ANÁLISE E CRIOPRESERVAÇÃO DO SÊMEN DA PIABANHA Brycon insignis STEINDACHNER, 1877 (PISCES, CHARACIDAE) EDUARDO SHIMODA

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1 ANÁLISE E CRIOPRESERVAÇÃO DO SÊMEN DA PIABANHA Brycon insignis STEINDACHNER, 1877 (PISCES, CHARACIDAE) EDUARDO SHIMODA UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO CAMPOS DOS GOYTACAZES - RJ FEVEREIRO

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3 ANÁLISE E CRIOPRESERVAÇÃO DO SÊMEN DA PIABANHA Brycon insignis STEINDACHNER, 1877 (PISCES, CHARACIDAE) EDUARDO SHIMODA Tese apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigências para obtenção do título de Doutor em Produção Animal Orientador: Prof. Dalcio Ricardo de Andrade CAMPOS DOS GOYTACAZES RJ FEVEREIRO

4 ANÁLISE E CRIOPRESERVAÇÃO DO SÊMEN DA PIABANHA Brycon insignis STEINDACHNER, 1877 (PISCES, CHARACIDAE) EDUARDO SHIMODA Tese apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigências para obtenção do título de Doutor em Produção Animal Aprovada em 27 de fevereiro de 2004 Comissão Examinadora Prof. Manuel Vazquez Vidal Junior Prof. José Frederico Straggiotti Silva Prof. Hugo Pereira Godinho Prof. Dalcio Ricardo de Andrade Orientador

5 Á minha mãe Yukiko, ao meu pai Jin, aos meus irmãos Cláudio e Daniel, à minha noiva Karla, ao meu orientador Dalcio, DEDICO ii

6 AGRADECIMENTO Expresso meus agradecimentos a todos que direta e indiretamente colaboraram na realização deste trabalho. Em especial, agradeço: Ao prof. Dalcio Ricardo de Andrade, pela competente orientação e colaboração e pela, não menos presente e importante, amizade, compreensão, estímulo e cobranças, na vida profissional/acadêmica e na vida pessoal. Ao doutorando e amigo Manuel Vazquez Vidal Júnior, pela amizade, pelas sugestões e auxílio na co-orientação. Ao amigo George Shigueki Yasui, pela amizade, pelas sugestões e auxílio na coleta dos dados. À Pós-Graduação em Produção Animal da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, pela oportunidade concedida. À FENORTE e à FAPERJ, pelo apoio financeiro para realização dos experimentos. iii

7 À Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro e ao Projeto Piabanha, especialmente ao amigo Guilherme Souza, pelas instalações, animais, equipamentos e funcionários, cedidos para realização deste trabalho. Aos professores José Frederico Straggiotti Silva, Hugo Pereira Godinho, pela amizade, sugestões e auxílio na orientação dos trabalhos. Aos técnicos Carla, Fausto, Vânia, Cláudio, Acácio, pela amizade e pronta disponibilidade no empréstimo de equipamentos. A minha noiva Karla Rangel Ribeiro, pelo convívio, amizade e paciência. Aos amigos Rodrigo Brandão Barreto, Hebert Vasconcelos, Paulo (LMGA), Roberto, Antônio Peixoto Albernaz, José Leonardo Gualberto Ramos, Ioanes Sideres, Apóstolos Sideres Júnior, Antônio Guerra, Douglas Vitoi, Gerson Nakazato, Luiz Alberto de Nardi, dentre outros, pela amizade e convívio. Aos professores e funcionários da Universidade Estácio de Sá, da Facastelo, do CEFET, da FAETEC João Barcellos Martins, do Sistema Educacional Único, dos Cursos Pré-Vest/UENF e Opção 1, dos Colégios Salesiano, PA, Batista, CEFA, Alpha, Pró-Uni/Anglo, Vest/Exame, pela amizade e convívio. Aos meus alunos e ex-alunos, pelo grande aprendizado que me proporcionaram. A todos que, por um momento de descuido e esquecimento indesculpável não foram citados, mas que contribuíram sobremaneira para que eu pudesse chegar até aqui, e que merecem minha eterna gratidão. iv

8 BIOGRAFIA EDUARDO SHIMODA, filho de Jin Shimoda e Yukiko Shimoda, nasceu em Campinas, SP, em 19 de março de Em dezembro de 1990, formou-se auxiliar técnico Bioquímico pela Escola Técnica Estadual Conselheiro Antônio Prado, Campinas, SP. Em dezembro de 1995, graduou-se em Zootecnia pela Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, MG. Em março de 1999, obteve o título de mestre em Produção Animal, na área de Nutrição e Produção Animal, pela Universidade Estadual do Norte Fluminense, Campos dos Goytacazes, RJ. Em março de 1999, foi admitido no Programa de Pós-Graduação em Produção Animal, em nível de Doutorado, da Universidade Estadual do Norte Fluminense, realizando seus estudos na área de Nutrição e Produção Animal. Em agosto de 1999, ingressou na Universidade Estácio de Sá e na Faculdade de Castelo (ES), onde leciona até hoje. Em 27 de fevereiro de 2004, submeteu-se aos exames finais de defesa de tese. v

9 CONTEÚDO RESUMO...viii ABSTRACT...x 1. INTRODUÇÃO IMPORTÂNCIA DO ESTUDO DO SÊMEN DE PEIXES SITUAÇÃO ATUAL DE ESPÉCIES DA BACIA DO RIO PARAÍBA DO SUL A PIABANHA REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS CONCENTRAÇÃO ESPERMÁTICA E ESPERMATÓCRITO DO SÊMEN DA PIABANHA Brycon insignis CULTIVADA EM TANQUES INTRODUÇÃO MATERIAL E MÉTODOS RESULTADOS E DISCUSSÃO CONCLUSÕES REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS MOTILIDADE ESPERMÁTICA NA PIABANHA Brycon insignis: EFEITOS DA OSMOLARIDADE E DA INDUÇÃO HORMONAL COM EXTRATO BRUTO DE HIPÓFISE E UTILIZAÇÃO DO ANALISADOR DE MOTILIDADE ESPERMÁTICA ASSISTIDA vi

10 POR COMPUTADOR (CASA) INTRODUÇÃO MATERIAL E MÉTODOS RESULTADOS E DISCUSSÃO CONCLUSÕES REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANÁLISE QUÍMICA DO PLASMA SEMINAL DA PIABANHA Brycon insignis INTRODUÇÃO MATERIAL E MÉTODOS RESULTADOS E DISCUSSÃO CONCLUSÕES REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS DETERMINAÇÃO DA RAZÃO ÓTIMA DE ESPERMATOZÓIDES POR OVÓCITO NA PIABANHA Brycon insignis INTRODUÇÃO MATERIAL E MÉTODOS RESULTADOS E DISCUSSÃO CONCLUSÕES REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS CONSERVAÇÃO DO SÊMEN DA PIABANHA Brycon insignis POR RESFRIAMENTO A 4 o C E POR CONGELAMENTO EM N 2 LÍQUIDO INTRODUÇÃO MATERIAL E MÉTODOS RESULTADOS E DISCUSSÃO CONCLUSÕES REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS vii

11 RESUMO SHIMODA, EDUARDO. D.Sc. Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro. Fevereiro/2004. Análise e criopreservação do sêmen da piabanha Brycon insignis Steindachner, 1877 (Pisces, Characidae). Dalcio Ricardo de Andrade (orientador), Manuel Vazquez Vidal Júnior, José Frederico Straggiotti Silva e Hugo Pereira Godinho. A piabanha é uma espécie de peixe da bacia do rio Paraíba do Sul cuja população vem escasseando rapidamente nos últimos anos. As estratégias atuais para conservação da espécie consistem na implantação de centros de reprodução que, embora permitam o repovoamento, trabalham com poucos reprodutores. Em decorrência disto, verifica-se perda da biodiversidade genética. O objetivo deste trabalho foi estudar aspectos relacionados à análise seminal e à conservação do sêmen da piabanha Brycon insignis. Quanto à análise microscópica, foi verificada concentração espermática média de 24,38 x 10 9 espermatozóides/ml e espermatócrito de 16,14%. Os dois parâmetros se correlacionam significativa (P<0,01; R 2 = 75,9%) e positivamente segundo a equação de regressão: 14, , X. Verificou-se que o peso e o comprimento-padrão da piabanha não têm influência sobre a concentração espermática ou sobre o espermatócrito. No que se refere à motilidade, observou-se que os espermatozóides da piabanha não são ativados quando diluídos em soluções que contenham concentrações de NaCl superiores a 1,2%, podendo estas serem utilizadas em prédiluições não ativadoras da motilidade. Com base nesta informação foi testada uma metodologia de análise subjetiva da motilidade em duas etapas, consistindo em (1) viii

12 uma pré-diluição não ativadora da ordem de 1:100 (20 µl de sêmen diluídos em 2 ml de NaCl 1,2%) e (2) uma diluição ativadora da ordem de 1:5 (50µL da prédiluição µl de NaHCO 3 1%), sendo, desta maneira, possível observar os espermatozóides de forma individualizada e a ativação de todos simultaneamente. Verificou-se, ainda, que a indução hormonal com extrato bruto de hipófise de carpa aumenta a motilidade espermática subjetiva no sêmen da piabanha, quando esta foi inferior a 80% antes do tratamento. Para evitar subjetividade na análise da motilidade, foi adaptada uma configuração do analisador de motilidade computadorizado para análise do sêmen de piabanha, que permite a obtenção de parâmetros como percentual de espermatozóides móveis, percentual de espermatozóides progressivos e freqüência de batimento flagelar. No que diz respeito à capacidade fecundante do sêmen, foram testadas várias proporções espermatozóides por ovócito, sendo encontrada a proporção ótima de de espermatozóides por ovócito. Ainda com relação à caracterização do sêmen, foi procedida a análise química do plasma seminal da piabanha, sendo obtidos os seguintes resultados: ph = 8,47±0,286; [K + ] = 36,1±2,72mM; [Ca +2 ] = 0,96±0,088mM; [Mg +2 ] = 0,89±0,073mM; [Na + ] = 67,1±4,00mM; [Cl - ] = 85,0±3,56mM; Osmolaridade 286,9±24,6mOsm; [proteína] = 1,02±0,168mg/mL. Outro objetivo do trabalho foi verificar a possibilidade de conservação do sêmen por resfriamento e por criopreservação. Foi possível manter o sêmen resfriado a 4 o C por até 4 horas sem que ocorresse perda de viabilidade. Quanto à criopreservação, verificou-se que a proporção de 1 parte de sêmen para 5,2 partes de diluente (DMSO 10%, gema de ovo 10% e glicose 5%) é a recomendada para o sêmen de piabanha. Termos de indexação: criopreservação de sêmen, resfriamento de sêmen, motilidade espermática, concentração espermática, espermatócrito, análise seminal, análise química, sêmen de peixes, piabanha. ix

13 ABSTRACT SHIMODA, EDUARDO. D.Sc. Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro. Analisys and cryopreservation of piabanha Brycon insignis Steindachner, 1877 (Pisces, Characidae) sperm. Dalcio Ricardo de Andrade (advisor), Manuel Vazquez Vidal Júnior, José Frederico Straggiotti Silva and Hugo Pereira Godinho. Piabanha is a specie of fish from Paraiba do Sul river basin whose population is presenting a fast decrease in the recent years. The current strategies for conservation of the species consist in implantation of reproduction centers that, although provide the stock replacement, work with few spawners. In result, loss of genetical biodiversity is verified. The objective of this work was to study aspects related to seminal analysis and conservation of piabanha Brycon insignis semen. Concerning the microscopical analysis, was verified an average concentration of 24,38 x 10 9 spermatozoa/ml and spermatocrit of 16,14%. Both parameters correlated significantly (P<0,01; R2 = 75,9%) and positively according to the regression: 9.X. It was verified that the weight and the standard-length of piabanha do not shown influence on concentration or spermatocrit. With reference to motility, was observed that piabanha spermatozoa were not activated when diluted in solutions containing concentrations of NaCl above 1,2%, being suitable to be used in non activator pre-dilutions of the motility. Based in this information a methodology for subjective analysis of the motility in two stages was tested, consisting of (1) a non activator pre-dilution with 1:100 rate (20 µl of semen diluted in 2 ml of NaCl 1,2%) and (2) activator dilution with 1:5 rate (50µL of the 250 pre-dilution + 250µL of 1% NaHCO 3 ), becoming, by this way, feasible to x

14 observe spermatozoa individually and with simultaneous activation of them. It was verified, in addition, that hormonal induction with crude pituitary extract of carp increases the subjective spermatic motility in piabanha semen when it was lower than 80% before the treatment. To prevent subjectivity in the analysis of the motility, a configuration of the computer assisted sperm analysis (CASA) was adapted for piabanha sperm what allows the attainment of several parameters, as percentage of motile spermatozoa, percentage of progressive spermatozoa and flagelar beat frequence. In respect to the fecundation ability of the semen, some ratios of spermatozoa per oocyte was tested, being found the optimum ratio of spermatozoa per oocyte. Even with relation to the characterization of the semen, it was proceeded a chemical analysis of the seminal plasma of Piabanha, being found the following results: ph=8,47±0,286; [K + ] = 36,1±2,72mM; [Ca +2 ] = 0,96±0,088mM; [Mg +2 ] = 0,89±0,073mM; [Na + ] = 67,1±4,00mM; [Cl - ] = 85,0±3,56mM; Osmolarity = 286,9±24,6mOsm; [protein] = 1,02±0,168mg/mL. Another aim of this work was to verify the possibility of conservation of the semen by cooling and criopreservation. It was possible to keep the semen cooled at 4 o C for up to 4 hours without viability decreasing. Regarding to criopreservation, it was verified that the ratio of 1 semen part for 5,2 parts of diluent (DMSO 10%, egg yolk 10% and glucose 5%) is the recommended one for piabanha sperm. xi

15 12 1. INTRODUÇÃO 1.1. IMPORTÂNCIA DO ESTUDO DO SÊMEN DE PEIXES Apesar da relevância do processo de desova induzida (hipofisação) na produção de alevinos, pouca importância tem sido dada aos estudos de sêmen de peixes. Conhecimentos básicos, nesta área, são cada vez mais solicitados, principalmente, em função da necessidade de se dispor cada vez mais de sêmen congelado de boa qualidade e de uma maior capacidade fecundante e viabilidade do sêmen fresco. O Brasil apresenta grande diversidade de espécies nativas e de recursos genéticos que não são encontradas naturalmente fora da América do Sul. Muitas dessas espécies, entretanto, têm tido sua população reduzida, de forma rápida, em função de uma série de fatores. A poluição, a sobrepesca, a urbanização e a introdução de espécies exóticas são alguns desses fatores que podem ser citados, independentemente do tipo de reprodução da espécie, como contribuidores para redução do estoque de peixes. Outros fatores estão relacionados à estratégia reprodutiva de muitas espécies nativas. Essas realizam migração reprodutiva ascendente, desovando em lagos marginais recém-inundados por ocasião do aumento do nível dos rios na época das chuvas. Segundo CAROLSFELD e HARVEY (1999), a pesca em período de defeso e a construção de barragens são fatores que estão levando ao declínio nos estoques de peixe, especialmente as espécies de piracema. Passagens para peixes que permitem a migração rio acima e telas que mantêm os alevinos longe das turbinas, quando estes migram rio abaixo, funcionam bem para apenas com algumas

16 13 espécies. O fato é que tem sido verificada significativa redução de algumas espécies de peixes, tornando-se urgente o desenvolvimento de tecnologias que permitam sua sobrevivência. Uma das estratégias que têm sido utilizadas é a implantação de programas de repovoamento. Por exemplo, muitas companhias hidrelétricas instalam estações de piscicultura com objetivo de produção e soltura de alevinos nos rios. Entretanto, TOLEDO FILHO et al. (1992) citam problemas que podem estar relacionados ao procedimento adotado nessas estações. Dentre estes, a utilização de poucos reprodutores para produção dos alevinos. A percentagem de sobrevivência da prole, na natureza, é mínima quando comparada à obtida nas estações de piscicultura. Desta forma, embora o número de alevinos utilizados no repovoamento seja considerável, a diversidade genética destes é muito pequena. Isto implica perdas na heterozigosidade e na diversidade alélica. Ainda segundo os mesmos autores, a geração F1 do estoque reprodutor usado no repovoamento, potencialmente, apresenta efeitos da consangüinidade e da deriva genética. Não obstante, populações domesticadas há muito tempo e que foram selecionadas para domesticação já estão adaptadas às condições artificiais das estações de aqüicultura e, quando introduzidas nos rios, apresentarão menores chances de sobrevivência e crescimento do que as selvagens nativas. A implantação de bancos genéticos, incluindo a de sêmen criopreservado, constitui solução potencial para minimizar perdas decorrentes da ação antropogênica sobre os peixes nativos, garantindo a diversidade genética em programas de repovoamento. A estratégia para redução de recursos inclui o desenvolvimento de técnicas de reprodução artificial, de larvicultura e alevinagem, de coleta e de criopreservação de sêmen. Amostras de sêmen de peixes obtidos na natureza seriam criopreservadas e parte delas utilizadas nos procedimentos de desova artificial para repovoamento. O restante seria mantido em bancos para conservação dos recursos genéticos. Segundo LUBZENS et al. (1997) pode ser citada uma série de benefícios relacionados ao desenvolvimento de técnicas de criopreservação de gametas, como: facilidade de implantação de programas de melhoramento genético; viabilidade de aproveitamento de desovas quando se verifica falta de sincronia de maturação de machos e fêmeas; proteção dos estoques de reprodutores contra

17 14 patógenos oriundos de novas linhagens introduzidas no plantel; facilidade de transporte de material genético; além da possibilidade de conservação de recursos genéticos de espécies cujas populações venham escasseando. A determinação das características físicas, químicas e microscópicas do sêmen de uma espécie de peixe é essencial para o estabelecimento de protocolos de congelamento do sêmen. A partir destas características torna-se possível, por exemplo, a obtenção de soluções diluentes, utilizadas no congelamento, que não ativem os espermatozóides SITUAÇÃO ATUAL DE ESPÉCIES DA BACIA DO RIO PARAÍBA DO SUL A bacia do rio Paraíba do Sul exibe, no presente, expressiva alteração na qualidade da água. Embora em pontos localizados se evidenciem concentrações de poluentes diferenciados, a bacia como um todo se notabiliza por exibir altas concentrações de sólidos (em especial sedimentos) em suspensão, derivados principalmente dos processos erosivos que se estabelecem nas margens fortemente desmatadas. A transformação de grandes rios de águas límpidas em sistemas com altas cargas de sedimentos em suspensão é um processo com rebatimentos em diversos grupos da fauna aquática, tendo sido apontado como a causa de extinção de diversas espécies de peixes na região neártica. Segundo BIZERRIL (1998), a ausência de dados acerca da ictiofauna presente no rio Paraíba do Sul, em períodos anteriores aos grandes desmatamentos, impede avaliar a magnitude desse processo impactante sobre a fauna local ou, ainda, identificar a ocorrência de extinções dele derivadas. Pode-se, contudo, inferir que essa alteração ambiental mostra-se mais atuante sobre grupos que dependem da orientação visual para a captura de presas, podendo ser, portanto, uma das múltiplas causas que vêm contribuindo para o declínio das espécies de Brycon na bacia. Ainda segundo BIZERRIL (1998), o processo de extinção de espécies se dá em escalas de tempo distintas, podendo ser rapidamente evidenciado quando do desaparecimento de determinadas taxas ou reduções progressivas nos estoques de sua população, como se verifica com grupos como Standachneridion parahybae e Brycon spp.

18 15 A população da pirapitinga do sul Brycon opalinus, por exemplo, vem sofrendo declínio, principalmente, em rios do Vale do Paraíba, um de seus hábitats naturais, em conseqüência de fatores que interferem no comportamento migratório das espécies reofílicas, dentre eles, o desmatamento marginal dos rios, a poluição e a construção de barragens hidrelétricas. Diante deste fato, programas de povoamento e de repovoamento de rios e de reservatórios tornam-se necessários (TORLONI, 1992). Em outras situações, de detecção menos simples, a fragmentação no hábitat conduz à gradual redução na diversidade genética das populações afetadas, gerando, em longo prazo, seu desaparecimento A PIABANHA Piabanha é a denominação regional de espécie de peixe de água doce, caracterizada por suas escamas prateadas, pertencente à família Characidae, subfamília Bryconinae, gênero Brycon, classificada como Brycon insignis por Steindachner, em 1877 (FOWLER, 1950). É considerada espécie de grande porte, atingindo aproximadamente 8,0 a 10,0 kg de peso (NOMURA, 1984; SANTOS, 1987; PEREIRA, 1986). Hoje considerado um peixe raro, é encontrado somente nas cabeceiras dos rios e na foz do Rio Paraíba do Sul (PROJETO PIABANHA, dados não publicados). Possui o abdômen róseo e o dorso prateado. A mandíbula é projetada para a frente e a cabeça é achatada, duas características gerais de peixes predadores. Na década de 50, chegou a ocupar lugar de destaque na economia de certos municípios da região, sendo a 4 a espécie mais capturada na pesca comercial (MACHADO e ABREU, 1952). Quanto ao hábitat, aparece em corredeiras, principalmente, no tombo das cachoeiras. Segundo SALGADO et al. (1997), o período reprodutivo da espécie estendese de dezembro a fevereiro, o macho está apto a se reproduzir no segundo ano de vida quando alcança cerca de 20,0 cm de comprimento, e a fêmea, a partir do terceiro ano de vida, após atingir 25,0 cm de comprimento total. A fecundação dos óvulos é externa e a desova ocorre quando o nível das águas está em ascensão em virtude das chuvas de verão. A incubação dos ovos é realizada em lagoas marginais ou em áreas de remanso, onde os alevinos encontram alimento e refúgio para seu desenvolvimento. A sobrevivência dessa espécie encontra-se bastante ameaçada

19 16 pela poluição do rio Paraíba decorrente do lançamento de esgoto doméstico, industrial e agropecuário, como também pela introdução do dourado (Salminus maxillosus), um voraz predador. Estes fatores comprometeram seriamente a perpetuação dessas espécies. Quanto ao hábito alimentar, a piabanha é ictiófaga e insetívora quando jovem, e herbívora e frugívora quando adulta. Durante a larvicultura da piabanha é comum verificar-se canibalismo entre indivíduos, o que pode reduzir substancialmente o número de alevinos produzidos. Para se minimizarem as perdas, normalmente são usadas larvas de outras espécies de peixe, como o curimbatá, que servem como alimento para as piabanhas. No que se refere a sua utilização, é considerada espécie de alto valor comercial e muito apreciada pela resistência à captura com anzol na pesca esportiva. A exploração para fins comerciais é ainda praticamente inexistente, tendo as estações de piscicultura com criação de piabanhas apenas fins conservacionistas. Dentre as estações, tem-se a da CESP, localizada em Paraibuna, SP, e a do Projeto Piabanha, em Itaocara, RJ. Esta última tem desenvolvido projetos para aperfeiçoamento da produção de alevinos, que são utilizados para repovoamento no rio Paraíba do Sul. Os objetivos deste trabalho foram caracterizar química e microscopicamente o sêmen da piabanha, verificando a influência de alguns fatores, além de desenvolver metodologia que permita a criopreservação deste sêmen para formação de bancos genéticos. Os artigos a seguir foram editorados com base nos critérios da Revista Brasileira de Zootecnia, publicada pela Sociedade Brasileira de Zootecnia, com adaptações às normas para redação de tese da UENF.

20 17 REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS BIZERRIL, C.R.S.F., ARAÚJO, L.M.N., TOSIN, P.C. (1998) Contribuição ao conhecimento da Bacia do rio Paraíba do Sul Coletânea. ANEEL/CPRM. CAROLSFELD, J., HARVEY, B. (1999) Conservação de recursos genéticos de peixes: teoria e prática. Curso de Treinamento Brasileiro. Tradução de Hugo Pereira Godinho. Victoria, Canadá:World Fisheries Trust, 47 p. FOWLER, H. W. (1950) Os Peixes de Água Doce do Brasil. Arquivos de Zoologia, 6: LUBZENS, E., DAUBE, N., PEKARSKY, I., MAGNUS, Y., COHEN, A., YUSEFOVICH, F., FEIGIN, P. (1997) Carp (Cyprinus carpio L.) spermatozoa cryobanks Strategies in research and application. Aquaculture, 155: MACHADO, C.E.M., ABREU, E.C.F. (1952) Notas preliminares sobre a caça e a pesca no Estado de São Paulo - I) A pesca no vale do Paraíba. Boletim de Industria Animal, 13: NOMURA, H. (1984) Dicionário dos Peixes do Brasil. Brasília, Editerra, 482 p. PEREIRA, R. (1986) Peixes de Nossa Terra. 2 a Ed., Editora Nobel, 129 p. SALGADO, A.F.G., CHAIN, M.G., GIRARDI, L., FARIA, C.A. (1997) A conservação da piabanha (Brycon insignis) na Bacia do Rio Paraíba do Sul. Relatório Técnico- CESP, p SANTOS, E. (1987) Peixes de Água Doce (Vida e Costumes dos Peixes do Brasil) 4 a Ed. Editora Itatiaia Ltda.

21 18 TORLONI, C.E.C. (1992) Manejo dos recursos pesqueiros nos reservatórios da CESP. São Paulo:CESP-SP. 16p. (Série Pesquisa e Desenvolvimento, 63).

22 19 CONCENTRAÇÃO ESPERMÁTICA E ESPERMATÓCRITO DO SÊMEN DA PIABANHA Brycon insignis CULTIVADA EM TANQUES RESUMO: A concentração espermática é normalmente determinada através da contagem dos espermatozóides em câmaras volumétricas, após a diluição. O processo, entretanto, é relativamente demorado e necessita de um microscópio para ser realizado. O espermatócrito é obtido centrifugando-se o sêmen não diluído e verificando-se a percentagem em volume ocupada pelo precipitado. O objetivo deste trabalho foi, portanto, estabelecer uma equação de regressão entre os parâmetros concentração espermática e espermatócrito do sêmen de piabanha. Os exemplares (n=29) de piabanha Brycon insignis foram hipofisados, sendo posteriormente realizada a coleta de sêmen. O espermatócrito foi determinado utilizando-se minicentrífuga. A concentração espermática foi verificada por contagem em câmara de Neubauer, após diluição. A concentração espermática verificada (média±desvio padrão) foi de 24,38 ± 3,84 x 10 9 espermatozóides / ml, e o espermatócrito foi de 16,14±5,20 %. A equação de regressão:!#"%$ &' ($ 9 + 0, X foi significativa (P<0,01) e apresentou R 2 ajustado = 0,75. Deste modo, é possível estimar a concentração através da determinação do espermatócrito. Termos de indexação: concentração espermática; espermatócrito; análise seminal; piabanha.

23 20 ABSTRACT: SPERM CONCENTRATION AND SPERMATOCRIT OF SEMEN FROM PIABANHA Brycon insignis, CULTURED IN EARTHEN POND Sperm concentration commonly is determined through the counting of spermatozoa in volumetric chambers after the dilution. The process, however, is relatively slow and needs a microscope to be carried. The spermatocrit is obtained by centrifugation of not-diluited sperm and verifying the percentage of the total volume occupied by the precipitated sample. The objective of this work was, therefore, to establish a regression among the parameters spermatocrit and concentration in piabanha sperm. The specimen (n=29) of piabanha Brycon insignis was induced with crude pituitary extract of carp, being later carried for semen collection. The spermatocrit was determined using mini-centrifugal machine. The spermatical concentration was verified by counting in Neubauer chamber, after dilution. The verified spermatical concentration (average±standard deviation) was 24,38±3,84x10 9 spermatozoa/ml, and the spermatocrit was 16,14±5,20 %. The regression model: )+*-,/.#0%1,2, , X was significant (P<0,01) and presented an adjusted R 2 = 0,75. Thus, the estimation of spermatical concentration using the spermatocrit data is feasible. Key words: sperm concentration; espermatocrit; seminal analysis; piabanha.

24 21 1. INTRODUÇÃO A piabanha Brycon insignis é uma espécie de peixe encontrada, naturalmente, apenas na bacia do rio Paraíba do Sul e cuja população vem escasseando rapidamente em função de ações antropogênicas. A preservação da espécie tem sido tentada por meio de desenvolvimento de tecnologia de desova artificial em cativeiro. O procedimento adotado atualmente consiste na indução hormonal dos reprodutores e posterior extrusão dos gametas. A fecundação ocorre mediante adição de solução ativadora da motilidade espermática. Os cuidados com relação ao manejo do sêmen utilizado no processo resumem-se à verificação do volume adicionado e ao ato de se evitar seu contato com água antes da mistura com os ovócitos. Entretanto, a análise mais detalhada de parâmetros relacionados à qualidade seminal, como a concentração espermática, poderia proporcionar maiores índices de fertilização. A concentração ou densidade espermática expressa a quantidade de espermatozóides por volume de sêmen, podendo ser determinada através de contagem em câmaras volumétricas, mediante diluição do esperma. Valores de concentração, assim como suas variações de acordo com o peso e idade do peixe, época do ano, freqüência de coleta e porção do ejaculado foram estudados por diversos autores, inclusive no Brasil. Segundo CARVALHO (2001), a determinação da concentração espermática constitui importante passo que permite a otimização do sêmen em processos de

25 22 desova induzida de peixes rotineiramente utilizados em laboratórios de reprodução, evitando-se utilizações inadequadas de espermatozóides por ovócito. Dentre as várias espécies de peixe existentes no país, algumas já foram estudadas quanto à concentração espermática, sendo relativamente alta a variação intra e inter-específica (tabela 1). Tabela 1 Concentração espermática no sêmen de algumas espécies brasileiras de água doce Nome comum / Espécie Concentração espermática* Autor Piabanha / Brycon insignis 24,4 25,1 ANDRADE-TALMELLI et al. (2003) Pacu / Piaractus mesopotamicus 31,7 43,1 SHIMODA (1999) Curimbatá / Prochiludus marggravii 19,2 26,6 GODINHO e COSER (1995) 8,6 28,7 SHIMODA et al. (1997) Bagre / Rhamdia hilarii 66,5 KAVAMOTO e SILVEIRA (1986) Curimbatá / Prochilodus lineatus 13,3 20,5 GODINHO e COSER (1995) 14,1 20,3 RIBEIRO (2001) Dourado / Salminus maxillosus 4,3 10,8 GODINHO e COSER (1995) Piapara / Leporinus elongatus 7,0 16,0 GODINHO e COSER (1995) Pintado / Pseudoplatystoma coruscans 8,0 16,0 GODINHO e COSER (1995) Piau-açu / Leporinus macrocephalus 11,2 ± 2,8 RIBEIRO (2001) * espermatozóides x 10 9 / ml. Outros estudos relacionados à concentração espermática também foram realizados. No que se refere à correlação entre a concentração espermática e o peso dos peixes, não foi notada significância entre os dois parâmetros no Scophthalmus maximus, na faixa de peso entre 1,4 e 3,2 Kg (SUQUET et al., 1992). A ausência de correlação significativa também foi verificada em trutas Oncorhynchus mykiss em trabalho realizado por KAVAMOTO et al. (1987). Com relação à freqüência de amostragem e à época do ano, foi observado que, quando as amostragens no turbot Scophthalmus maximus ocorreram regularmente por dois meses, a concentração observada ao fim da coleta foi significativamente menor nas coletas semanais e quinzenais quando comparadas a

26 23 amostragens mensais (SUQUET et al., 1992). Em truta Oncorhynchus mykiss, um similar decréscimo também é observado para as mesmas freqüências de amostragem (BUYUKHATIPOGLU e HOLTZ, 1984). Experimento realizado por OLIVEIRA et al. (1991) revelou gradativa redução na concentração espermática de carpas Cyprinus carpio nas coletas seminais periódicas (período total = 71 dias). De forma semelhante, FAUVEL et al. (1999) realizou experimentos com Dicentrarchus labrax e verificou que a concentração espermática decresce ao longo do período reprodutivo. O valor máximo obtido foi de 60 x 10 9 espermatozóides/ml e, em função de freqüentes coletas, o período reprodutivo foi encurtado. Outro campo de estudo envolvendo a concentração espermática diz respeito aos métodos utilizados para sua determinação. Um desses métodos, que permite a determinação do número de espermatozóides por ml de sêmen, é a contagem em câmara hematimétrica de Neubauer. Este procedimento foi utilizado por diversos autores no Brasil (TAITSON e GODINHO, 2003; ANDRADE-TALMELLI et al., 2001; SILVEIRA et al., 1990; KAVAMOTO et al., 1987; SILVEIRA et al., 1985; KAVAMOTO et al., 1985, dentre outros) e em outros países (CIEREZKO e DABROWSKI, 1993; FAUVEL et al., 1993; VILLANI e CATENA, 1991; KAZANOV, 1981; BILLARD et al., 1971, dentre outros). A utilização da câmara de Neubauer, entretanto, apresenta alguns inconvenientes. TATSON E GODINHO (2003) afirmam que há necessidade de se esperar a precipitação dos espermatozóides no fundo da câmara e que, para sua utilização, é preciso realizar altas diluições, que poderiam incorrer em erros. Métodos alternativos têm sido propostos, podendo-se citar a contagem na câmara de Makler (TATSON e GODINHO, 2003; RIBEIRO, 2001; RAVINDER et al., 1997; LAHNSTEINER et al., 1998), a espectrofotometria (SILVEIRA et al., 1987; CIERESZKO e DABROWSKI, 1993) e o espermatócrito (RIBEIRO, 2001; LIM et al., 2002; POOLE e DILLANI, 1998; CIERESZKO e DABROWSK, 1993; KAVAMOTO et al., 1986). A análise de regressão entre os parâmetros número total de espermatozóides e espermatócrito (em mm) revelou-se significativa (P<0,05) em algumas espécies de peixes estudadas, sendo recomendada a utilização das equações de regressão para determinação rápida e acurada da concentração espermática. CIERESZKO e DABROWSKI (1993) obtiveram correlações significativas (P<0,0001) para entre a concentração espermática, calculada a partir

27 24 de contagem em câmara de Neubauer, e o espermatócrito, nas espécies Oncorhynchus mykiss (R 2 = 95,5%), Coregonus clupeaformis (R 2 = 79,1%) e Perca flavescens (R 2 = 95,8%). A equação da regressão número total de espermatozóides x espermatócrito (em mm) revelou-se significativa (P<0,05) para a espécie Prochilodus scrofa, apresentando R 2 = 0,95 (KAVAMOTO et al., 1986). Em amostras seminais de Rhamdia hilarii (KAVAMOTO e SILVEIRA, 1986) e Onchorynchus mykiss (KAVAMOTO e SILVEIRA, 1985), foram obtidos coeficientes de correlação de 0,85 e 0,75, respectivamente. Em contraste com estudos citados, não foi obtida correlação significativa no turbot Scophthalmus maximus (SUQUET et al., 1994). As espermátides, que possuem um volume muito maior que os espermatozóides, são freqüentemente observadas em amostras seminais de turbot ao início do período de espermiação. Além disso, alterações morfológicas no espermatozóide podem ser verificadas no final do período de espermiação. Estes dois fatos podem contribuir para a variação no valor do espermatócrito do turbot. O objetivo deste trabalho foi verificar a viabilidade de utilização do espermatócrito como método para determinação da concentração espermática, bem como verificar a influência do peso e do comprimento-padrão sobre a concentração e o espermatócrito.

28 25 2. MATERIAL E MÉTODOS Exemplares da espécie Brycon insignis foram pescados no rio Paraíba do Sul e transportados até a Estação Experimental do Projeto Piabanha, localizado no Município de Itaocara RJ, distante 110 km do Município de Campos dos Goytacazes RJ. Após domesticação, esses peixes foram submetidos ao procedimento de desova induzida, originando a primeira geração de filhos (F1). Estes, por sua vez, foram criados na Estação recebendo ração extrusada na fase adulta a uma proporção de 2% do peso vivo/dia, em tanques com aproximadamente 600 m 2 e densidade de estocagem de 800g de peixe/m 2 de lâmina d água, até atingirem maturidade sexual com 2 ou 3 anos de idade. Os experimentos transcorreram durante a estação natural de reprodução, entre os meses de outubro e fevereiro. Os peixes foram despescados dos tanques externos de cultivo, sendo os machos que apresentaram elevado grau de maturação (vertência de sêmen sob compressão abdominal) selecionados e transportados até o laboratório, onde foi procedida a biometria (medição do peso e comprimento-padrão) dos animais. Os exemplares utilizados apresentaram peso médio de 229,03 g e comprimento médio de 25,66 cm. A seguir, procedeu-se a hipofisação, segundo WOYNAROVICH e HORVATH (1985), utilizando-se 0,5 mg de extrato bruto pituitário de carpa/kg PV, sendo, então, os exemplares colocados em um tanque interno do laboratório, na presença de fêmeas.

29 26 O sêmen foi extrusado 240 h.grau após a hipofisação, através de massagem abdominal no sentido ântero-posterior, sendo coletado em tubos de vácuo de 5 ml para posterior análise. O poro urogenital assim como as regiões adjacentes foram devidamente secos e limpos e as porções do sêmen contaminadas com sangue e/ou urina descartadas. Para determinação da concentração espermática, as amostras seminais, coletadas a partir de 29 exemplares de piabanha, foram diluídas (1:1000) em 20 ml de solução de formol-salina (HANCOCK, 1957), utilizando-se uma pipeta de Eppendorff (0,02 ml). As amostras foram mantidas em local fresco e sombreado, sendo procedida a contagem ao microscópio de pelo menos 300 espermatozóides (aumento de 400 vezes) na câmara hematimétrica de Neubauer "improved", no dia seguinte à coleta, segundo SILVEIRA et al. (1987). A contagem foi repetida 4 vezes, sendo o resultado individual da concentração de cada exemplar uma média das 4 contagens multiplicadas por O espermatócrito foi determinado a partir das amostras (não diluídas) dos mesmos 29 exemplares de piabanha, sendo as amostras analisadas no mesmo dia da coleta. Alíquotas de sêmen foram coletadas em tubos capilares de 75 mm e analisadas em mini-centrífuga portátil Bayer Diagnostics, equipada com um rotor de tubos capilares, a rpm durante 15 min, sendo o resultado expresso em percentagem de volume ocupado pelo precipitado em relação ao volume total (CIERESZKO e DABROWSKI, 1993). A equação de regressão, entre os parâmetros espermatócrito x concentração, teve sua significância testada pelo teste F (PIMENTEL GOMES, 2000). Foram avaliados, ainda, os efeitos do peso e do comprimento-padrão sobre os parâmetros concentração espermática e espermatócrito. Médias, desviospadrão, limites de confiança (P<0,05) e coeficientes de variação dos parâmetros peso, comprimento-padrão, concentração espermática e espermatócrito também foram calculados. As análises estatísticas foram realizadas no aplicativo SAEG Sistema de Análises Estatísticas e Genéticas.

30 27 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO Os dados individuais, médias, medidas de dispersão (desvio-padrão, coeficiente de variação) e valores máximos e mínimos relacionados à biometria, à concentração espermática e ao espermatócrito da piabanha podem ser observados na tabela 2. O tratamento hormonal com extrato bruto pituitário de carpa, na dosagem de 0,5 mg por kg de peso vivo, foi utilizado no intuito de estimular a produção seminal das piabanhas. SILVEIRA et al. (1987) também induziram hormonalmente a reprodução dos exemplares, entretanto, com gonadotropina coriônica humana (HCG), na dosagem de 5 UI/g de peso vivo. Segundo BILLARD (1987), a estimulação hormonal pode induzir aumento no volume de sêmen. SHIMODA et al. (1997) não encontraram diferenças significativas no volume de sêmen de Prochilodus marggravii hipofisados e não hipofisados, embora o volume obtido tenha sido superior nos primeiros. GARCIA (1993) obteve aumento significativo em resposta à aplicação de LHRHa em Siganus guttatus. No presente experimento, a aplicação de hipófise teve como objetivo aumentar o volume de sêmen produzido e simular o procedimento rotineiro utilizado nas estações de piscicultura, proposto por WOYNAROVICH e HORVATH (1983).

31 28 Tabela 2 - Dados individuais, médias (X), desvios-padrão (S), coeficientes de variação (C.V.), valores mínimos e máximos, e intervalos de confiança (I.C. P<0,05) da biometria (peso e comprimento-padrão), da concentração espermática e do espermatócrito do sêmen do Brycon insignis (piabanha) hipofisado Exemplar Peso (g) Comprimentopadrão (cm) Concentração espermática (x10 9 sptz*/ml) Espermatócrito (%) , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,6 14 X ,7 24,38 16,14 s 26,36 1,47 3,84 5,2 C.V. (%) 11,51 5,73 15,74 32,23 I.C. (P<0,05) ,92-25,84 14,16-18,12 * sptz = espermatozóides. No experimento realizado, as concentrações mínima e máxima, em espermatozóides x 10 9 / ml, foram de 22,9 e 25,8, respectivamente. Esta variação foi próxima à obtida por ANDRADE-TALMELLI (2003), trabalhando também com a piabanha, porém, menor do que a verificada na maioria das espécies brasileiras de

32 29 água doce (tabela 1). Possivelmente, a variação relativamente baixa nas concentrações espermáticas verificadas neste trabalho foi em função da homogeneidade do grau de maturidade da maioria dos exemplares, ao contrário do que pode ter ocorrido nas outras espécies citadas na tabela 1. Mesmo apresentando vertência de sêmen sob compressão do abdômen, os peixes poderiam apresentarse em diferentes pontos da curva de produção seminal. Variações individuais numa mesma espécie podem ocorrer. Nas estações de piscicultura, é comum, durante a seleção de reprodutores que serão submetidos à indução hormonal, encontrarem-se vários exemplares vertendo sêmen mediante massagem abdominal. Entretanto, estes peixes, considerados maduros, muitas vezes podem não estar no ápice da produção espermatogênica. No Brasil, OLIVEIRA et al. (1991), trabalhando com a carpa Cyprinus carpio, realizaram coletas periódicas, durante 71 dias, sendo obtida uma regressão cúbica entre os parâmetros volume de sêmen e dia de coleta (P<0,01). CLEMENS e GRANT (1965) observaram que o volume de sêmen de uma carpa aumentou até o 48 o dia, declinando em seguida. O valor médio de concentração espermática (tabela 2), obtido no sêmen dos peixes hipofisados, de 24,38 x 10 9 espermatozóides/ml, foi muito próximo ao da concentração de 24,76 x 10 9 espermatozóides/ml, verificado também por ANDRADE-TALMELLI et al. (2001) em piabanhas não hipofisadas. O espermatócrito, por outro lado, apresentou coeficiente de variação relativamente alto (32%). A explicação para este coeficiente de variação talvez seja a presença de algumas células da linhagem germinativa que não os espermatozóides, como por exemplo espermátides. Estas puderam ser observadas ao microscópio quando da contagem em câmara de Neubauer. Entretanto, a observação ao microscópio permite a contagem exclusivamente dos espermatozóides, enquanto que o espermatócrito é medido em função do volume proporcional das frações precipitadas na centrifugação. Este fato tem especial importância quando se considera que as espermátides têm volume significativamente maior e sua presença poderia alterar bastante o espermatócrito. No que se refere a relação entre concentração espermática e espermatócrito, a figura 1 mostra que os dois parâmetros se relacionam intimamente. Percebe-se que, de forma geral, quanto maior a concentração espermática, maior o espermatócrito.

33 30 A partir desses valores de concentração espermática e espermatócrito foi obtida a seguinte equação de regressão: #9%: 6;'6(: 9 + 0, X Onde: 3 <>=@?BADCEFAHGJI'KL X = Espermatócrito (%) ão estimada (sptz/ml) A regressão foi significativa (P<0,01) e mostrou alto coeficiente de determinação (R 2 = 75%), o que evidencia a relação entre os dois parâmetros. É possível, portanto, estimar a concentração espermática a partir da obtenção do espermatócrito. Este resultado encontrado corrobora CIERESZKO e DABROWSKI (1993), que verificaram a possibilidade da estimativa da concentração a partir do espermatócrito de truta arco-íris Oncorhynchus mykiss, sendo o coeficiente de determinação obtido superior ao verificado neste experimento (R 2 =95,5%). Figura 1: Concentração espermática e espermatócrito obtidos a partir da piabanha Brycon insignis hipofisada (n=29).

34 31 No Brasil, também foi possível estabelecer a correlação para a espécie Prochilodus scrofa, cuja equação de regressão apresentou R 2 = 0,95 (KAVAMOTO et al., 1986). Embora o coeficiente de determinação obtido neste experimento tenha sido inferior ao verificado nas espécies anteriormente citadas, o valor é muito próximo ao verificado por KAVAMOTO et al. (1985), que trabalharam com Onchorynchus mykiss e obtiveram R 2 = 0,75. Por outro lado, SUQUET et al. (1994), trabalhando com o turbot Scophthalmus maximus, não obtiveram correlação significativa entre os parâmetros concentração espermática e espermatócrito. Segundo esses autores, espermátides são freqüentemente observadas em amostras seminais da espécie ao início do período de espermiação. Embora a presença de espermátides tenha sido observada neste experimento, a quantidade mostrou-se reduzida, já que a maioria dos peixes utilizados encontravam-se em meio à estação reprodutiva, inclusive, sendo verificadas fêmeas com elevado grau de maturação gonadal que estavam sendo utilizadas para desova. Nenhuma das demais correlações testadas, entre peso x concentração, peso x espermatócrito, comprimento-padrão x concentração e comprimento-padrão x espermatócrito, foi significativa (P<0,05). Esse resultado corrobora SUQUET et al. (1992) e KAVAMOTO et al. (1987), que não verificaram influência do peso dos peixes sobre a concentração espermática. Cabe ressaltar que, neste trabalho, os peixes apresentaram portes semelhantes, hajam vista, os baixos coeficientes de variação observados no peso, de 11,5%; e no comprimento-padrão, de 5,7%.

35 32 4. CONCLUSÕES A concentração espermática da piabanha (média = 24,38 x 10 9 espermatozóides/ml) apresenta baixa variação entre indivíduos (CV = 15,7%), enquanto que o espermatócrito (média = 16,14%) é mais variável (CV = 32,2%). A equação de regressão: M N OQP RTSUOWV'O(S 9 + 0, X revelou-se significativa (P<0,01; R 2 = 75,9%), sendo possível, a partir do espermatócrito (X), em %, estimar a concentração espermática (M ), em espermatozóides/ml, do sêmen de piabanha. O peso e o comprimento-padrão da piabanha não têm influência sobre a concentração espermática ou sobre o espermatócrito.

36 33 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANDRADE-TALMELLI, E.F., KAVAMOTO, E.T., FENERICH-VERANI, N. (2001) Características seminais da piabanha, Brycon insignis (Steindachner, 1876), após estimulação hormonal. B. Inst. Pesca, 27 (2): BILLARD, R. (1987) The reproductive cycle of male and female brown trout (Salmo trutta fario):a quantitative study. Reprod. Nutr. Dev. 27: BILLARD, R., BRETON, B., JALABERT, B. (1971) La production spermatogénètique chez la truite. Ann. Biol. anim. Bioch. Biophys., 11(2): BUYUKHATIPOGLU, S., HOLTZ, W. (1984) Spermoutput in rainbow trout (Salmo gairdneri) Effect of age, timing and frequency of stripping and presence of females. Aquaculture, 37: CARVALHO, A.M.R. (2001) Criopreservação do sêmen da piapara (Leporinus elongatus) Dissertação (Mestrado em Zoologia dos Vertebrados) Belo Horizonte, MG, Pontifícia Universidade Católica de Minas Gerais, 56 p. CIERESZKO, A., DABROWSKI, K. (1993) Estimation of sperm concentration of rainbow trout, whitefish and yellow perch using a spectrophotometric technique. Aquaculture, 109: CLEMENS, H.P., GRANT, F.B. (1965) The seminal thinning response of carp (Cyprinus carpio) and rainbow trout (Salmo gairdneri) after injections of pituitary extracts. Copeia, 2:

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