UNIVERSIDADE CASTELO BRANCO INSTITUTO QUALITTAS DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA CURSO DE PATOLOGIA CLÍNICA VETERINÁRIA

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1 UNIVERSIDADE CASTELO BRANCO INSTITUTO QUALITTAS DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA CURSO DE PATOLOGIA CLÍNICA VETERINÁRIA IMUNOFENOTIPAGEM: FERRAMENTA PROGNÓSTICA PARA LINFOMA EM CÃES E GATOS Thiago dos Santos Teixeira Rio de Janeiro, mar

2 i THIAGO DOS SANTOS TEIXEIRA Aluno de Pós-Graduação de Patologia Clínica Veterinária da UCB IMUNOFENOTIPAGEM: FERRAMENTA PROGNÓSTICA PARA LINFOMA EM CÃES E GATOS Trabalho monográfico de conclusão do Curso de Pós- Graduação em Patologia Clínica Veterinária da UCB como requisito para obtenção do Título de notorium saber em Patologia Clínica Veterinária, sob a orientação do Dr. Prof. Nayro Xavier de Alencar. Rio de Janeiro, mar. de 2008.

3 ii IMUNOFENOTIPAGEM: FERRAMENTA PROGNÓSTICA PARA LINFOMA EM CÃES E GATOS Elaborado por Thiago dos Santos Teixeira Aluno do Curso de Pós-Graduação em Patologia Clínica Veterinária Foi analisado e aprovado com Grau: Rio de Janeiro, de de Professor Orientador Rio de Janeiro, mar

4 iii RESUMO O linfoma, anteriormente conhecido como linfossarcoma, é o tumor hematopoiético de proliferação maligna que envolve células linfóides, afetando primariamente os linfonodos, em seguida os órgãos viscerais sólidos, como fígado e o baço, podendo acometer medula óssea, caracterizando uma leucemia. Esta neoplasia faz parte de 7 a 10 por cento (%) de todas as neoplasias malignas e são comuns a todas as espécies. Em pequenos animais domésticos, a incidência em cães (Canis familiaris) é bastante alta de 24 animais são acometidos para cada animais saudáveis. Em gatos (Felis catus), esta enfermidade afeta um terço de todos os tumores nesta espécie. Devido a grande incidência desta doença nestes animais, assim como no homem (Homo sapiens), vários estudos e classificações de acordo, com a sintomatologia clínica, localização anatômica do tumor, característica quanto a morfologia citológica e histológica, até mesmo imunofenotípicas foram criadas para diagnosticar e auxiliar quanto a escolha do protocolo terapêutico mais adequado e o prognóstico de cada paciente. A imunofenotipagem é uma dessas ferramentas prognósticas que classifica tanto as células linfóides, em células B ou T, quanto o comportamento celular. Além de permitir, o acompanhamento dos animais a resposta a quimioterapia instituída para cada caso, sendo esta a motivação deste estudo.

5 iv SUMÁRIO PÁGINA LISTA DE FIGURAS LISTA DE TABELAS vi vii 1. LINFOMA CLASSIFICAÇÃO DO LINFOMA CRITÉRIOS CITOLÓGICOS E HISTOLÓGICOS CRITÉRIOS CLÍNICOS LINFOMA CANINO SINAIS E APRESENTAÇÕES CLÍNICAS LINFOMA FELINO SINAIS E APRESENTAÇÕES CLÍNICAS DIAGNÓSTICO DE LINFOMA IMUNOCITOQUÍMICA: FERRAMENTA DE DIAGNÓSTICO CONHECIMENTOS GERAIS DE IMUNOLOGIA IMUNOGLOBULINAS IgG IgM ANTICORPOS POLICLONAIS ANTICORPOS MONOCLONAIS PRINCÍPIOS FUNDAMENTAIS IMUNOFENOTIPAGEM COMO FERRAMENTA PROGNÓSTICA DE LINFOMA 37

6 v 2.4. FATORES PROGNÓSTICOS EM CÃES (C. FAMILIARIS) E GATOS (F. CATUS) CONCLUSÃO REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 43

7 vi LISTA DE FIGURAS PÁGINA FIGURA 1. Diagrama mostrando a estrutura de uma molécula de imunoglobulina. ela contem duas cadeias pesadas idênticas (P) e duas cadeias idênticas leves (L). Ligações dissulfetos inter e intra cadeias (seta) contribuem para a estrutura e estabilidade da molécula. Fonte: Tizard, Figura 2- Diagrama mostrando a estrutura de uma molécula de IgG de coelho (O. cuniculus), que existe como uma subclasse única principal). As cadeias pesadas (p) e leves (l) são compostas de domínios constantes (C) e de variáveis (V) e são ligadas por pontes dissulfetos. Digestão proteolítica com papaína (...) Formando dois campos de ligação com o antígeno (Fab), enquanto a digestão com a pepsina ( ) gera um fragmento de F(ab ) 2. Fonte: Tizard, Figura 3 - Diagrama mostrando (a) as cinco subunidades de igm de camundongo (M. musculus) ligados por pontes de dissulfeto e a cadeia J para formar um anel pentamérico. cada subunidade (b) contem duas cadeias pesadas mu e duas cadeias leves (L) cada uma composta de domínios constante (C) e variáveis (V). Fonte: Tizard, Figura 4 - Diagrama esquemático mostrando o método de produção de anticorpos monoclonais. Fonte: Tizard, Figura 5 - Esquemas das principais reações imunocitoquímicas: ) Imunofluorescência direta (a) ou indireta (a`) e imunoperoxidase direta (b) ou indireta (b ) 2) Peroxidase-antiperoxidase (PAP) e avidina-biotina-peroxidase (ABC). Fonte: Tizard, 1998.

8 vii LISTA DE TABELAS PÁGINA TABELA 1. SUBTIPOS DE LINFÓCITOS CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS. TABELA 2. PROTOCOLO CITOLÓGICO E TERMOS UTILIZADOS NA AVALIAÇÃO DE CASOS DE LINFOMA. TABELA 3. ESTÁGIOS CLÍNICOS DE ANIMAIS DOMÉSTICOS COM LINFOMA TABELA 4. FATORES CONHECIDOS OU SUSPEITOS QUE AFETAM PROGNÓSTICO EM CÃES (C. FAMILIARIS) COM LINFOMA

9 8 1. LINFOMA A neoplasia primária que envolve mais comumente os linfócitos dos linfonodos é denominada de linfoma, anteriormente conhecido como linfossarcoma. (Raskin, 2001). É o tumor hematopoiético mais comum de todas as espécies domésticas e faz parte de 7 a 10 por cento (%) de todas as neoplasias malignas (Merlo et al., 2008). Ele é definido como uma proliferação maligna de células linfóides que afetam primariamente os linfonodos ou órgãos viscerais sólidos, como fígado e baço. Quando estas células envolvem a medula óssea e o sangue periférico, essa doença é denominada de leucemia (Schalm, 2000). Essas células linfóides neoplásicas apresentam características morfológicas e imunofenotípicas distintas, o que permite que existam critérios de classificação para esta enfermidade, direcionando o tratamento a ser seguido, de acordo com o caso em questão. O tratamento inclui quimioterapia sistêmica com o propósito de prolongar a vida do animal. Embora que muitos pacientes respondam a quimioterapia, a reincidiva do tumor é comum (Teske et al, 1994 e ibid 2008). As taxas de incidência em cães (Canis familiaris) foi relatada entre 24 dentre animais (ibid, 1994). Em gatos (Felis catus), o linfoma corresponde a um terço de todos os tumores nesta espécie (Vail et al., 1998).

10 9 A origem do linfoma nos animais de companhia ainda é muito desconhecida. Sabe-se que nos gatos (F. catus), algumas formas de linfoma podem estar direta ou indiretamente associado com o Vírus da Leucemia Felina (FeLV) e o Vìrus da Imunodeficiência Felina (FIV); entretanto, ainda não há evidências fortes para a origem desses tumores em cães (C. familiaris) (Schalm, 2000). Este mesmo autor cita que possa existir uma fraca associação de linfomas em cães (C. familiaris) com o uso de pesticidas ou a exposição desses animais a campos altamente magnéticos, mas ainda se necessita de mais estudos epidemiológicos sobre este assunto. Contudo, já foi sugerido um componente hereditário em alguns casos ocasionais nessa espécie. Fournel Fleury et al. (1997) cita que, como um companheiro próximo do homem (Homo sapiens sapiens), os caninos estão muito sujeitos a mesmas influências do meio ambiente que os humanos, e aqueles podem ser um modelo útil de estudos para a busca de uma etiologia provável para esta enfermidade. Contudo, ainda carece de um critério de classificação de linfomas único para aquela espécie, o que será comentado mais adiante. Os linfomas podem ser classificados segundo o seu sítio anatômico, características citológicas e histológicas e as imunofenotípicas. Este estudo enfocará apenas uma abordagem sobre as características imunofenotípicas desta doença através de algumas técnicas que serão citadas a seguir. Antes, de uma forma breve, serão comentados os critérios de classificação do linfoma e os diferentes protocolos propostos CLASSIFICAÇÃO DO LINFOMA Durante muito tempo, a classificação desta doença tem gerado controvérsias e confusão. O objetivo maior em sua classificação estaria em correlacionar a variedade dos subtipos celulares e as suas características arquitetônicas, com o seu

11 10 comportamento clínico em termos da sua resposta ao tratamento. Três esquemas de classificação foram adaptados pelos patologistas veterinários para a classificação de linfomas nodais em cães e bovinos (Bos sp.), a partir de características citológicas, histológicas e imunofenotípicas do linfoma de não-hodgkin (NHL) em humanos que tenham prognóstico e resposta a terapia. O critério morfológico deveria ser suficientemente distinto para permitir aos observadores diferençar e alcançar as mesmas conclusões (Schalm, 2000). Segundo este mesmo autor, há mais de cinqüenta anos foi proposto um esquema de classificação em que se avaliava o padrão de crescimento do linfoma, se este era folicular ou difuso, e as características citológicas dos linfócitos malignos, se eles eram bem ou fracamente diferenciados ou histiocíticos. Contudo, um padrão folicular de crescimento é visto em poucos cães (C. familiaris) com NHLs, diferentemente do que acontece nos humanos. E, por esse esquema, a maioria dos linfomas caninos foram classificados como linfomas histiocíticos difusos ou linfomas linfocíticos pobremente diferenciados. Assim, esse esquema em que se levava em consideração apenas a morfologia, apresentou-se insuficiente para definir e distinguir a maioria dos tipos de linfomas existentes. A classificação a seguir que chamou a atenção dentre outras que foram propostas foi a de Kiel (Lennert et al., 1978), em que nelas incluíam pela primeira vez a imunofenotipagem dos linfócitos malignos (linfócitos B e T) juntamente com o critério morfológico de classificação. A imunofenotipagem foi levada em consideração, quando foram disponíveis um pequeno número de marcadores monoclonais para a espécie canina (Fournel Fleury et al., 1997). Porém, nenhuma tentativa foi feita para correlacionar o grau do linfoma com o histórico do paciente, a sua resposta a terapia ou a sua sobrevivência a doença, permitindo que surgissem várias classificações baseados neste esquema na Europa nos anos de 1970 (Schalm, 2000).

12 11 O Instituto Nacional do Câncer, do inglês Nacional Cancer Institute (NCI) nos Estados Unidos (EUA) tentou unificar, dentre esses muitos sistemas prospostos, a partir do esquema de Kiel para facilitar as comparações clínicas dos casos e das respectivas respostas ao tratamento. Avaliou-se os critérios clínicos de sobrevivência do paciente humano com a morfologia dos linfócitos neoplásicos, mas não se referia a origem da célula do linfoma. Conforme Schalm (2000), a mais recente classificação em patologia humana proposta foi a Classificação de Neoplasias Linfóides Revisadas por Americanos e Europeus, do inglês Revised European-American Classification of Lymphoid Neoplasms (REAL). Ela ainda não foi avaliada para as espécies animais. Contudo, em humanos, esse esquema carece de informações ao clínico sobre a biologia e a progressão do tumor e necessita de análise citogenética e detalhes fenotípicos para a definição da lista de entidades linfoproliferativas que este esquema oferece. Por isso, esse esquema não terá ainda muito valor para a Medicina Veterinária. A base principal para a classificação dos linfomas na Medicina Veterinária está na arquitetura, morfologia celular e taxa de mitose do tumor. Além do excelente valor da imunohistoquímica do tumor (Schalm, 2000). Atualmente, devido a discrepância morfológicas entre os linfomas, utiliza-se a classificação de Kiel atualizada (Lennert e Feller, 1991), que é baseada nos critérios citológicos CRITÉRIOS CITOLÓGICOS E HISTOLÓGICOS Segundo Carter et al. (1986), os diferentes sistemas de classificação, inclusive o proposto pelo NCI, propõe que os linfomas sejam classificados em: Baixo

13 12 grau, Grau intermediário e os de Alto grau. Os classificados como baixo grau são formados por células pequenas, que são aquelas que apresentam seus núcleos de tamanhos menores ou iguais a 1,5 ao tamanho de um eritrócito em diâmetro, com um baixo índice mitótico, ou seja, menor que 5 (cinco) células por campo, tem uma taxa de progressão pequena. Os seus núcleos são geralmente pequenos com cromatina grosseira e nucléolos indistintos. O padrão de crescimento pode ser folicular, pseudofolicular ou difuso; contudo o seu padrão de crescimento não é destrutivo. Embora esse tipo de linfoma esteja associado com um bom tempo de sobrevivência do paciente, eles são definitivamente incuráveis clinicamente e não são capazes de serem tratados inicialmente. Por outro lado, os linfomas de alto grau são potencialmente curáveis clinicamente e apresentam índice mitótico elevado (maior que 10 células por campo), que se não forem tratados logo, eles são altamente agressivos e mortais. As células têm geralmente um tamanho maior que duas vezes ao de uma hemácia em diâmetro, contendo padrão de cromatina rendada com nucléolos proeminentes. Algumas dessas células têm uma quantidade moderada de citoplasma. O padrão de crescimento histológico é quase sempre difuso e destrutivo. Os linfomas classificados como sendo de grau intermediário ficam entre esses dois extremos. A taxa de mitose deste tumor é de baixa a média, ainda que o seu tamanho possa ser variável. Eles mostram tipicamente algumas características diferenciadas, como uma zona arquitetônica folicular ou da manta (Schalm, 2000). O critério citológico com os termos utilizados na avaliação do linfoma e as suas características citológicas destes tumores estão nas tabelas 1 e 2, a seguir CRITÉRIOS CLÍNICOS

14 13 Os critérios de classificação quanto a fase clínica do linfoma foi estabelecida pela Organização Mundial de Saúde (OMS), conforme a tabela 3 a seguir. Tabela 1:SUBTIPOS DE LINFÓCITOS CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS Subtipo de Linfócito Características citológicas Baixo ou Grau Intermediário Pequeno Linfocítico Tamanho pequeno, núcleo redondo, cromatina grosseira, citoplasma escasso e pálido. Mitoses são ausentes ou muito baixas. Variáveis incluem núcleos irregulares (como os centrocíticos), células claras (citoplasma pálido e extendido que podem conter finos grânulos azurofílicos), e os pró-linfocíticos (cromatina fina e com nucléolos distintos). Célula Pequena Clivada (Centrocítico) Célula da Manta (Linfócito Intermediário) Célula Monocitóide B Tamanho pequeno a médio (células de 6 a doze 12µ ou levemente maior que um linfócito normal), núcleo irregular a clivado, nucléolos pequenos ou ausentes e indistintos, citoplasma escasso Tamanho pequeno a médio, núcleo redondo a levemente irregular (forma do núcleo é intermediária entre um pequeno linfócito e um centrocítico), citoplasma abundante e fracamente corado. Tamanho pequeno a médio, cromatina nuclear varia do moderadamente agregado a vesicular ou rendado, nucléolos são pequenos e indistintos, citoplasma pálido e abundante. Alto Grau Linfoblasto Tamanho pequeno a médio, diâmetro aproximado de 15µ (variação entre 10 a 20µ), núcleo que pode ou não ser convoluto, de cromatina fina, nucléolos ausentes ou pequenos indistintos. Célula Pequena Não-Clivada (Célula de Burkitt) Centroblástica (Célula Grande, Clivada ou Não-Clivada) Imunoblastos Célula Grande Pleomórfica (Célula Grande Imunoblástica) Tamanho médio, uniforme, núcleo redondo, nucléolos múltiplos e centrais, citoplasma intensamente corado. Tamanho grande (13 a 30µ em diâmetro), núcleo redondo com cromatina vesicular, 1 a 3 nucléolos que freqüentemente próximo a membrana do núcleo, citoplasma escasso e basofílico. Mitoses são freqüentes. Tamanhos grandes (maiores que 20µ), núcleos redondos, nucléolo único grande e central, citoplasma basofílico. Células grandes pleomórficas, algumas delas são multinucleadas. O citoplasma é abundante e freqüentemente são fortemente basofílicos. Nucléolos são grandes e proeminentes. Fonte: Schalm et al. (pág. 606, 2000)

15 14 TABELA 2: PROTOCOLO CITOLÓGICO E TERMOS UNTILIZADOS NA AVALIAÇÃO DE CASOS DE LINFOMA 1) Estimar o índice mitótico examinando cinco campos de células com a objetiva de 40X(vezes) ou de 50X) Baixo: Moderado: Alto: 0 a 1 figura de mitose em cinco campos 2 a 3 figuras de mitose em cinco campos Maior que 3 figuras de mitose em cinco campos 2) Determinar o tamanho da célula em relação ao tamanho do eritrócito Pequeno: Médio: Grande: 1 a 1,5 vez o tamanho da hemácia 2 a 2,5 vezes o tamanho da hemácia Maior que 3 vezes o tamanho da hemácia 3) Determinar a forma do núcleo e a sua localização no citoplasma Arredondado: Irregularemente arredondado: Contorcido: Fendido: Circular sem edentação Poucas edentações ou convoluções Várias endentações profundas Endentação única profunda 4) Determinar o número, tamanho, visibilidade e localização dos nucléolos nos linfócitos neoplásicos Únicos X Múltiplos Grande X Pequeno Indistinto: Proeminente: Invisível ou discretamente perceptível Facilmente visível Localização periférica ou central X marginal 5) Descrever o citoplasma baseando-se em sua quantidade e cor. Pode ser notado a presença da zona de Golgi ou de granulação Escasso: Tamanho moderado: Abundante: Pálido: Pequeno halo ao redor do núcleo Quantidade intermediária entre escasso e abundante Cerca de duas vezes o tamanho do núcleo Claro ou ligeiramente basofílico

16 15 TABELA 2: PROTOCOLO CITOLÓGICO E TERMOS UNTILIZADOS NA AVALIAÇÃO DE CASOS DE LINFOMA (CONTINUAÇÃO) Basofilia moderada: Basofilia intensa: Cor intermediária entre pálido e azul-escuro. Azul mais escuro 6) O grau da neoplasia baseia-se morfologicamente no tamanho da célula e no índice mitótico. Baixo Grau: Alto Grau: Ìndice mitótico baixo e célula de tamanho pequeno Índice mitótico moderado ou alto e nenhuma célula de tamanho médio ou grande Fonte: Raskin et al. (pág. 100) TABELA 3: ESTÁGIOS CLÍNICOS DE ANIMAIS DOMÉSTICOS COM LINFOMA Fase I II III IV V Critérios Único linfonodo afetado. Múltiplos linfonodos afetados em uma área regional. Linfadenopatia generalizada. Baço e/ou fígado afetados (com ou sem envolvimento do estágio III). Medula óssea e sangue afetados e/ou qualquer outro órgão não-linfóide afetado (com ou sem os estágios I a IV). Subestágio a b Sem sinais clínicos da doença Com os sinais clínicos da doença Fonte: Organização Mundial de Saúde. TNM Classificação dos Tumores em Animais Domésticos. Genova, Organização Mundial da Sáude, LINFOMA CANINO Nos cães (C.familaris), a maioria dos casos que os acometem é a forma multicêntrica (cerca de 80 a 85%), tipicamente os estágios III ou IV, segundo a OMS. As outras formas de linfoma são menos frequentes: alimentar (7%), cutânea (6%), mediastinal (3%) e as extranodais (1%) (Sistama Nervoso Central (SNC), ossos, coração, cavidade nasal e olhos. A maioria desses casos são constituídos de linfócitos imaturos, já

17 16 que os linfomas de células pequenas e bem diferenciados representam a minoria dos casos. Nos casos de linfoma os linfócitos médios ou grandes, com freqüência, constituem 60 a 90% das células. Uma exceção é a rara manifestação de linfoma de célula B com grande quantidade de célula T, no qual os linfócitos reativos representam a maior parte da população de células (Schalm, 2000). Ainda este mesmo autor relata que a população geralmente é homogênea, ainda que no início da enfermidade possa haver completa destruição do linfonodo. Quando ocorre a presença de células mistas, com dois tamanhos de células, como linfócitos pequenos e grandes, o diagnóstico de linfoma pode precisar de procedimentos adicionais como a exérese do tumor e avaliação histopatológica para sua definição e classificação, para fins de tratamento de diagnóstico e prognóstico. Raskin (2001) acrescenta que também pode ser observado no fundo da lâmina, corpúsculos linfoglandulares que são oriundos da ruptura dos linfócitos, os quais se assemelham a fragmentos citoplasmáticos basofílicos do tamanho de plaquetas. Os núcleos lisados aparentam-se com material eosinofílico amorfo rendilhado. O estágio clínico, particularmente aquele que envolve o sangue periférico, medula óssea ou locais mistos (estágio V, segundo a OMS) tem importância no prognóstico em relação ao período de reincidência após a remissão completa e ao tempo de sobrevida SINAIS E APRESENTAÇÕES CLÍNICAS Uma das doenças neoplásicas mais comuns encontradas em clínica de pequenos animais é o linfoma multicêntrico canino. Ele afeta primariamente cães de meia-idade (de cinco a oito anos de idade) a cães mais velhos de ambos os sexos, porém, já foi notado que os machos são mais predispostos a enfermidade do que as fêmeas em uma proporção de 2:1. Não existe predisposição para as raças, sendo muitas

18 17 raças acometidas (Schalm, 2000). É interessante notar que nos humanos do sexo masculino também podem apresentar alto risco de certas formas de linfoma de não Hodgkin (Dobson e Gorman et al., 1993). A maioria dos cães apresenta linfadenopatia generalizada e são saudáveis, de uma forma geral. Somente 10 a 20% dos cães são clinicamente doentes (subestágio b), com sinais não específicos como inapetência, anorexia, perda de peso e letargia (Schalm, 2000). A hipercalcemia paraneoplásica pode causar poliúria e polidipsia e que pode ser acompanhada de edema de face e obstrução do trato respiratório superior. A doença de grau V, em que envolve a medula óssea, pode apresentar citopenias periféricas e sepse subseqüente a uma neutropenia, hemorragia trombocitopênica, ou até mesmo anemia. A apresentação de outros sinais clínicos reflete a forma anatômica da apresentação do linfoma em cada indivíduo. As formas alimentares resultam em sinais específicos ao trato gastrointestinal, o que incluem vômitos, diarréia, perda de peso e inapetência. Em casos de linfoma mediastinal, sinais respiratórios serão notados, como dispnéia e alterações cardíacas. Edemas de cabeça, pescoço e membros secundários a uma compressão na veia cava pelo tumor ou uma invasão na veia cava são observados nesta forma. A hipercalcemia paraneoplásica está presente em quase metade dos cães que tem linfomas mediastinais, por esta razão, poliúria e polidipsia são as queixas mais comuns nesses casos (Schalm, 2000). Também, existem tumores que envolvem outros sítios e que acarretam sinais atribuídos a sua localização, como os linfomas cutâneos e o linfoma do sistema nervoso central LINFOMA FELINO Em gatos (F. catus) não existem predileções quanto a raça e ao sexo para animais com linfoma. A idade e a associação da doença com animais que são FeLV

19 18 (Vírus da Leucemia Felina) positivos modificaram ao longo dos últimos anos a sua apresentação anatômica nesta espécie (Schalm, 2000). Atualmente, na Medicina Veterinária, com o avanço no controle do retrovírus através de programas de vacinação e dos testes sorológicos para a identificação de animais doentes resultou em um desvio na freqüência anatômica e na derivação imunofenotípica do linfoma (Vail et al., 1998). Anteriormente a utilização desses meios de diagnóstico e de controle contra a infecção do FeLV, as formas que predominavam eram a mediastinal e a multicêntrica, e o linfoma era associado com animais mais jovens, FeLV positivos. Contudo, hoje, a forma alimentar é a mais comum e em animais mais velhos e FeLV negativos. A idade média de 9 a 10 anos, antigamente relatada quanto a presença desses tumores nesses animais são considerados altos, que se encontram na faixa entre 4 a 6 anos, hoje (ibid., 1998). Esta mudança epidemiológica do linfoma em gatos (F. catus) pode ser explicada pela própria ação no controle do avanço da FeLV como: a vacinação em si, a identificação dos animais infectados através de sorologia e posterior separação de animais potencialmente infectados daqueles que são suscetíveis (Schalm, 2000) SINAIS E APRESENTAÇÕES CLÍNICAS Os gatos (F. catus) que tem linfoma associados a FeLV apresentam a mucosa pálida por causa da anemia. Diferente dos cães (C. familiaris) com a mesma enfermidade, os felinos doentes estão na faixa de 75% da população dos animais com linfoma, classificados como do substágio b, segundo a OMS. A sintomatologia clínica do linfoma, assim como nos caninos, depende do sítio anatômico envolvido. A forma alimentar tem graus variáveis de perda de peso, pêlos foscos, inapetência, diarréia crônica e vômitos. Doença mediastinal frequentemente resulta em severa alteração respiratória na presença de grande massa torácica ou de

20 19 efusão pleural. Aqueles felinos que apresentam linfoma renal podem apresentar poliúria e polidipsia secundários a falência renal. Descargas crônicas serosanguinolentas, exoftalmia e deformidade facial são sinais clínicos comuns com animais com linfoma nasal (Schalm, 2000) DIAGNÓSTICO DE LINFOMA O diagnóstico de linfoma nos animais requer um exame clínico criterioso, avaliação hematológica, bioquímica e sorológica (em casos de felinos, para FIV e FeLV), diagnóstico por imagem, além da avaliação citológica e histológica, como foi comentado anteriormente (Schalm, 2000). Quanto ao exame físico, a palpação dos linfonodos, incluindo o exame retal, é importante para avaliar quais estão afetados. Assim como, aquela que é feita na região abdominal que podem revelar alguma organomegalia, ou espessamento da parede intestinal ou uma linfadenopatia mesentérica. A inspeção das mucosas é feita para a possível presença de palidez ou de petéquias devido a uma anemia ou uma trombocitopenia, respectivamente, secundárias ao envolvimento da medula óssea e detecção de icterícia ou de úlceras urêmicas que se desenvolveram a partir da infiltração de órgãos importantes. A compressão da cavidade torácica nos gatos (F. catus) e a auscultação em caninos e felinos podem sugerir a presença de massa mediastinal e efusão pleural. Exames de fundo de olho podem revelar anormalidades, como uveítes, hemorragias, infiltração ocular, em mais da metade dos caninos que tem linfoma (Schalm, 2000).. Um hemograma completo, que inclui a contagem de plaquetas, é uma parte necessária para qualquer avaliação desses animais que apresentam anormalidades hematológicas e que tem linfoma na maioria dos casos. Em animais que apresentam anemia, geralmente, essa é normocítica e normocrômica, ou seja do tipo arregenerativa,

21 20 refletindo uma anemia de doença crônica. Apenas nos casos em que a perda de sangue ou de hemólise paraneoplásica estiverem presentes, essas anemias serão regenerativas. Felinos FeLV positivos normalmente têm uma anemia macrocítica. Uma trombocitopenia pode acompanhar uma anemia e uma leucopenia com presença de linfócitos atípicos se houver comprometimento da medula óssea. A hipoproteinemia é mais comumente notada em animais que tem linfoma alimentar secundários a uma diarréia crônica. Em casos de suspeita de envolvimento medular, é requerido um mielograma para observar a presença ou não de infiltração neoplásica, com possíveis aumento da relação entre as células mielóides e eritróides. Quanto ao perfil bioquímico da doença, dependendo do sítio anatômico afetado, como por exemplo, uma infiltração no parênquima hepático, causam aumento nas enzimas de extravasamento (alanina aminotransferase ALT e aspartato aminotransferase AST), nas de indução (fosfatase alcalina FAL e Gama Glutamiltransferase GGT) e na concentração das bilirrubinas. Em 15% dos cães (C. familiaris) que tem linfoma, menos da metade com envolvimento do mediastino, tem hipercalcemia secundária a uma síndrome paraneoplásica (Schalm, 2000). Em casos de hipercalcemia de origem desconhecida, o linfoma deve se encontrar no topo da lista de diagnóstico diferencial (ibid, 2000). Além disso, a hipercalcemia também serve como marcador de resposta a terapia. Determinadas proteínas inflamatórias, como a proteína C reativa, a haptoglobina e a proteína amilóide A, foram notadas estarem aumentadas nos cães (C. familiaris) com desordens neoplásicas, como em casos de linfoma, de leucemia linfoblástica aguda, de leucemia linfocítica crônica e do mieloma múltiplo em comparação com animais saudáveis, podendo servir de marcadores dessas enfermidades (Merlo et al., 2008). Neste mesmo trabalho, a protéina amilóide A foi investigada ser ou não útil como proteína marcadora de linfoma multicêntrico nos caninos e as alterações da sua concentração durante o tratamento quimioterápico, tanto nos animais doentes como os

22 21 de controle. Concluiu-se que ela possa ter um papel como marcadora no câncer canino, em relação a outras proteínas inflamatórias, entretanto, ela não é uma proteína marcadora de reincidiva de linfoma em cães (C. familiaris) e nem altera as suas concentrações durante a quimioterapia. Também, foi observado em gatos (F. catus) um marcador no genoma de linfócitos no linfoma, o gene Bcl-2, que regula a apoptose e que se mostram reprimidas nessas células neoplásicas (Kano, 2008). A elevação das globulinas, principalmente das imunoglobulinas monoclonais, podem ocorrer com menos freqüência com linfoma originário de células B (Schalm, 2000). Uma azotemia renal poderá ser observada, se os rins forem infiltrados pelo tumor. Conforme citado anteriormente, avaliação sorológica em felinos acometidos por retroviroses (FIV e FeLV) são importantes para o diagnóstico e prognóstico nesta espécie. Diagnósticos por imagem, que incluem radiografias, ultrassonografia e até mesmo tomografia computadorizada, que chegou ao Brasil a muito pouco tempo, tem sido de grande valor de diagnóstico. A avaliação morfológica do linfoma através da citologia e da histopatologia, além da imunocitoquímica, todas têm sido uma grande ferramenta de diagnóstico. A determinação da imunofenotipagem (células B ou T), a indicação das taxas de proliferação do tumor por alguns marcadores e nos subtipos histológicos (tumores de alto grau, grau intermediário e de baixo grau) serão comentados agora nesta segunda parte deste estudo, enfatizando a sua história, a sua utilização e a sua importância.

23 22 2. IMUNOCITOQUÍMICA: FERRAMENTA DE DIAGNÓSTICO A imunocitoquímica abrange um conjunto de procedimentos que utiliza anticorpos como reagentes específicos para detecção de antígenos celulares ou teciduais, que podem ser desde constituintes celulares como, por exemplo, proteínas de membrana, a algum elemento estranho à célula como, microorganismos (Bogliolo, 1998). Há mais de cinquenta anos, a técnica de marcação de anticorpos com produtos fluorescentes para notar a presença de antígenos teciduais foi a primeira reação imunocitoquímica realizada. Desde aquela época até hoje, a alta sensibilidade e especificidade desta técnica, somado ao seu grande avanço tecnológico, ela tem sido um instrumento útil tanto para investigação como para diagnóstico (ibid, 1998). Esta técnica é essencialmente qualitativa, ainda que alguns métodos quantitativos possam ser empregados para se determinar o número de elementos presentes ou a intensidade da reação, objetivando detectar a localização topográfica de antígenos nos tecidos ou nas células. Diferente de outros testes imunológicos como, ELISA, por exemplo, a técnica de imunocitoquímica deve ser interpretada juntamente com a morfologia celular e não apenas como resultados positivos e negativos, evitando assim erros pós-analíticos (Bogliolo, 1998) CONHECIMENTOS GERAIS DE IMUNOLOGIA A principal reação e comum a toda reação de imunocitoquímica é o anticorpo. O anti-soro contendo anticorpos específicos para um imenso número de antígenos teciduais úteis clinicamente expandiu enormemente a quantidade e qualidade do repertório desta técnica (Tizard, 1998). E para a compreensão a fim de explorar bem

24 23 os seus métodos, é necessário ter um entendimento básico sobre os anticorpos e seus potenciais, assim como, também, as suas limitações IMUNOGLOBULINAS Os anticorpos pertencem a um grupo de proteínas conhecida como imunoglobulinas (Ig). Elas são formadas por cinco grandes classes, ordenadas de forma crescente achadas no plasma ou no soro: imunoglobulina G (IgG), IgA, IgM, IgD e IgE (Tizard, 1998). Cada imunoglobulina é composta de duas cadeias moleculares pesadas (P) e idênticas e de outras duas cadeias também idênticas, porém mais leves (L), conforme a figura 1. FIGURA 1 - DIAGRAMA MOSTRANDO A ESTRUTURA DE UMA MOLÉCULA DE IMUNOGLOBULINA. ELE CONTEM DUAS CADEIAS Figura 1 - PESADAS Diagrama IDÊNTICAS mostrando a (P) estrutura E DUAS de IDÊNTICAS uma molécula LEVE de (L). imunoglobulina. LIGAÇÕES DISSULFETOS ela contem duas INTER cadeias E INTRACADEIAS pesadas idênticas (SETA) ONTRIBUEM (P) e duas cadeias PARA idênticas A ESTRUTURA leves (L). E Ligações ESTABILIDADE dissulfetos DA MOLÉCULA. inter e intra cadeias (seta) contribuem para a estrutura e estabilidade da molécula. Fonte: Tizard, 1998.

25 24 As cadeias P diferem entre si em suas propriedades estruturais e antigênicas, determinando a classe e a subclasse da molécula. Assim, as classes foram nomeadas como gamma (IgG), alfa (IgA), mu (IgM), delta (IgD) e epsilon (IgE). As subclasses são designadas por subscritos como, por exemplo, IgG 1, IgG 2. As duas cadeias L são também classificadas como do tipo kappa ou do tipo lâmbda. A distribuição das cadeias kappa e lambda diferem em todas as classes e subclasses de Ig, assim como entre as variadas espécies de animais. No homem, a razão de Ig kappa e lâmbda é de 2:1; nas subclasses IgG 2 e IgG 4, as razões são de 1:1 e 8:1, respectivamente. Os ratos têm aproximadamente 95% de cadeias kappa, sendo estes que apresentam o maior número de anticorpos IgG monoclonais entre as espécies. Ligações covalentes por pontes dissulfeto unem as cadeias P e L e entre as próprias cadeias pesadas (P). Muitas dessas ligações covalentes participam na estrutura terciária, conferindo estabilidade a molécula de imunoglobulina. Das cinco classes de Ig já citadas, para a imunocitoquímica, a IgG e a IgM serão as mais detalhadas aqui por serem as mais freqüentemente utilizadas na rotina desta técnica IgG A imunoglobulina G tem a fórmula geral de gama 2 kappa 2 ou gama 2 lâmbda 2 que denotam que uma molécula de IgG é composta por duas cadeias pesadas gama e de duas cadeias leves do tipo kappa ou do tipo lambda (figura 2). A estrutura molecular da IgG foi determinada em parte por reações de ação proteolíticas e de dissociação redutiva da molécula. A digestão pela papaína cliva a região mais suscetível

26 25 no terminal nitrogenado (N) entre as pontes dissulfeto nas cadeias, liberando assim dois fragmentos heterogêneos e monovalentes de ligação com o antígeno (Fab), e dois outros fragmentos cristalinos homogêneos (Fc). A clivagem das cadeias gama é feita pela ação proteolítica da pepsina, separando no terminal carbono (C) das pontes dissulfeto entre as duas cadeias pesadas, resultando em um fragmento bivalente de ligação com o antígeno, que é a porção F(ab ) 2. Neste caso, os fragmentos Fc são destruídos. A dissociação redutiva de uma molécula de IgG divide as pontes de dissulfeto entre as cadeias e, se os grupos sulfidrilas estiverem bloqueados, resulta na formação de duas cadeias pesadas, com cinqüenta quilodaltons (50 kd) cada, e duas cadeias leves, com vinte e cinco quilodaltons (25 kd) cada. Figura 2- Diagrama mostrando a estrutura de uma molécula de IgG de coelho (O. cuniculus), que existe como uma subclasse única principal). As cadeias pesadas (P) e leves (L) são compostas de domínios constantes (C) e de variáveis (V) e são ligadas por pontes dissulfetos. Digestão proteolítica com papaína (...) Formando dois campos de ligação com o antígeno (Fab), enquanto a digestão com a pepsina ( ) gera um fragmento de F(ab ) 2. Fonte: Tizard, 1998.

27 26 A molécula de IgG pode ser ainda dividida em domínios, conhecidos como domínios Variáveis (V) e em domínios Constantes (C). cada domínio contêm de 110 a 120 aminoácidos e uma ligação dissulfeto intra-cadeias. No domínio Variável da cadeia mais Leve (V L ) e no domínio Variável na cadeia Pesada (V P ) estão localizados os terminais amino da molécula da imunoglobulina. A V L e a V P formam juntas o sítio de combinação com o antígeno. Em ambos os domínios V L e V P das moléculas do anticorpo estão localizadas várias regiões HiperVariáveis (HV) que, durante a reação com os antígenos, são trazidos para perto ao determinante antigênico. Esta distância foi estimada em aproximadamente 0,2 a 0,3nm (nanômetros). Nesta região são encontrados especificidades estruturais únicas que são chamadas de determinantes idiotípicos. Cada clone de anticorpo expressa seu próprio idiotipo. Cada cadeia L também tem um domínio constante (C L ) junto ao domínio V L. A cadeia pesada tem três domínios constantes (C H 1, C H 2 e C H 3) e carregam a porção final carboxila da imunoglobulina. Com exceção dos marcadores alotípicos, que são determinantes inerentes que conduzem a uma resposta imune nas mesmas espécies, e das subclasses das imunoglobulinas, IgG 1, IgG 2, IgG 3 e IgG 4, as regiões constantes da IgG são constantes. Entre os domínios C H 1 e C H 2 das cadeias P estão localizadas as regiões de dobradiças. São as variações dessas regiões que mais contribuem para a especificidade das subclasses. O número de pontes de dissulfeto que ligam as cadeias pesadas variam entre as subclasses de IgG. A IgG 1 e a IgG 4 tem duas cada uma, enquanto a IgG 2 e IgG 3 tem quatro e cinco dessas ligações, respectivamente. Por causa da flexibilidade da região de dobradiça, o ângulo que ambos os fragmentos da Fab formam podem variar para acomodar distâncias variáveis entre determinantes antigênicos idênticos. No domínio C H 2 está localizado metade dos carboidratos da molécula de IgG e vários aminoácidos aromáticos neutros e fortemente hidrofóbicos.

28 IgM A IgM é um pentâmero de peso molecular de novessentos quilodaltons (900 kd) em que consiste de cinco subunidades de aproximadamente 180 kd cada. A fórmula geral pode ser expressa como (mu 2 kappa 5 ) 5 ou (mu 2 kappa 2 ) 5, conforme a figura 3. Cada subunidade é ligada por pontes dissulfetos e consiste de duas cadeias pesadas (mu) e duas cadeias leves do tipo kappa ou lambda. Um peptídeo rico em radicais sulfidrilas, a cadeia J (15 kd), contribuem para a integridade e estabilidade do pentâmero. Assim como a IgG, as subunidades da IgM podem ser fragmentadas pela clivagem enzimática e redutiva em porções de F(ab ) 2, Fab e Fc, assim como as cadeias pesadas e leves, respectivamente. O fragmento Fc de IgM é um pentâmero cíclico (de peso molecular de 340 kd). O tratamento de IgM pentamérico com 0,1% de mercaptoetanol cliva as pontes de dissulfeto entre as subunidades de cinco monômeros. As subclasses de IgM 1 e IgM 2 foram relatados. Enquanto a IgG é o anticorpo mais abundante no hospedeiro hiperimunizado, em um animal recentemente imunizado, a IgM é o primeiro anticorpo humoral detectável. A formação do anticorpo primário segue em várias fases importantes. O imunógeno injetado primeiro alcança o equilíbrio entre os espaços intra e extravascular, então ocorre o catabolismo resultando em fragmentos menores, e finalmente é eliminado dos espaços intravasculares pelos anticorpos recém-formados. O período que vai desde a introdução de um imunógeno até o aparecimento dos primeiros anticorpos IgM é chamado de período latente e pode ser de aproximadamente de uma semana. Em duas semanas, os anticorpos da classe de IgG predominam normalmente. Como todas as proteínas, os anticorpos são sujeitos ao catabolismo. Ao passo que os anticorpos da classe IgM tem uma meia-vida de somente quatro a seis dias, os anticorpos IgG tem um período maior que podem chegar a aproximadamente a três

29 28 semanas. Senão forem feitas novas aplicações com imunógenos, o nível de IgM no soro tende a diminuir depois desse período (Tizard, 1998) ANTICORPOS POLICLONAIS Os anticorpos policlonais são produzidos por diferentes células e, em conseqüência, são imunoquimicamente diferentes; eles reagem contra vários epítopos no antígeno. De longe o mais frequentemente usado em animais para a produção de anticorpos policlonais é o coelho (Oryctolagus cuniculus), seguido pelo bode (Capra aegragus hircus), porco (Sus domesticus), carneiro (Ovis aries), cavalo (Equus caballus), porquinho-da-ìndia (Cabia porcellus) e outros. Entre os coelhos (O. cuniculus), é o coelho branco da Nova Zelândia que é o mais usado. A popularidade dos coelhos para a produção de anticorpos policlonais é atribuída primariamente aos coelhos de fácil manejo. Os coelhos (O. cuniculus) oferecem outras grandes vantagens também: anticorpos humanos à proteínas do soro do coelho são raros, enquanto aqueles ruminantes, como as cabras (C. aegragus hircus), são mais comuns, anticorpos de coelhos (O. cuniculus) precipitam proteínas de humanos sobre uma extensa quantidade de antígeno ou excesso de anticorpos. Para a obtenção desses anticorpos, são realizadas injeções intradérmicas ou subcutâneas, podendo ser feito em outros locais como, cavidade peritoneal, em uma dose que varia entre 10µg a 200µg, comumente administrada para gerar uma resposta imune nos animais. Outras aplicações podem ser feitas uma vez por mês ou quando as reduções dos títulos de anticorpos são notadas, aumento ou manutenção dos seus níveis. O sangue é coletado da orelha em coelhos, da veia jugular (grandes animais), ou intracardíaca, frequentemente usada para fazer eutanásia do animal. Depois da remoção das células, os anticorpos policlonais podem ser obtidos na forma do anti-soro totalmente

30 29 estabilizado ou em frações purificadas a graus variados. Precipitação por sais, seguido de cromatografia por troca iônica, serve para remover o volume de outras proteínas do soro. A afinidade cromatográfica pode ser usada para isolar os anticorpos antigênicos específicos e liberá-los das reações cruzadas com anticorpos de outras espécies, especialmente da imunoglobulina humana. Figura 3 - Diagrama mostrando (a) as cinco subunidades de igm de camundongo (M. musculus) ligados por pontes de dissulfeto e a cadeia J para formar um anel pentamérico. cada subunidade (b) contem duas cadeias pesadas mu e duas cadeias leves (L) cada uma composta de domínios constante (C) e variáveis (V). Fonte: Tizard, ANTICORPOS MONOCLONAIS Os anticorpos monoclonais são produzidos por clones de plasmócitos. Anticorpos de um dado clone são imunoquimicamente idênticos e reagem com epítopos específicos no antígeno contra as próprias células que a desenvolveram. Provavelmente

31 30 por razões de economia, camundongos (Mus musculus) são frequentemente usados quase que exclusivamente para a produção de anticorpos monoclonais. Depois de uma resposta imune for alcançada, os linfócitos B do baço ou dos linfonodos são extraídos e são fundidas com células de mieloma não-secretoras de camundongos (M. musculus), conforme a figura 4. Ao passo que os linfócitos B transferem o anticorpo específico, as células de mieloma fornecem para as células híbridas uma longevidade maior no meio de cultura. As células B não-reativas e as células do mieloma são removidas e o hibridoma produtor de anticorpo é cultivado e testado para a reação desejada. A propagação pode ser sucedida para uma cultura de células ou por transplante do hibridoma para o interior da cavidade peritoneal para um camundongo transgênico. Em conseqüência disto, grandes e, teoricamente, quantidades ilimitadas de anticorpos monoclonais de características específicas podem ser produzidas. Há muitas vantagens dos anticorpos monoclonais na imunocitoquímica além das suas semelhanças policlonais; esses incluem alta homogeneidade, ou seja, a ausência de anticorpos não-específicos, livre da alta variabilidade genética nas imunoglobulinas (Tizard, 1998). Contudo, alguns obstáculos no uso dos anticorpos monoclonais deveriam ser observados. Primeiro, os métodos para as escolhas dos clones úteis e para o controle de qualidade devem ser idênticos aos métodos para quais os métodos dos anticorpos monoclonais foram criados. Muitas das vezes, estes são classificados usando um tecido congelado, por exemplo, quando eles são fixados pela formalina. Em segundo lugar, o epítopo alvo deve sobreviver a esta fixação. Em alguns casos, um antígeno pode sobreviver a fixação com a formalina (pelo uso de anticorpos policlonais), mas o epítopo particular com o que os anticorpos monoclonais interagem não sobrevive. De igual modo, a reatividade de um epítopo depois de uma fixação desejada não necessariamente assegura sua sobrevivência sobre subcondições de fixação. Em terceiro lugar, o epítopo alvo deve ser único a um dado antígeno. Um dos grandes benefícios que vem com o uso de anticorpos monoclonais, chamado de

32 31 especificidade, será perdido se o anticorpo for direcionado contra um epítopo que é ligado a dois ou mais antígenos diferentes (Tizard, 1998). A reação cruzada de um antisoro policlonal pode ser aceito, mas a mesma reação em um anticorpo monoclonal não poderá. Finalmente, embora isto não poder ser um problema da imunocitoquímica, a maioria dos anticorpos monoclonais falham em precipitar os antígenos e por isso não podem ser usados em técnicas de precipitação (Ricken et al, 1993) PRINCÍPIOS FUNDAMENTAIS Figura 4 - Diagrama esquemático mostrando o método de produção de anticorpos monoclonais. Fonte: Tizard, Os anticorpos empregados na imunocitoquímica podem ser mono ou policlonais. Em vez de anticorpos purificados, muitas vezes se utiliza um anti-soro como reagente primário, implicando a presença de anticorpos policlonais. Como dito

33 32 anteriormente, a vantagem do uso dos anticorpos monoclonais é a sua elevada especificidade (Tizard, 1998). Os anticorpos são marcados com algum composto químico, que podem ser substâncias fluorescentes ou enzimas, para que possam ser identificados seletivamente. A técnica que utiliza substâncias fluorescentes como marcadores é denominada de imunofluorescência, enquanto aquela que usa enzimas como marcadores, é conhecida como técnica imunoenzimática (Bogliolo, 1998). Ainda segundo Bogliolo (1998), a imunofluorescência pode ser direta ou indireta. O método direto, o anticorpo específico é ligado diretamente a um composto fluorescente, sendo o mais usado o isotiocianato de fluoresceína, que emite luz verdebrilhante quando estimulado por luz ultra-violeta. Em seguida, as amostras são examinadas em microscópios de fluorescência. Contudo, no método indireto, um anticorpo primário se liga ao antígeno de interesse. A substância fluorescente é conjugada a um anticorpo secundário, que, por sua vez, reconhece a porção Fc do anticorpo primário e com ele forma reação específica. A imunofluorescência indireta é mais específica, pois o anticorpo primário encontra-se livre do marcador, e o sinal só aparece após duas ligações antígeno-anticorpo, o que permite melhor controle da reação (Ricken et al., 1993). A afinidade do anticorpo pelo seu antígeno foi usada para descrever a sua afinidade intrínseca e funcional. A afinidade intrínseca de um anticorpo reside nas suas regiões hipervariáveis (HV) e é determinada pela mesma seqüência de aminoácidos que determina a especificidade. Quanto maior for a sua especificidade, maior será a sua afinidade. Interações iônicas, pontes de hidrogênio e forças de Van der Waals são os maiores contribuintes para a afinidade entre o anticorpo e seu determinante antigênico. A hidrofobicidade aparece ter um efeito de estabilidade na formação do complexo imune. A ligação covalente entre o antígeno e o anticorpo não ocorre. A associação constante (Ka) na ligação entre um anticorpo e seu determinante antigênico é medida pela afinidade do

34 33 anticorpo. Ela pode ser atingida de 10 3 a 10 9 por mol, que é da concentração recíproca em moles por litro. Quanto mais alta for a afinidade de anticorpo, menor a concentração de antígeno livre será necessário para as ligações disponíveis serem saturadas, quando diz-se que a reação chegou ao seu equilíbrio. Na imunocitoquímica, a afinidade funcional de um anticorpo ou de um antisoro pode ser bem definida pelo tempo requerido para alcançar equilíbrio com o antígeno tecidual. Se duas alíquotas de anti-soro com títulos idênticos forem incubados por um período de tempo, aquele anti-soro que atingir o seu platô de coloração de intensidade máxima é o que tem a maior afinidade funcional (Tizard, 1998). O termo avidade foi usado sinonimamente para denotar a força de ligação entre o antígeno e o anticorpo. Mais recentemente, este termo é reservado para descrever a soma total de todas as afinidades intrínsecas achadas em um anti-soro policlonal (Bogliolo, 1998). As técnicas imunoenzimáticas, que surgiram a partir de 1960, usam enzimas como marcadores de imunoglobulinas (ibid, 1998). Assim, o que se observa na reação é a observação de um composto colorido no local, o qual é gerado pela ação da enzima sobre o substrato apropriado. A enzima mais utilizada é a peroxidase, sendo bem conhecida como técnica da imunoperoxidase. Ela reage com seu substrato, o peróxido de hidrogênio (H 2 O 2 ), resultando na oxidação de seu grupo prostético heme e formando um complexo molecular. Na presença de uma substância doadora de elétrons, oxidado, se polimeriza e precipita. Como este é colorido, sua deposição marca histoquimicamente o local da reação antígeno-anticorpo. Várias substâncias (diaminobenzidina, aminoetilcarbazol, cloronaftol) podem ser usadas como reveladores de uma reação de imunoperoxidade. Outras enzimas, como a fosfatase alcalina, têm sido empregadas no lugar da peroxidase. Os princípios das reações são os mesmos, só mudando os substratos.

35 34 Como na marcação com compostos fluorescentes, as enzimas podem ser acopladas ao anticorpo primário (método direto) ou ao secundário ( método indireto). A técnica indireta é mais eficaz. O desenvolvimento de outros métodos imunoenzimáticos veio aumentar a sensibilidade dessas técnicas. Duas estratégias são mais utilizadas: a da peroxidaseantiperoxidase (PAP) e a da avidina-biotina-peroxidase (ABC). O método da PAP, mais utilizada, consiste na reação em cadeia de três anticorpos. O anticorpo primário, produzido no animal da espécie A, reage com o antígeno-alvo. O anticorpo terciário antiperoxidase é também produzido pelo mesmo animal. O anticorpo secundário é de origem de uma outra espécie diferente e reconhece a fração Fc das imunoglobulinas produzidas pelos animais da espécie A (Bogliolo, 1998). Conforme a figura 5, um braço da fração Fab do anticorpo secundário se liga à Fc do anticorpo primário e o outro à Fc do anticorpo terciário, formando com eles uma ponte. Nesse caso, haverá maior número de moléculas de peroxidase disponível, por isso ela apresenta maior sensibilidade Bogliolo, 1998). Na técnica de ABC, o anticorpo é marcado com biotina, uma vitamina que tem grande afinidade pela proteína avidina, formando com ela um complexo estável. Tanto a avidina como a biotina podem ser conjugadas com enzimas (peroxidase ou fosfatase alcalina), de modo que a reação entre elas resulta na formação do conjugado avidina-biotina-enzima. Em geral, a avidina é usada como ponte entre a biotina ligada ao anticorpo e várias moléculas de biotina ligadas à enzima, conforme a figura 5. Assim, o sinal da reação aparece como resultado da atividade enzimática sobre o substrato (Boesnich, 1997). A elevada sensibilidade dos métodos PAP e ABC permite o reconhecimento de um grande número de componentes antigênicos nos tecidos, mesmo aqueles fixados de modo rotineiro (Bogliolo, 1998).