeno, os nervos adquirem coloração esbranquiçada, com exceção de casos raros, onde nervos muitos finos são formados somente por fibras amielínicas. Comumente estão agrupados e envolvidas por 3 camadas de tecido conjuntivo o endoneuro, perineuro e epineuro (figura 2), internamente circundando cada axônio e conjunto de células de Schwann, consta-se o endoneuro, composto por delicadas fibras colágenas discerníveis à microscopia eletrônica. Por sua vez circundando o axônio, células de Schwann e o endoneuro há o perineuro, o qual constitui uma bainha de várias camadas de células achatadas e justapostas com quantidade variável de tecido conjuntivo. A união proveniente das junções celulares oclui a passagem de muitas macromoléculas, desta forma o perineuro desempenha uma função de proteção mecânica e barreira contra agressores. Além disso, os nervos possuem ainda um componente externo que atua na sustentação dos troncos nervosos constituído de uma camada fibrosa mais externa e densa de tecido conjuntivo, denominada epineuro, o qual tem como função revestir e preencher o nervo entre os espaços deixado entre os feixes de fibras nervosas, este se encontra

23 22 ainda em continuidade com a membrana dura-máter assim como as células perineurais estão em continuidade com a membrana pioaracnoide do SNC (PIÑA- OVIEDO; ORTIZ-HIDALGO, 2008; VARGAS, 2009). Figura 2: Membranas de revestimento nervoso: seta azul=epineuro; seta preta=perineuro; seta vermelha=endoneuro. Adaptado de Vargas (2009). Os feixes de fibras nervosas são importantíssimos, pois estabelecem comunicação entre os centros nervosos, os órgãos da sensibilidade e os efetores (músculos, glândulas). Possuem fibras aferentes e eferentes. As aferentes levam para os centros as informações obtidas no interior do corpo e no meio ambiente. As fibras eferentes levam impulsos dos centros nervosos para os órgãos efetores comandados por esses centros (figura 3). Os nervos que possuem apenas fibras de sensibilidade (aferentes) são chamados de sensitivos, e os que são formados apenas por fibras que levam a mensagem dos centros para os efetores são os nervos motores. A maioria dos nervos possui fibras dos dois tipos, portanto, nervos mistos. Esses nervos possuem fibras mielínicas (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2013). Não obstante, entre as várias interações celulares existentes nos organismos biológicos cabe destacar aquela que mantém as células unidas, pois estas devem estar coesas para assim constituir uma estrutura multicelular organizada. As junções criam vínculos possibilitando a comunicação, permitindo o compartilhamento de sinais que coordenam e controlam a expressão gênica afetando assim o comportamento celular. Essa união pode ser proveniente de interações diretas

24 23 célula a célula ou por meio de material secretado por elas, denominado matriz extracelular (MEC), que por sua vez trata-se de um conjunto de proteínas e polissacarídeos especializados, os quais controlam a orientação da estrutura interna e como as células se movem no organismo, orientando-as durante o crescimento, desenvolvimento e o reparo (ALBERTS et al., 2010). A MEC tem sua maior representação no tecido conjuntivo, conferindo a este as propriedades de resistência a forças mecânicas, nesse tecido ás células encontram-se amplamente espaçadas e há uma alta quantidade de MEC rica em polímeros fibrosos, especialmente colágeno, as proteínas fibrosas da família do colágeno são as proteínas mais abundantes nos mamíferos, sendo os principais componentes da pele e dos ossos. Diferentes combinações de isoformas de cadeia α são enroscadas em uma tríplice hélice, dentre essas isoformas tem-se o colágeno IV, que por sua vez associa-se aos proteoglicanos: perlecana e nidogênio, os quais possuem sítios ativos que reagem com a laminina e com as cadeias de colágeno IV, conectando as cadeias de colágeno a laminina, estas formam tramas que contribuem para a estrutura das lâminas basais (ROBERTIS; HIB, 2006). É importante destacar que nas junções neuromusculares é a lâmina basal que separa a membrana plasmática do nervo e do músculo, sendo que esta lâmina presente nas sinapses possui características químicas distintas, constituída de isoformas especiais de colágeno IV, laminina e proteoglicanos que nessa situação é denominado agrina (ALBERTS et al., 2010). Dessa maneira, compreende-se a importância desse componente no complexo processo de regeneração da lesão nervosa (DELMOTTE et al., 2009). 2.2 ASPECTOS ANATÔMICOS E FISIOLÓGICOS DA MEDULA ESPINAL A medula espinal (ME) juntamente com o encéfalo, faz parte do SNC. Ela estende-se desde a base do cérebro (na medula oblonga) atravessa o forame magno do osso occipital e segue no sentido caudal até o nível da segunda vértebra lombar (L2), em alguns casos em (L1) nos humanos, e no caso de ratos na terceira vértebra lombar (L3), possui forma cilíndrica com aproximadamente 40 cm de comprimento no humano, em imagens de corte transversal é observada uma redução no diâmetro póstero-anterior, que a deixa num formato oval.dela partem 31

25 24 segmentos, cada qual formando um par de nervos espinais que emergem da medula pelo forame intervertebral sendo protegida pela coluna vertebral, a qual é composta de vértebras individuais. Assim como o encéfalo a ME é protegida por três meninges distintas, em relação a estas, a mais externa que fica em contato com o crânio é a dura-máter, seguidamente encontra-se a aracnóide-máter e conseguinte a piamáter que fica em contato com o sistema nervoso. Auxiliando na proteção e possível encontrar ainda o líquido cerebrospinal que preenche o espaço subaracnóide (entre aracnóide e pia) protegendo contra impactos mecânicos (GRAY; GOSS, 1998). Os pares de nervos espinais que se ramificam a partir da medula se conectam com as várias partes do corpo, recebendo mensagens desses vários pontos e enviando-as para o cérebro que processa a informação e retransmitindo-as para a periferia. Existem dilatações em dois pontos distintos da medula, denominadas de intumescências, tais dilatações são ocasionadas pela aglomeração de corpos neuronais no local, sendo que a intumescência cervical está localizada entre a segunda e terceira vértebras cervicais. Os nervos que emergem desta região servem o membro superior. A intumescência lombossacral encontra-se entre a nona e a décima segunda vértebra torácica, sendo que os nervos que emergem desta região suprem os membros inferiores (VAN DE GRAAFF, 2003). Figura 3: Vias de comunicação: aferentes=traçado azul; eferentes=linha vermelha. Adaptado de Putz e Pabst, (2006).

26 25 As projeções no interior da ME são chamadas de cornos ou colunas, que são denominados de acordo com a direção na qual eles se projetam. O par de cornos posteriores se estende posteriormente e formam o sistema ascendente transportando sinais sensoriais das extremidades do corpo até a medula e de lá para o cérebro. Enquanto os anteriores se projetam anteriormente e compõem o sistema descendente que controla funções motoras dos músculos, regula funções como pressão e temperatura e transporta sinais originados no cérebro até seu destino (MACHADO; HAERTEL, 2014). A substância cinzenta presente na medula está localizada centralmente e é onde residem os interneurônios, os corpos celulares e dendritos de neurônios aferentes, eferentes, autônomos e células gliais. É envolvida por substância branca que consiste em feixes, ou tratos, em fibras mielínicas de nervos motores e sensitivos, prontos para ascender ao cérebro transmitindo informações da periferia do organismo para o cérebro e ou do cérebro para a periferia. Dessa forma, a massa cinzenta localiza-se internamente e a massa branca, externamente (o contrário do que se observa no encéfalo). Os axônios que irão constituir nervos periféricos originam-se corpos celulares de neurônios localizados na substância cinzenta do tronco cerebral, no corno anterior e lateral da ME (DAHLIN; BRANDT, 2004). A medula funciona como centro nervoso de atos involuntários como os reflexos e, também, como veículo condutor de impulsos nervosos. Os atos reflexos muitas vezes denominados de reflexos espinais acontecem automaticamente em resposta a um estímulo sensorial, são movimentos simples que envolvem poucos músculos, como exemplo quando a superfície da pele toca em algo muito quente e acontece a retirada do membro sem mesmo o indivíduo perceber. No exemplo mais clássico quando se estira a perna ao sofrer estimulo patelar numa anamnese clínica (LENT, 2004). 2.3 LESÕES DO SISTEMA NERVOSO A LM promove uma série de deficiências sensoriais e motoras, predispondo os indivíduos acometidos a uma disfunção sistêmica, que por sua vez leva um aumento da probabilidade do surgimento de complicações secundárias correlacionadas, causando limitações funcionais e redução na qualidade de vida

27 26 desse paciente (LIM; TOW, 2007). Quando saudáveis os nervos têm a capacidade de estiramento e deslizamento, para permitir aumento do comprimento necessário para o movimento fisiológico dos membros, contudo, é preciso que esses movimentos estejam em harmonia. A lesão traumática de um nervo provoca alterações em suas propriedades mecânicas e neuroquímicas, levando à perda da característica de acomodação dos movimentos, com consequente déficit mecânico. Porém, se a intensidade e a duração da compressão promovida pela lesão forem pequenas, os nervos recuperam-se imediatamente ou pouco tempo após o trauma, mas se a pressão for intensa e/ou a duração for longa, a recuperação será prolongada e frequentemente parcial (MACHADO; BIGOLIN, 2010). Em casos onde a coluna vertebral é lacerada, macerada, contundida ou comprimida por uma força de esmagamento, ou por um evento hemodinâmico, inicia-se um dano neurológico na ME que é normalmente chamado de "lesão primária Por sua vez a lesão mecânica desencadeia uma cascata de eventos de ordem bioquímica, descritos como "lesão secundária", que ocorre durante tempo de minutos a semanas após a lesão, e se configura o maior dano neurológico. Finalmente, há o aparecimento de uma fase crônica, que pode ocorrer de dias a anos após a lesão (BUNGE, 2008). Como lesão secundária tem-se o extravasamento de componentes citoplasmáticos e tóxicos pelas células lesadas que afetam células vizinhas, antes intactas, rompimento de pequenos vasos sanguíneos que acarretam em déficit na entrega de oxigênio e nutrientes para as células que não foram afetadas diretamente, desencadeando a necrose dessas células, a substância branca pode vir a cursar com desmielinização, dissolução da massa cinzenta, deposição de tecido conjuntivo, há ainda o processo cicatricial pelas células gliais, em especial astrócitos e micróglia que formam uma barreira de MEC com moléculas de proteoglicanos e sulfato de condroitina, essa barreira acaba por impedir os axônios de crescerem livremente através dela (TAOKA; OKAJIMA, 1998; JONES; MARGOLIS; TUSZYNSKI, 2003). Os neurônios dos mamíferos, quando destruídos, geralmente configura-se uma perda permanente, porém seus prolongamentos, dentro de certos limites, podem regenerar-se devido à atividade sintética dos respectivos corpos celulares. Por isso os nervos se regeneram, embora com dificuldade. Quando uma célula nervosa é destruída, as que a ela se ligam nada sofrem, exceto nos raros casos em

28 27 que um neurônio recebe impulso exclusivamente de outro. Neste caso, o neurônio que fica completamente privado de impulsos nervosos, pela destruição do outro, sofre a chamada degeneração transneuronal (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2013). 2.4 PLASTICIDADE E REGENERAÇÃO DO SISTEMA NERVOSO CENTRAL E PERIFÉRICO Diversos estudos realizados em mamíferos adultos mostraram que após uma lesão no SNC as conexões neuronais se reorganizam, graças ao crescimento dos prolongamentos dos neurônios, que formam novas sinapses para substituir as perdidas pela lesão, assim, estabelecem-se novas comunicações que, dentro de certos limites, podem restabelecer as atividades funcionais das conexões perdidas (ZHANG et al., 2014). Existem vários fatores que influenciam nesta regeneração da fibra nervosa lesionada, como a natureza e o nível da lesão, período de desnervação, tipo e diâmetro da fibra nervosa. As fibras com diâmetro e funções diferentes (motoras, sensitivas e simpáticas) se regeneram com velocidades diferentes. Outros fatores como a idade do paciente, a intercorrência de agentes químicos, temperaturas e variações individuais também interferem na regeneração de um nervo (SINGLETON et al., 2014). Essa propriedade do tecido nervoso de formar novas conexões é denominada plasticidade neuronal. A plasticidade é vasta durante o desenvolvimento embrionário, e mesmo no adulto o sistema nervoso exibe certo grau de plasticidade, ao contrário do que se supunha há muito tempo (ZHANG et al., 2014). O processo regenerativo é controlado por diversos fatores de crescimento produzidos por neurônios, células da glia e por células alvo da atividade dos neurônios como as células musculares e glandulares. Esses fatores de crescimento constituem uma família de moléculas chamadas neurotrofinas. O segmento proximal do axônio cresce e se ramifica formando vários filamentos que progridem em direção ás colunas de células de Schwann (CS). Todavia somente as fibras que penetram nessas colunas têm possibilidade de alcançar um órgão efetor. Quando a parte distal do nervo é perdida, como ocorre na amputação de um membro, as fibras nervosas crescem de maneira aleatória, formando uma dilatação muito dolorosa na extremidade do nervo, chamada de neuroma de amputação (JUNQUEIRA;

29 28 CARNEIRO, 2013). Ao contrário dos elementos nervosos, as células da glia do SNC, e as do sistema SNP (CS e células satélites dos gânglios), são dotadas de grande capacidade de proliferação. Os espaços deixados pelas células e fibras nervosas do SNC destruído por acidente ou doença são preenchidos por células da neuroglia (BIGNAMI; DAHL, 1994). No local da lesão, uma pequena extensão da fibra lesada, porém ligada ao pericário (coto proximal) degenera, mas seu crescimento se inicia logo que os restos alterados são removidos por macrófagos. No coto distal, tanto o axônio, agora separado de seu centro trófico (pericário), como a bainha de mielina degeneram totalmente, sendo fagocitados por macrófagos. Enquanto se processam essas alterações, as CS proliferam, formando colunas celulares compactas. Essas colunas servirão de guia para os axônios que vão crescer durante a fase de regeneração (DELMOTTE et al., 2009), (figura 4). Figura 4: Fases de regeneração nervosa: A=lesão;B=estímulo neurotrófico; C=proliferação do feixes de fibra; D=conexão restabelecida; E=conexão inibida pela cicatriz glial. Adaptado de Delmonte et al., (2009). A eficiência funcional da regeneração depende das fibras ocuparem as colunas de CS destinadas aos locais corretos. Num nervo misto, por exemplo, se as fibras sensitivas regeneradas ocuparem colunas destinadas às placas motoras de um músculo estriado, a função do músculo não será restabelecida. A possibilidade de recuperação funcional é aumentada pelo fato de cada fibra em regeneração dar

30 29 origem a vários prolongamentos e cada coluna receber prolongamentos de várias fibras (LIU; JIANG; JIN, 2014). 2.5 METILPREDNISOLONA A MP apresenta-se com potentes propriedades anti-inflamatória e antioxidante, é o agente mais prescrito na prática clínica, no entanto, é, simultaneamente, o mais controverso. Entre suas ações está a de inibir a atuação de células inflamatórias, peroxidação lipídica, atuando como um eliminador de radicais livres, limitando assim a resposta inflamatória (HALL; BRAUGHLER, 1982; TATOR, 1998). Sua ação baseia-se por tratar-se de um agonista de glicocorticoides sintético, hormônio esteroide que age na regulação da transcrição génica modificando-a e assim modificando as proteínas produzidas. Com isso, é capaz de inibir citocinas pró-inflamatórias, como as interleucinas IL-2 e IL-12, o interferon gama (INFg) e o fator de necrose tumoral alfa (TNFα), bem como moléculas de adesão, como a lipocortina-1, moléculas de adesão vascular (VCAM-1) e moléculas de adesão intercelular (ICAM), ou ainda enzimas, como a sintase induzida pelo óxido nítrico (INOS), a ciclooxigenase (COX2) e a fosfolipase (PLA2). Muitos genes são afetados, entre eles, aqueles responsáveis pelo sistema imune, fazendo com que haja um desvio na resposta para um padrão T helper 2 (Th2), com características antiinflamatórias dependentes do aumento de citocinas como as interleucinas IL1, IL4, IL5, IL6, IL10, IL13 e o fator estimulador de colônias proveniente de granulócitos e macrófagos (GMSF). Induz ainda a secreção do fator transformador de crescimento beta (TGFβ), capaz de reduzir a ativação do linfócito T e a proliferação celular (LONGUI, 2007). Outra faceta dos glicocorticoides está nas suas ações não-genômicas principalmente para a 1,25-vitamina D3, a progesterona e a aldosterona; eles parecem envolver os sistemas de segundos-mensageiros, incluindo a proteínoquinase C, os níveis intracelulares de cálcio e de óxido nítrico e as tirosinoquinases, aumento da síntese do mediador anexina-1 com propriedades imunossupressoras, redução da ação histamínica, diminuição da síntese de prostaglandinas, que diminuem a fosfolipase A2 (enzima que atuam sobre o

31 30 fosfolipídio produzindo ácido araquidônico, precursor de mediadores inflamatórios) e da ativação do plasminogênio (FARIA; LONGUI, 2006). Figura 5. Estrutura química da Metilprednisolona, um glicocorticoide sintético. Adaptado de Longui, (2007). Em 1979, foram publicados resultados de um estudo multicêntrico, ensaio clínico randomizado, duplo-cego, com a utilização da MP, chamado National Acute Spinal Cord Injury Study (NASCIS). Onde foi realizada a análise de 330 pacientes não revelando diferenças significantes na recuperação neurológica das funções motoras e sensoriais, entre os grupos, nas primeiras 6 semanas após a lesão do grupo com 6 meses após a lesão (BRACKEN et al., 1984). Posteriormente surgiram outros experimentos, os quais sugeriram que a dose utilizada no NASCIS não foi suficiente para induzir neuroproteção (HALL; BRAUGHLER, 1982). Com isso, em 1985, Bracken e sua equipe decidiram realizar outro ensaio clínico onde aplicaram doses de 30 mg/kg contra um placebo e um antagonista opióide que foi a naloxona. Após um período de 5 anos os 487 pacientes que participaram foram novamente avaliados e, com isso os pesquisadores relataram significativa melhora na função motora e sensorial nos 6 meses de acompanhamento dos pacientes que receberam a administração de altas doses de MP no prazo de até 8 horas após a lesão em comparação com pacientes que receberam placebo, naloxona ou MP em unidade de tempo diferentes e posteriores. Esse novo estudo foi chamado de NASCIS II (BRACKEN et al., 1992). Embora com novos resultados o NASCIS II não foi universalmente aceito. Várias questões metodológicas, científicas e dados estatísticos foram questionados e criticados (HANIGAN; ANDERSON, 1992; COLEMAN et al.,

32 ; HURLBERT, 2000; SHORT, 2000). Por exemplo, apenas mediante a estratificação dos dados foi possível obter diferenças estatísticas significativas. Fato este que levou a algumas preocupações sobre o estudo, surgiram críticas ao pequeno tamanho da amostra para os grupos que mostram efeitos benéficos. Além disso, nos resultados funcionais não houve medidas definidas em escalas para quantificar e assim avaliar se houve ou não melhorias estatisticamente significantes. Estas críticas levaram ao desenvolvimento de um terceiro estudo o NASCIS III, o qual teve inicio em 1991 sendo publicado em 1997, envolveram 499 pacientes, aumentando assim a amostra, uma medida quantitativa para os resultados no desempenho funcional foi acrescentada, o auto cuidado, mobilidade, locomoção, controle esfincteriano, comunicação e cognição social também foram avaliados com o uso da Medida de Independência Funcional (MIF). Os autores relataram que os benefício associado com a administração prolongada da droga além de 24hrs foram para os pacientes que tinham feito uso da MP dentro de até 3hrs de lesão. No entanto, os pacientes que receberam MP entre 3 e 8hrs após a lesão, demonstraram melhorias na capacidade motora com a administração da droga continuada durante 48 horas, em comparação com grupos de 24 hrs (BRACKEN, et al., 1997). Após NASCIS II e III, a administração do MP em pacientes com LM aguda tornou-se uma prática comum entre os médicos. No entanto, as críticas intensas para ambos os ensaios clínicos associados com o fato de que todos os estudos relataram um aumento estatisticamente significativo de infecções de feridas, hemorragias gastrointestinal, sepse, embolia pulmonar, pneumonia grave e morte (HURLBERT; HAMILTON, 2008). A fim de evitar efeitos secundários adversos derivados de aplicações com altas dosagens de MP, surge à ideia de buscar outros meios para uma administração adequada e eficaz. Longui, (2007), afirma haver a necessidade de um aprimoramento da utilização dos glicocrticóides associando com outros fármacos, manipulando sua aplicação para feitos mais locais, e redução das dosagens. Com isso, o seguinte trabalho propõe avaliar o quadro de plasticidade das células da ME na presença de Meio Condicionado do Nervo Isquiático (MCNI) na, adição ou não, da MP.

33 32 III MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 DESENHO EXPERIMENTAL Para a realização do experimento foram utilizados 12 animais (ratos da linhagem Wistar - Rattus novergicus), 06 destes animais com idade de 02 dias e os outros 06 animais machos com idade entre 40 a 50 dias e peso aproximado de 250 gramas que permaneceram no biotério por uma semana antes de serem utilizados, mantidos em gaiolas plásticas (30 x 16 x 19 cm) coletivas com, no máximo, três animais em cada gaiola e com temperatura média de 22 ± 2ºC, alimentados com ração padrão e água de torneira fornecida ad libitum. O projeto atendeu as normas para a realização de pesquisa em animais com todos os procedimentos, passando pela Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade do Estado do Rio Grande do Norte (UERN) aprovado e autorizado através do parecer consubstanciado CEEA/UERN n 0 007/13 (anexo 1). 3.2 EXTRAÇÃO E CULTIVO DAS CÉLULAS DA MEDULA ESPINAL As células da ME foram, coletadas de seis ratos Wistar com 2 dias de vida. Para a extração da ME foi utilizado o protocolo modificado de Cheung e colaboradores (1996). Os neonatos sofreram eutanásia como recomendado pela resolução nº 1000 do Conselho Federal de Medicina Veterinária, e realizada uma incisão longitudinal paralela a coluna vertebral, retirando todo o conteúdo da medula e colocando-a em tubo falcon de 15mL contendo 4mL de meio Leibovitz-15 (L-15: GIBCO Invitrogen Corporation). Sob fluxo laminar, teve inicio o processo de extração da medula, com auxílio de uma tesoura e uma espátula pequena (figura 6).

34 33 Figura 6. Extração da medula espinal e preparados da medula para a suspensão celular Novos tubos cônicos facon de 15mL com 4mL de meio Knockout DMEM low (Dulbecco`s modified Eagle`s medium), suplementado com 10% de soro fetal bovino e 10U/ml de penicilina G, 10μg/ml de estreptomicina e 25μg/ml de anfotericina B, todos obtidos da Cultilab foram preparados e receberam a medula extraída para realizar a suspensão celular. A suspensão foi centrifugada a 3000rpm durante cinco minutos a uma temperatura de 37 0 C, após o qual o sobrenadante foi desprezado e as células foram ressuspendidas em 1mL de meio, procedimento repetido por três vezes. Placas para cultura com 60mm (P60) para o plaqueamento foram preparadas com 1mL de soro fetal bovino, retirado e desprezado após 30 minutos, na sequência foi adicionado 4,5mL de D-10 nas P60, em seguida foi realizado o gotejamento das células recém extraídas, mantidas em estufa úmida a 37 0 C com 5% de CO2 e 95% de ar. Em seguida, foi utilizada a microscopia de luz invertida com contraste de fases para observação da adesão celular no fundo das placas. Para possibilitar um suprimento nutricional adequado, eliminar células hematopoiéticas e desprendidas, bem como possibilitar uma adequada adesão celular no fundo das placas, o meio de cultura foi trocado a cada três dias (Figura 8).