Programa Doutoral Genética Médica 2009

Transcrição

1 Programa Doutoral Genética Médica 2009 Trabalho nº 2 O trabalho poderá ser realizado individualmente ou em grupos de 2 alunos. Deverão apresentar um relatório com as respostas às perguntas colocadas até dia 5 (5ª feira) de manhã.

2 Trabalho nº 2: identificação de uma mutação do gene MYH Mutações germinais no gene MYH (MutY human homolog), pertencente ao sistema de reparação do DNA por excisão de bases (BER), têm sido associadas ao síndrome hereditário de cancro colorrectal polipótico de transmissão autossómica recessiva. Foi estudado um irmão de um doente que pretendia saber se era portador. Foi sequenciado o exão 7 onde inicialmente se tinha identificado a mutação do doente. Na figura seguinte é-lhe apresentado o electroferograma de um segmento do exão 7 da amostra de sangue periférico do irmão do doente.

3 Exão 7: Electroferograma

4 Amplificou-se um segmento que inclui os exões 5, 6 e 7. O primer forward localiza-se no fim do intrão 4 e o primer reverse no início do intrão 7. Primer Forward 5 GCAGGTCAGCAGTGTCCTCAT3 Primer Reverse 5 CTACCACCTGATTGGAGTGCAA3 1- Identificar a sequência do gene MYH amplificada 1.1 Aceder ao NCBI Abrir o link BLAST 1.3 Abrir o link nucleotide blast

5 1.4 Colocar a sequência do primer Forward e fazer BLAST

6 1.5 Aguarde até abrir toda a página. O gene MYH localiza-se no cromossoma 1. Procura uma base de dados de DNA e não de mrna. Percorra a página até encontrar esta referência, correspondente à localização da sequência. 1.6 Registe o accession number (NW_ ) e o número de localização do início do primer forward ( ) 1.7 Repita os mesmos passos para o primer reverse e registe a localização do fim do primer. Não se esqueça que no DNA vai encontrar a sequência inversa e complementar. Escreva-a primeiro e depois insira-a no BLAST.

7 Deverá obter o seguinte resultado: 1.8 Abrir o link NW_

8 Deverá aparecer a seguinte página: 1.9 Abrir o link NW_

9 1.10 Abrir em Change region Shown Escrever as referências do nº de pb da sequência NW_ correspondentes ao início do primer forward e ao fim do primer reverse que havia registado em 1.6 e 1.7 e abra em Update View.

10 Deverá aparecer a seguinte página Homo sapiens chromosome 1 genomic contig, alternate assembly (based on HuRef), whole genome shotgun sequence Comment Features Sequence LOCUS NW_ bp DNA linear CON 10-JUN DEFINITION Homo sapiens chromosome 1 genomic contig, alternate assembly (based on HuRef), whole genome shotgun sequence. ACCESSION NW_ REGION: VERSION NW_ GI: DBLINK Project:20837 KEYWORDS WGS. SOURCE Homo sapiens (human) ORGANISM Homo sapiens Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi;.. ORIGIN 1 gcaggtcagc agtgtcctca tgccaacccc tttcccccag tgtgggtctc agaggtcatg 61 ctgcagcaga cccaggttgc cactgtgatc aactactata ccggatggat gcaggtgact 121 ccaggggagg aagggaaggg tcatgggtca gaccccagat gagagcctct actttggggt 181 gggtgtagag aaggcttcct ctaccacctt cacccttgac cttgtctctt tctgcctgcc 241 tgtggctata gaagtggcct acactgcagg acctggccag tgcttccctg gaggtgagag 301 ccaccctagg gtaggggaaa taggaacgat agagggactg acgggtgatc tctttgacct 361 ctgatcctac ccacaggagg tgaatcaact ctgggctggc ctgggctact attctcgtgg 421 ccggcggctg caggagggag ctcggaaggt aaggggatgg caggagggta ggaacccagg 481 agtcttgggt gtcttataat cttgagtctt gcactccaat caggtggtag 1.11 Copie a sequência para um documento Word e sinalize a localização dos primers

11 2. Localizar o exão Retorne à home page do NCBI 2.2 Digite o accession number do mrna do MYH (NM_ )

12 2.3 Abra o link Nucleotide 2.4 Imprima a totalidade da página (5 folhas)

13 2.5 Localize o exão 7, na sequência do cdna. 2.6 Identifique a sequência deste exão na sequência do DNA do gene MYH correspondente ao segmento amplificado, que copiou para documento o Word no ponto Identificar a mutação 3.1 Agrupe as bases em codões e atribua-lhes o código do respectivo aminoácido. Foi-lhe fornecida uma tabela com o código genético. 3.2 Volte ao electroferograma da sequenciação da amostra analisada e verifique qual é a mutação. Note: O primeiro codão do exão 7, corresponde ao aminoácido 166 da proteína (esta é a terminologia mais actual; em bases de dados anteriores há menos 11 codões referenciados para este gene)

14 Elabore um relatório que inclua: - A sequência do segmento amplificado, com os primers assinalados e com as bases do exão 7 agrupadas em codões. Por baixo dos codões deve registar os símbolos dos aminoácidos correspondentes. - A identificação da mutação, utilizando a terminologia internacional (veja artigo sobre nomenclatura das mutações) - A classificação da mutação (nonsense,.) - A sua opinião, justificada, sobre o significado funcional da mutação. - A conclusão sobre o diagnóstico do consulente.