Jéssica Dias. Desenvolvimento e avaliação de uma cerveja contendo Chá Amargo como substituinte de 50% do lúpulo.

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1 UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA Jéssica Dias Desenvolvimento e avaliação de uma cerveja contendo Chá Amargo como substituinte de 50% do lúpulo. Lorena- 2014

2 Jéssica Dias Desenvolvimento e avaliação de uma cerveja contendo Chá Amargo como substituinte de 50% do lúpulo. Trabalho de conclusão do curso de Engenharia Bioquímica. Área de concentração: cervejeira. Orientador: Prof. Dr. João Batista de Almeida e Silva. Lorena- 2014

3 AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE. CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO Serviço de Biblioteca Escola de Engenharia de Lorena Dias, Jéssica Desenvolvimento e avaliação de uma cerveja contendo Chá Amargo como substituinte de 50% do lúpulo. / Jéssica Dias. - Lorena, p. Monografia apresentada como requisito parcial para a conclusão do Curso de Graduação de Engenharia Bioquímica - Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo. Orientador: João Batista de Almeida e Silva. 1. Chá Amargo 2. Cerveja 3. Contaminação 4. Lúpulo. I.Almeida e Silva, João Batista, Orient.

4 AGRADECIMENTOS À minha mãe, Cleuza Dias da Rosa, pela constante presença, apoio e motivação, por sempre ter sido, para mim, um exemplo de determinação, respeito e amor. Sem você a caminhada teria sido muito mais árdua. À minha querida irmã, Thamíris Dias Oliveira, pela companhia constante, tornando meus dias mais divertidos, intensos e repletos de reflexão. Aos meus tios, tias e avós, que me mostraram o poder da família e me ensinaram o valor da solidariedade. Ao meu amado amigo de tempos, Julius Augustus Prado, por todo amor, cuidado e atenção dedicados a mim durante minha graduação (e antes dela) e pela motivação em meu trabalho e estudos na área de cerveja. Ao Profº Drº João Batista de Almeida e Silva, por ter me orientado neste trabalho. Aos professores Dr. Ismael Maciel de Macilha e Dra. Maria Berdadete de Medeiros pela colaboração ao cederem seus laboratórios para realização de parte dos experimentos. Aos queridos Rafaela Leite Marçal e Flávio Ferraz por todo o tempo e paciência dispensados em me ajudar com os experimentos deste trabalho. Ao Diogo Henrique Hendges pelo seu entusiasmo em falar e ensinar sobre a área cervejeira que, inevitavelmente, me levou a descobrir minha paixão por ela. À Escola de Engenharia de Lorena e a todos os professores que me mostraram vários motivos para me apaixonar pela Engenharia Bioquímica e sentir orgulho desta instituição. A todas as amizades que nasceram desta época, da minha graduação em Engenharia Bioquímica, por terem feito, destes anos, anos felizes.

5 Resumo DIAS, JÉSSICA.; Desenvolvimento e avaliação de uma cerveja contendo Chá Amargo como substituinte de 50% do lúpulo f. Trabalho de conclusão de curso - Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo, Lorena, Neste projeto, foram produzidos 15 litros de uma cerveja puro malte, com concentração alcoólica de 5,1 GL e 25 IBU e outros 15 litros de uma cerveja puro malte, concentração alcoólica de 4,8 GL e IBU próximo a 25. As matérias primas utilizadas na produção do mosto foram: malte tipo Pilsen, lúpulo Zeus e a água fornecida pela Sabesp à Microcervejaria da EEL-USP. O fermento utilizado, na produção da bebida, foi a Saccharomyces cerevisiae PPB-01, uma levedura de baixa fermentação, produzindo uma cerveja do tipo lager. No entanto, as cervejas diferenciam-se, pois, em uma colou-se a metade da massa de lúpulo colocado na outra. Além disto, à composição com menos lúpulo, foram adicionados 500,00 ml de Chá Amargo, uma bebida fitoterápica composta por quatro ervas, comumente encontrada em farmácias de manipulação do sul de Minas Gerais. Os mostos foram preparados separadamente seguindo a mesma curva de aquecimento e o mesmo processamento, sendo que, durante a etapa de fervura adicionouse 12,0 g de lúpulo no mosto que produziria a cerveja sem o chá e 6,0 g no outro mosto. Em seguida, foi adicionado, ao mosto com 50 % de lúpulo, o Chá Amargo, gradativamente, até atingir um amargor comparável ao mosto sem o chá. Posteriormente ambas as cervejas foram maturadas, carbonatadas naturalmente, envasadas e pasteurizadas. As cervejas foram comparadas e, quanto ao processo fermentativo, o desempenho de ambas foram muito parecidos, também não se encontrou grandes diferenças nas características sensoriais das bebidas, sendo que ambas tinham sabor, cor e aroma agradável. Palavras chaves: Chá Amargo, cerveja, contaminação, lúpulo.

6 Sumário 1. OBJETIVO INTRODUÇÃO... 8 História... 8 Matérias-primas... 9 Processamento Chá Amargo Contaminação METODOLOGIA Preparo do reator e garrafas para enfase Preparo do mosto Fermentação e maturação Engarrafamento e carbonatação Pasteurização Refrigeração Análise de contaminação Lâmina com óleo de imersão Coloração de Gram Medida de acidez RESULTADOS E DISCUSSÃO Preparo da cerveja Inoculação Fermentação Análise de contaminação Sensorial CONCLUSÃO REFERÊNCIAS... 29

7 7 1. Objetivo Este trabalho tem como objetivo a comparação de duas cervejas Pilsen, puro malte, que seguiram as mesmas metodologias de fabricação, sendo que em uma foi colocado apenas 50% na massa de lúpulo utilizada na outra. A cerveja com menos lúpulo levou, também, em sua composição, Chá Amargo, bebida fitoterápica composta por quatro espécies de ervas e de amargor elevado. Com a redução na concentração de lúpulo aumentou-se as chances de contaminação bacteriana, já que esta flor tem ação bactericida. Por este motivo foram comparadas quanto à contaminação, além de padrão fermentativo, e sensoriais.

8 8 2. Introdução História Estima-se que a prática de cervejaria teve início por volta de a.c, na região da Mesopotâmia, território onde hoje estão Irã e Irauque, onde a cevada cresce em sua forma selvagem. A cerveja foi desenvolvida paralelamente aos processos de fermentação de cereais tendo se difundido lado a lado com as culturas de milho, centeio e cevada abundante nas antigas sociedades. Há registros sobre a utilização da cerveja na Antiguidade entre os povos da Suméria, Babilônia e Egito. A bebida também foi produzida por gregos e romanos durante o apogeu dessas civilizações (VENTURINI FILHO, 2010). Sabe-se que, na idade média o lúpulo foi introduzido como matéria-prima na fabricação de cerveja. Os povos germânicos foram os primeiros a utilizar esta flor e, ao longo dos séculos, se destacaram na produção cervejeira (AQUARONE, 2001). Naquela época não havia regulamentação sobre a produção desta bebida, mas em 1516 foi criada a lei Reinheitsgebot, que ficou conhecido como lei de pureza alemã. Ela regulamentava que a cerveja só poderia ter três ingredientes: água, lúpulo e cevada (EISENBAHN), no entanto, nas escolas belgas e inglesas o uso de açúcar, frutas e outras especiarias era, e ainda é, bastante comum.a utilização do lúpulo se difundiu pelo mundo todo e hoje ele é um elemento essencial na fabricação de cerveja, sendo importante na caracterização do sabor e aroma da bebida, mas também tem a propriedade de conservar a cerveja, já que tem ação antisséptica (AQUARONE, 1983). No Brasil, o consumo de cerveja foi introduzido durante a permanência da família real portuguesa no século XIX (AMBEV). Inicialmente a bebida era importada de países europeus, mas em 1888 passou a ser produzida no Rio de Janeiro, com a abertura da Brahma e em 1891 em São Paulo pela Antarctica (AQUARONE, 2001). Segundo a CervBrasil (Associação Brasileira da Indústria da Cerveja), o Brasil ocupa o posto de terceiro maior produtor mundial de cerveja, perdendo apenas para China e EUA; o setor é responsável, diretamente, por 1,7 milhões de empregos e responde por 1,7% do PIB nacional (CERVBRASIL). De acordo com a legislação brasileira, Cerveja é a bebida obtida pela fermentação alcoólica do mosto cervejeiro oriundo do malte de cevada e água potável, por ação da

9 9 levedura, com adição de lúpulo. (RECEITA FEDERAL). Ela é classificada segundo o seu extrato primitivo (leve, comum, extra ou forte), a sua cor (clara, escura ou colorida), seu teor alcoólico (sem álcool, com álcool), sua proporção de malte de cevada (cerveja puro malte, cerveja ou cerveja com o nome do vegetal predominante) e o seu tipo de fermentação (baixa ou alta). Ainda de acordo com a legislação vigente no país, as cervejas de baixa fermentação são classificadas como "Lager", e as de alta fermentação como "Ale". Há ainda outras classificações, como "Pilsen", "Export", "Munchen", "Bock", "Malzebier", entre outros, que envolvem características específicas de levedura, temperatura, extrato, etc (VENTURINI FILHO, 2010). Matérias-primas Água: o principal ingrediente na fabricação da cerveja. Representa de 90 a 96% do volume final, e suas características influenciam o produto. A concentração e tipo de sais presentes na água influem na característica das cervejas e deve-se atentar se a água utilizada é apropriada à cerveja que será produzida. Cervejas do tipo Pilsen necessitam de água pobre em magnésio e cálcio, na forma de cloretos, sulfatos ou bicarbonatos (VENTURINI FILHO, 2010). Os requisitos básicos para uma boa água cervejeira são: a) Ser potável, transparente, incolor, inodora e livre de sabores estranhos. b) Deve apresentar, na fonte, alcalinidade máxima de 50 mg/l (preferencialmente 25 mg/l) e, dento deste limite, ph na faixa de 4 e 9. c) Possuir concentração de cálcio ao redor de 50 mg/l(aquarone, 2001). Malte: o termo define a matéria-prima resultante da germinação, sob condições controladas, de qualquer cereal (trigo, cevada, arroz, milho...). Quanto não há indicação do cereal utilizado na produção da cerveja, subentende-se que é a cevada, já que é o mais utilizado, pois apresenta menores dificuldades técnicas no processo de maltagem, comparado a outros cereais igualmente disponíveis (AQUARONE, 2001). Além disso, a cevada maltada confere sabor, aroma e corpo característicos à cerveja. Há vários tipos de malte de cevada, eles se diferem pelo processo de maltearia, e influem gerando características distintas no aroma, sabor, cor e corpo da bebida. Pode-se utilizar apenas um malte na

10 10 produção da cerveja, ou um blend de maltes, gerando cervejas mais complexas (VENTURINI FILHO, 2010). Lúpulo: planta dióica que é acrescida à produção da cerveja, conferindo amargor, sabor e aroma à bebida, além de ter ação antisséptica, pois contém ácidos bateriostáticos (AQUARONE, 2001). Existem vários tipos de lúpulo, sendo que sua classificação se dá pela sua característica mais marcante, ou seja, lúpulo de amargor (que apresentam alto teor de α ácidos), sabor ou aroma (rico em β-ácidos), podendo-se utilizar um ou mais tipos na fabricação de uma cerveja (VENTURINI FILHO, 2010). A quantidade a ser utilizada depende da IBU (International Bitternes Units Unidade Internacional de Amargor) que se deseja que a cerveja apresente, o IBU quantifica o amargor da bebida, e do lúpulo que está sendo utilizado. Adjuntos: são carboidratos não maltados que complementam ou suplementam o malte de cevada cerveja (VENTURINI FILHO, 2010) e devem estar dentre os permitidos por lei. No Brasil, pode-se substituir o malte de cevada pelo adjunto em até 80% do peso total, sendo que não há uma regra geral sobre a utilização de adjuntos. Normalmente, os adjuntos são cereais ou vegetais de alta disponibilidade, ricos em carboidratos e de baixo custo, favorecendo para o barateamento da bebida. Podem também ser utilizados para melhorar a qualidade físico-química e sensorial da cerveja acabada (AQUARONE, 2001). Processamento O processo cervejeiro, basicamente, se divide em cinco etapas: produção do mosto, fermentação, maturação, clarificação e carbonatação. Há subdivisões em cada uma destas etapas e metodologias diferentes a serem seguidas de acordo com a cerveja que se deseja produzir, ou de acordo com a matéria prima que será utilizada (AQUARONE 2001). Na produção do mosto é feita a moagem, a mosturação e a filtração, seguida pela fervura e resfriamento do mosto. A moagem refere-se ao esmagamento do malte e não a transformá-lo em pó (AQUARONE 2001) e tem influencia sobre as demais etapas do processo. Seus objetivos são romper a casca expondo o endosperma e desintegrá-lo

11 11 totalmente a fim de promover uma melhor ação enzimática, também está dentre os objetivos a produção mínima de farinha, já que esta produz uma quantidade excessiva de pasta no meio (VENTURINI FILHO, 2010). São utilizados moinhos de dois rolos quando se trabalha com grãos mais moles, já quando se utiliza grãos mais duros deve-se empregar moinhos de seis rolos (AQUARONE 2001). A mosturação, ou brassagem, é a transformação das matérias-primas em mosto, por meio de uma curva de aquecimento, que é defina de acordo com a cerveja que se deseja produzir. Seu objetivo é solubilizas as substâncias solúveis em água e também as insolúveis, estas com auxilio de enzimas diferentes que atuam em temperaturas específicas. A ação das enzimas produz um mosto com 70-80% de açúcares fermentescíveis, como glicose, maltose e matotriose. O malte é colocado em água quente, cerca de 35 C, na proporção de 1:4, sendo que o ph deve ser ajustado, com ácido lático, para 5,4 e deve-se adicionar CaCl 2 na proporção de 1,26 g/kg de malte, como agente tamponante e, então, inicia-se o aquecimento (VENTURINI FILHO, 2010). Entre C as proteases estão ativas, elas atuam sobre as proteínas liberando aminoácidos, importantes para a nutrição da levedura, e peptídeos, importantes para a formação e retenção da espuma na cerveja. Na faixa de C a β-amilase, uma exoenzima, que faz a clivagem das ligações 1-4 exclusivamente próximas às pontas do amido (SANTOS 2010), liberando açúcares fermentescíveis que serão utilizados pela levedura e levarão a produção do álcool (AQUARONE 2001). A α-amilase, uma endoenzima, atua na faixa entre C e clivam qualquer ligação na cadeia linear de carbono, liberando açucares não fermentescíveis chamados de dextrinas (SANTOS 2010), elas são responsáveis pela doçura e sensação de corpo da cerveja. Ainda nesta rampa de temperatura é feito o teste do iodo para confirmar a completa hidrólise do amido, o teste aponta o final da hidrólise quando o iodo não sofre mais alteração para a cor roxo-azulada, característica da reação do amido com o iodo (a temperatura ambiente). Em seguida é feito um aquecimento em torno de 76 C para inativar as enzimas presentes (VENTURINI FILHO, 2010). A filtração consiste em clarificar o mosto, já pronto, separando-o da parte sólida insolúvel. A casca do malte funciona como o filtro e o mosto é recirculado sobre ela até estar clarificado, em seguida, o resíduo sólido é lavado com água quente a fim de se recuperar os açucares retidos na torta do filtro (AQUARONE 2001). Na etapa seguinte o mosto é submetido à fervura, sendo que o lúpulo é sempre adicionado nesta parte e pode-se, também, adicionar aditivos. Nesta etapa há o

12 12 desenvolvimento do aroma, sabor e cor próprios da cerveja (AQUARONE 2001). Na fervura ocorre a completa inativação das enzimas, esterilização do mosto, coagulação protéica, extração do amargor e aroma do lúpulo, formação de substâncias constituintes do aroma e sabor e evaporação de compostos indesejados. Ao final da fermentação há sólidos insolúveis presentes no mosto, chamados de trub, para retirá-lo usa-se uma força centrípeta, esse processo é chamado de Whirpool. Através de rotação forçada do meio, ocorre a sedimentação destes sólidos no fundo do tanque, os separado do mosto líquido. Em seguida o mosto deve ser resfriado à temperatura que será realizada a fermentação (VENTURINI FILHO, 2010). Após o resfriamento do mosto é feita a inoculação do fermento ao mosto e inicia-se a fermentação. Esta é a etapa central do processo cervejeiro, nela a levedura converte os açúcares em álcool e gás carbônico (VENTURINI FILHO, 2010). A fermentação alcoólica pode ser representada de acordo com as seguintes equações químicas: C 6 H O 2 6 CO H ATP + calor C 6 H C 2 H 5 OH + 2 CO ATP + calor Ambas as reações são importantes em um processo cervejeiro, a primeira tem como finalidade promover o crescimento do fermento, no início da fermentação, já a segunda é responsável pela transformação do mosto em cerveja (AQUARONE 2001). O inóculo deve fornecer entre 10 6 e 10 8 células/ml de mosto (VENTURINI FILHO, 2010). Após a fermentação a cerveja, neste ponto chamada de cerveja verde, já apresenta várias características organolépticas da bebida a ser produzida, mas ainda passará pelo processo de maturação, feita a baixas temperaturas. Na maturação a cerveja continua a ser fermentada por um longo tempo, de algumas semanas há alguns meses, mas de forma muito lenta. Esta etapa tem como objetivos a clarificação (por meio da sedimentação de materiais que causam turbidez na bebida), a saturação com gás carbônico, o melhoramento do aroma e sabor (já que reduz a concentração de diacetil, acetaldeído e ácido sulfúrico, bem como a elevação do teor de éster) e evitar a oxidação dos componentes sensórias da cerveja (AQUARONE 2001). Após a maturação a cerveja tem células de levedura e complexos coloidais no seu meio, para que a bebida fique límpida é preciso que seja, então, clarificada antes do engarrafamento. Há quatro técnicas para isto, são elas:

13 13 a) Sedimentação por gravidade, na qual a cerveja é mantida por longo período a 0 C, é um processo simples e que pode ser feito concomitantemente à maturação, no entanto é o mais lento. b) Clarificantes, na qual agentes clarificantes são adicionados para tornar a sedimentação mais rápida. c) Centrifugação, na qual a velocidade de sedimentação é aumentada até 1000 g pela força centrífuga. d) Filtração, na qual ocorre a remoção, em várias etapas, de partícula entre 0,5 µm e 4,0 µm e das leveduras residuais. Este método deixa a bebida, além de límpida, brilhante. (AQUARONE, 2001). A carbonatação é a etapa seguinte, sendo de grande importância já que o gás carbônico (CO 2 ) é um constituinte essencial à cerveja; por ser um gás ácido ele é responsável pela efervescência e pela sensação de acidez ou refrescância. Sua concentração deve ser cuidadosamente controlada para se obter um produto de qualidade (VENTURINI FILHO, 2010). A carbonatação pode ser feita de dois modos, a carbonatação forçada, na qual se injeta CO 2 na cerveja, por meio de equipamentos próprios, ou a carbonatação natural (ou priming), na qual se adiciona sacarose ou mel à cerveja (já dentro do recipiente de envase) e as leveduras presentes na cerveja farão uma segunda fermentação liberando CO 2 (AQUARONE, 2001). Para que seja possível fazer o priming não se pode utilizar a centrifugação nem a filtração como técnica de clarificação, já que é necessária uma pequena concentração de levedura no meio. Após estas etapas a cerveja está pronta para o consumo, no entanto deve ser envasada e resfriada previamente (VENTURINI FILHO, 2010). Com o intuito de manter a estabilidade da cerveja, destruindo microorganismos que deterioram a cerveja e, deste modo, aumentando seu tempo de validade, pode-se efetuar a pasteurização da bebida, já engarrafada. O procedimento é manter, por alguns minutos, a cerveja sob 60 C a 65 C e, em seguida, esfriá-la com água fria (AQUARONE, 2001). Chá Amargo É um extrato de ervas produzido pela empresa Natural Ervas e vendido, no volume de 500,0 ml, nas farmácias de manipulação do sul de Minas Gerais. É um produto natural

14 14 e com propriedades medicinais, tendo em sua composição Carqueja (Baccharis genistelloides), Camomila (Matricaria recutita), Chá Verde (Camelia sinensis), Hortelã pimenta (Mentha piperite L) (CHÁ AMARGO). Tem um aroma herbáceo agradável e um amargor muito acentuado, quando consumido puro. Contaminação Bactérias são os contaminantes mais comuns na cerveja e frequentemente causam alterações na bebida como turbidez, anomalias de sabor e odor. Elas são classificadas como gram-positivas ou gram-negativas, sendo as bactérias láticas gram-positivas e as bactérias acéticas gram-negativas (AQUARONE, 2001). As bactérias láticas são as que, comumente, causam danos à cerveja e, dentre elas, as mais comuns são as do gênero Lactobacillus e Pedicoccus (VENTURINI FILHO, 2010), a primeira apresenta forma de bastonetes e a segunda tem formato esférico (AQUARONE, 2001). A contaminação por bactéria, tanto lática quando acética, leva a um aumento da acidez do meio, já que ambas produzem ácido. Além disto, outras alterações sensoriais são notórias quando a cerveja sofre contaminação (AQUARONE, 2001). A forma de manter a infecção bacteriana sob controle é garantir que os equipamentos, que entram em contato com o mosto cervejeiro, estejam o mais limpo e desinfetado possível. A fim de garantir estas condições é necessário realizar algumas etapas: lavagem com água sobre pressão e detergente para retirar sujeiras grossas, lavagem com algum forte agente bactericida, lavagem a quente e rinçagem com água a fim de arrastar resíduos do detergente ou desinfetante utilizado (AQUARONE, 2001).

15 15 3. Metodologia Durante todo o processo teve-se muita atenção aos cuidados com assepsia e fontes de contaminação. Isto porque o lúpulo, que é utilizado no controle microbiano, foi empregado em quantidades menores, neste trabalho, estando a cerveja mais susceptível a contaminação Produção das cervejas Preparo do reator e garrafas para enfase Dois reatores de vidro, com capacidade de 22 L, foram, inicialmente, graduado de 1 em 1 L e, em seguida, lavado com água e detergente e rinçado com água destilada, a lavagem também foi feita nas garrafas utilizadas no engarrafamento. Na sequência, os recipientes foram lavados com ácido peracético 0,05%, um agente bactericida, e deixado em repouso por 10 minutos. Decorrido este tempo, foram lavados com água destilada, sob agitação e a água foi descartada; este processo foi ser repetido mais duas vez e, então, tampou-os imediatamente com papel alumínio. Para a assepsia das garrafas, utilizadas no envase, fez-se o mesmo procedimento de lavagem, repouso com ácido peracético 0,05%, nova lavagem com água destilada abundantemente e tampamento com papel alumínio. Preparo do mosto Foram produzidos 30 litros de mosto, com o propósito de se fazer 15 litros de cerveja puro malte com Chá Amargo e 15 litros sem este chá, tendo, ambas, teor alcoólico próximo a 5,0 % v/v. Para isto foi considerado um rendimento do malte de 70,0 % e um fator de eficiência global de 90 %. Os mostos foram preparados separadamente, sendo

16 16 necessário 3,75 Kg de malte e 4,728 g de CaCl 2 (agente tamponamento do meio) para a produção de cada mosto. O malte utilizado foi do tio Pilsen, este foi pesado e, em seguida, submetido à ação do moinho de rolos com o propósito de romper a casca e expor o amido à fermentação. A fim de manter a integridade da casca, que foi usada no processo de clarificação, o grão passou apenas uma vez pelo moinho. 15 litros de água foram colocados em um caldeirão, de 25 litros, e deixados para aquecer até 38 C, em seguida o malte foi misturado, lentamente, à água. O ph da mistura foi ajustado para 5,5 e, então, adicionou-se CaCl 2 ao meio. Este foi submetido à curva de aquecimento descrita pela Figura 1. Na elaboração desta curva, pretendeu-se fazer uma cerveja tipo Pilsen bem característica. Figura 1. Rampa de aquecimento do mosto. A 38 C há síntese de enzimas que atuam sobre a viscosidade do mosto, no entanto o malte usado foi de primeira qualidade não havendo necessidade de manter esta temperatura, já que, com esta qualidade de malte, o mosto não é viscoso. Corpo e espuma leve são características das cervejas Pilsens, sendo assim, o tempo de ação das proteases (50 C por 20 minutos) foi reduzido, além disto, a cerveja produzida foi puro malte e este cereal não é rico em proteína, fazendo que não seja necessário manter esta temperatura por muito tempo. A fixação por mais tempo na β-amilase (63 C por 60 minutos) teve como finalidade converter boa parte do amido em açucares fermentáveis. A

17 17 70 C a α amilase atua sobre o mosto, liberando açúcares não fermentescíveis; seu tempo de atuação foi definido pelo teste do iodo (aproximadamente 15 minutos), até que este não sofresse mais alteração na cor. A 78 ºC ocorre a inativação das enzimas, o aquecimento permaneceu nesta temperatura por 15 minutos. O mosto foi recirculado para que fosse clarificado, este processo se repetiu até que meio tivesse uma aparência límpida. Em seguida, o bagaço retido no fundo da caldeira foi lavado com água aquecida para retirar os açúcares residuais. Esta água de lavagem foi misturada ao mosto e, então, ele foi transferido para o recipiente de fervura. Nesta etapa o mosto foi fervido, sendo que, neste momenton cada um dos mostos teve um processo diferente. Inicialmente foi feita a fervura do mosto que produziria a cerveja sem o Chá Amargo. O meio foi deixado sob fervura por uma hora, sendo que após 30 minutos do início foram adicionados 12,0 g de lúpulo Zeus, para que a cerveja apresentasse 25 IBU. Após o término da fermentação foi feita uma agitação vigorosa, feita manualmente, para concentrar a trub no centro da caldeira e sedimentá-la. Em seguida o mosto foi transferido para o reator, previamente higienizado, com cuidado para que a trub sedimentada não fosse transferida junto. Com um sacarímetro, foi feita a medida da concentração de substrato do meio e esta foi ajustada pra 12 Brix, com água destilada. O reator foi, então, tampado com papel alumínio e colocado para resfriar a 10 C. O segundo mosto preparado foi o que produziria a cerveja com Chá Amargo e 50 % do lúpulo colocado no mosto feito anteriormente. Nele, 6,0 g de lúpulo Zeus foram adicionados 40 minutos após o início da fervura; o Chá Amargo foi colocado aos poucos, comparando com o sabor do mosto preparado com 12,0 g de lúpulo, até que o amargor estivesse equiparável. A adição total do chá foi de 500,0 ml e foi feita conforme retratado na Tabela 1, abaixo. Tabela 1. Adição do Chá Amargo. Tempo de fervura (min) Volume do Chá Amargo adicionado (ml) 72 50, , , , , ,0

18 18 Os processos para retirar a trub, procedimentos com o reator, ajuste para 12 Brix e resfriamento foram os mesmos descritos no preparo do mosto sem o chá. O tempo total de fervura deste mosto foi de duas horas. Fermentação e maturação Uma vez tendo sido preparado o mosto foi dado início à fermentação. A levedura utilizada foi a Saccharomyces cerevisiae PPB-01, que foi disponibilizada pela Microcervejaria da EEL USP. Uma levedura de baixa fermentação, e foi utilizada com o intuito de produzir uma cerveja do tipo "lager". O volume de inóculo utilizado foi calculado para que a concentração celular, dentro do reator, fosse de 1x10 6 células/ml. O processo de fermentação foi realizado sob resfriamento a 10 C, uma vez que a fermentação é um processo exotérmico, e foi mantido por 10 dias. A atividade fermentativa pode ser verificada pela produção de gás carbônico e formação de espuma. Ao longo do processo foram retiradas alíquotas dos reatores, de tempos em tempos, e estas foram analisadas quando a concentração celular, consumo de substrato e formação de produto, o rendimento de ambas as cervejas também foram comparados. As amostras retiradas foram submetidas a contagem de células em câmara de Neubawer, com auxílio de um microscópio óptico com lente de ampliação de 400 vezes. Em seguida, foram centrifugadas a 5400 rpm por 10 minutos, separado o sobrenadante do precipitado e colocadas em um agitador mecânico para eliminar o CO 2 presente no meio. Foram, então analisadas quando a concentração de álcool e sacarose em um Beer Analyser. Os gráficos com estes valores em função de tempo foram plotados. Após a fermentação, o mosto fermentado ou cerveja verde, já possuía diversas características da cerveja a ser produzida. No entanto, ainda passou pelo processo de maturação, que consistiu em abaixar a temperatura para 0 C, e manter por 23 dias. Esta etapa garante qualidade à bebida, fornece características organolépticas adicionais, além de promover a sedimentação de sólidos suspensos.

19 19 Engarrafamento e carbonatação natural Neste trabalho foi feita a carbonatação natural da cerveja, em garrafas de 600,0 ml. Inicialmente, foi preparado xarope de sacarose (açúcar comercial) com uma concentração tal que, após sua adição, cada garrafa teria 5 g de sacarose/l de cerveja. Para o preparo foi calculada a massa necessária do açúcar, pesada, adicionado um pequeno volume de água, o necessário apenas para dissolver a sacarose sob fervura. Em seguida, a solução foi deixada em um refrigerador até que se constatasse, pelo toque, que apresentava temperaturas mais amenas. Durante o resfriamento do xarope, foi feita a trasfega da cerveja para as garrafas, previamente higienizadas e em condições assépticas, utilizando uma mangueira de silicone, também em condições de assepsia. Durante a trasfega, tomou-se cuidado para que a parte sólida, sedimentada, não fosse arrastada junto com a bebida. Após o enchimento de cada garrafa, o xarope foi adicionado. As garrafas foram fechadas com tampas de metal, higienizadas com álcool etílico, e deixadas por 20 dias em temperatura ambiente (no máximo 25 C). Este processo garante que haja substrato suficiente para que as leveduras suspensas na cerveja possam fazer uma segunda fermentação, ocorrendo a carbonatação natural da cerveja. Pasteurização Após o tempo de carbonatação, as garrafas que continham as bebidas foram imersas em água a 62 C e deixadas por 20 minutos. Em seguida, a água quente foi retirada e as garrafas foram lavadas com água a temperatura ambiente e deixadas para esfriar, naturalmente, por dois dias. Refrigeração Neste ponto as cervejas já estavam prontas para o consumo, no entanto, elas foram resfriadas em geladeira antes de consumidas, melhorando, assim, suas características sensoriais.

20 Análise de contaminação. Como na cerveja produzida com o Chá Amargo foi utilizada uma concentração reduzida de lúpulo viu-se a necessidade de compará-la, quanto à contaminação, com a cerveja produzida com o dobro da concentração de lúpulo. Isto porque o lúpulo é utilizado na produção da cerveja não apenas com a função de aromatizante e saborizante, mas, também, como um antisséptico que pode ser útil caso a cerveja não tenha sido feita em condições apropriadas de assepsia. Lâmina com óleo de imersão No segundo dia da maturação foi coletada uma amostra de cada cerveja. Foram sanitizadas duas lâminas e colou-se uma gota da amostra com Chá Amargo em uma das placas e uma gota da amostra sem o chá em outra placa. Ambas foram observadas, com óleo de imersão, em um microscópio óptico com uma lente de ampliação de 1000 vezes. Este procedimento teve como objetivo averiguar a existência de bactérias nas cervejas. Coloração de Gram A fim de identificar a existência de bactérias nas cervejas e, em caso positivo, constatar se eram gram-positivas ou gram-negativas, foi seguida a metodologia da coloração de gram. No segundo dia da maturação foi retirada uma amostra de cada cerveja produzida. Em condições de assepsia foi feito um esfregaço da cerveja com Chá Amargo em uma lâmina e sem o chá em outra lâmina. Para fixar as amostras nas lâminas, estas foram passadas, rapidamente e repetidas vezes, sobre a chama do bico de Bulsen, em seguida foi colocado cristal violeta sobre as lâminas, deixado agir por 30 segundos e lavada com água destilada. Na sequência foi colocado lugol sobre elas e, após um minuto, foram lavadas com água destilada, seguida pela lavagem com álcool e com água destilada novamente. Então foi colocado fucsina sobre as lâminas e, após 30 segundos elas foram lavadas com água destilada. Após este processo as bactérias gram-positivas apresentam uma coloração

21 21 púrpura e as gram-negativas uma coloração rosa. Ambas as placas foram observadas ao microscópio, com óleo de imersão, e ampliação de 1000 vezes. Medida de acidez A medida de acidez se deu por uma titulação potenciométrica, segundo a metodologia descrita por ASBC (1958). Sendo utilizados 46,5 ml da cerveja sem o Chá Amargo e 47,5 ml da bebida com o chá.

22 22 4. Resultados e Discussão 4.1.Preparo da cerveja Inoculação Concentração celular do inóculo: 2, células/ml Concentração celular desejada no mosto: células/ml Volume de mosto: 15,0 litros 15*10 3 *10 6 = 1, células = 53, 57 Pelas contas, seria necessário adicionar 53,57 ml do inóculo para que a fermentação ocorresse com a concentração celular desejada. Como se sabe que parte do inóculo fica aderido às paredes do vidro e não ocorre a transferência quantitativa, foi medido um volume de 55,00 ml para ser inoculado em cada reator. Fermentação Com os valores obtidos pelo Beer Analyser, ao longo do acompanhamento da fermentação, foi possível plotar os gráficos da Figura 2 e Figura 3, representados abaixo.

23 Concentração Concentração 23 Fermentação do mosto com Chá Amargo Tempo (h) Células *10^7 (mg/l) Álcool (%v/v) Sacarose (%m/m) Figura 2. Acompanhamento da fermentação do mosto com Chá Amargo. Fermentação do mosto sem Chá Amargo Tempo (h) Células*10^7/mL Álcool (%v/v) Sacarose (%m/m) Figura 3. Acompanhamento da fermentação do mosto sem Chá Amargo.

24 24 Nas Figuras 2 e 3, pode-se observar que o andamento da concentração de células, substrato e produto, em função do tempo, o que vai de encontro com os resultados obtidos por Reek. Em seu experimento ele adicionou hortelã-pimenta ao mosto (uma das plantas presentes no Chá Amargo) e, comparando com a fermentação de uma cerveja sem o hortelã, não verificou diferença no andamento da fermentação das duas bebidas. No entanto, neste trabalho, percebem-se sutis diferenças entre as duas fermentações. Comparando-se a fase lag de ambas as figuras, fica evidente que a fase foi mais acentuada na fermentação do mosto com o chá do que no mosto sem ele. A redução da concentração de leveduras no mosto com o chá foi muito mais intensa, chegando a 78% do valor inicial. Já no mosto sem o chá a redução veio logo após um pico de ascensão (tempo 4 h), no entanto, a queda foi de 48% em relação a este pico, mas, em comparação à concentração inicial o ponto com a queda tem um valor maior. Isto se dá pelo fato de que, no mosto com o chá, a levedura tem que se adaptar ao meio que contém, além das substancias presentes no mosto sem chá, as substâncias adicionadas pelo Chá Amargo. Como se pode observar nas figuras, a adaptação a este meio é mais penosa, se comparado ao meio sem o chá, pois, possivelmente, há substancia(s) no Chá Amargo que interferem na reprodução da levedura e a dificulta. Na análise das curvas de crescimento celular também se pode constatar que a concentração máxima é maior no mosto sem o chá (4, células/ml) do que no mosto com o chá (2, células/ml), isto se da devida a dificuldade que as células encontraram em se adaptar ao mosto com chá. Além disto, a fase estacionária (que é na qual ocorre a maior concentração celular) ocorre antes no mosto com chá (às 76 h) do que no sem chá (81 h) e, pelos pontos em azul (que representam as amostras coletadas), percebe-se que a fase estacionária deste é menor que daquele. Em ambas as curvas a fase de declínio é iniciada as 100 h, mas a fase final, na qual a concentração celular mínima se mantém, começam em tempos diferentes, 25 horas mais tarde para o mosto sem chá. Ou seja, o declínio celular é mais rápido quando se adiciona Chá Amargo ao mosto. O andamento da curva de concentração de sacarose por tempo é praticamente o mesmo para o mosto com e sem o Chá Amargo. São curvas decrescentes que partem de 12,5 %m/m e atingem sua estabilidade em torno das 185 h, ambas com valores em torno de 4,75 %m/m (4,72 %m/m para a cerveja com o chá e 4,85 %m/m para a cerveja sem o chá). Isto garante que, apesar de no mosto com Chá Amargo haver uma menor concentração celular por todo o tempo, o consumo do substrato, pelas leveduras ativas nos meios, foi equivalente para os dois mostos. Uma possibilidade para justificar este fato é de que o

25 25 meio com o Chá Amargo, bem mais fastidioso para as leveduras, foi capaz de selecionar apenas as células mais saudáveis e ativas. Esta seleção não ocorre no meio sem o chá já que ele é muito mais propício ao crescimento celular, sem grandes dificuldades. A curva de produção de álcool também é bastante parecida para ambas, no entanto, a fase de desaceleração ocorre antes no mosto com o chá, iniciando por volta das 100 h, enquanto que no mosto sem o chá ela só será iniciada em torno de 175 h decorridas de fermentação. A produção de álcool também se estabiliza por volta das 185 h, em ambas as cervejas, sendo que a concentração alcoólica para a cerveja com o chá foi de 4,8 %v/v e de 5,1 %v/v para a outra. Além disto, no mosto com Chá Amargo o inicio da produção de álcool é bastante lenta, já que nesta etapa as células usam o oxigênio presente no meio para a reprodução celular, que se apresenta muito baixa neste ponto; este crescimento lento na produção do álcool não pode ser observado na curva sem o chá, possivelmente, por erro analítico. Observando as curvas, apenas da Figura 1, pode-se perceber que, mesmo quando a concentração celular está estabilizada em seu patamar mínimo, ainda acontece uma fermentação lenta, durante a qual ocorre a estabilização das concentrações de sacarose e álcool. Isto se dá, pois, depois de decorrida 160 h do início da fermentação, a concentração de leveduras no meio é muito baixa, mas ainda há substrato no meio, deste modo a etapa final da fermentação se da mais lentamente. Já nas curvas representadas pela Figura 2, percebe-se que a estabilidade da concentração celular ocorre concomitantemente com a estabilidade das concentrações de substrato e produto. Ao que se pode observar a fermentação, em ambos os mostos, aconteceram no mesmo tempo, sendo que a adição do Chá Amargo ao meio influiu apenas na queda da concentração de leveduras no mosto, sem influir, significativamente, no consumo final de substrato ou na produção do álcool. As diferenças entre as duas fermentações não pode ser levadas em consideração nesta escala de produção, já que a concentração celular influiu minimamente no processo fermentativo, produzindo cervejas com teores alcoólicos muito próximos e, no mesmo intervalo de tempo.

26 Análise de contaminação Ao observar a lâmina, com óleo de imersão, ampliada 1000 vezes não foi possível visualizar nada na cerveja sem o Chá Amargo, já na cerveja com o chá foi perceptível a presença de corpos muito cumpridos e bem finos. Esta análise indica que na amostra sem chá não havia contaminação, na com chá os corpos observados estavam grande de mais para serem considerados bactérias, além de estarem em uma concentração muito elevada. No entanto, para se obter uma confirmação de que não havia uma contaminação bacteriana, foi feita a coloração de Gram. Ambas as amostras foram submetidas à coloração e, tanto na cerveja sem o chá quanto na com o chá, não foi possível visualizar nenhuma bactéria. Sendo que, muito provavelmente, os corpos observados na amostra com o Chá Amargo eram fibras, já que o chá adicionado era um extrato de ervas, ou seja, muito rico em fibras. No entanto, como as análises microbianas foram feitas no início da maturação, era possível que, caso havendo contaminação bacteriana, as bactérias tivessem sedimentado. Como as bactérias contaminantes produzem ácidos, se elas estivessem infectado as cervejas a acidez das bebidas seriam alteradas, com esse propósito foi feita a acidimetria das cervejas produzidas. Os valores encontrados, de 0,28 %m/v para a cerveja com Chá Amargo e 0,34 %m/v para a cerveja sem o chá, foram muito próximos, ou seja, não houve uma produção de ácido excessiva em nenhuma das bebidas. Chama atenção o fato de que a cerveja sem o chá teve acidez maior, pois era esperado que, havendo contaminação, a acidez seria maior na cerveja com o Chá Amargo (já que ela contém menos lúpulo, que tem ação antibacteriana) ou então, não havendo contaminação, que os valores de acidez fossem o mesmo. Esses valores levam a crer que, de fato, não houve contaminação, no entanto, é possível que o Chá Amargo tenha componentes alcalinos e que alteraram a acidez da bebida, fazendo com que a bebida sem o chá fosse levemente mais ácida. 4.3.Sensorial A bebida foi provada por algumas pessoas, sendo algumas da área cervejeira, mas sem treinamento para análise sensorial, nem mesmo foi realizada uma análise sensorial criteriosa sobre a cerveja produzida. Pode-se perceber que as bebidas ficaram levemente

27 27 adocicadas, indicando que a fermentação não estava completa, restando, em pequena quantidade, açúcares fermentescíveis na bebida. Este fato se confirma com a obtenção dos dados de rendimento obtidos, sendo de 62,7 % para a cerveja com o Chá Amargo e de 64,2 % para a cerveja tradicional, inferiores ao rendimento do malte utilizado que está em torno de 70,0 %. Além disto, a bebida apresentou gosto agradável, sendo difícil perceber grandes diferenças entre uma e outra cerveja. A que continha o Chá Amargo, no entanto, apresentou um amargor diferente do amargor do lúpulo e com notas herbáceas mais suaves, provavelmente devido às ervas presentes (como hortelã e camomila). A cerveja sem o chá apresentou uma coloração mais clara quando comparada com a cerveja com o chá, ambas não tiveram alteração considerável no odor. O corpo das duas bebidas se mostrou bastante parecidos, um corpo leve típico de cervejas Pilsens.

28 28 5. Conclusão As cervejas produzidas apresentaram um desenvolvimento bem parecido no seu processo fermentativo e, mesmo com a redução do lúpulo em 50 %, não houve contaminação da bebida. Além disto, elas também se equivaleram na comparação sensorial. Estes fatos evidenciam que, na escala analisada, a substituição de 50 % do lúpulo pelo Chá Amargo é possível e viável. No entanto, outras análises ainda podem ser feitas sobre a bebida. Seria proveitoso saber se as propriedades medicinais do Chá Amargo se mantêm na cerveja, se a aparente alta concentração de fibra, na cerveja com o chá, pode trazer benefícios extras ao consumidor, realizar uma análise sensorial ampla para atestar a aceitação da cerveja produzida e também, se seria viável a produção desta bebida em uma escala maior.

29 29 6. Referências AMBEV. Cervejas. Disponível em < Acesso em 15 de mar de AQUARONE, EUGÊNIO, ET AL. Alimentos e Bebidas Produzidos por Fermentação São Paulo. Editora Blucher, 1983, volume 5. AQUARONE, EUGÊNIO, ET AL. Biotecnologia Industrial São Paulo. Editora Bucher, 2001, volume 4. ASBC, AMERICAN Society of Brewing Chemists. Methods of analysis of the American Society of Brewing Chemists. Madison, p. ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DA INDÚSTRIA DA CERVEJA. Contribuição econômica no ritmo do Brasil. Disponível em < Acessado em 19 de mar de CHÁ AMARGO. Roberta Salotto Guedes. Cachoeiro de Itapemirim: Natural Ervas Produtos Naturais LTDA ME, Rótulo de produto. EISENBAHN. Reinheitsgebot A Lei Alemã da Pureza de Disponível em < 7250cb8a262c1705f9191b>. Acesso em 15 de abr de RECEITA FEDERAL. Decreto nº 2.314, de 4 de setembro de Disponível em < m>. Acesso em 10 de abr de REEK, C. B.; Bruginski, E. R. D.; Nascimento, R. D.; Carvalho, F. Desenvolvimento e avaliação dos parâmetros cinéticos na fermentação de cerveja aromatizada. Disponível em: < 3%A1cia/DESENVOLVIMENTO%20E%20AVALIA%C3%87%C3%83O%20DOS%20P AR%C3%82METROS%20CIN%C3%89TICOS%20NA%20FERMENTA%C3%87%C3 %83O%20DE%20CERVEJA%20AROMATIZADA.pdf>. Acesso em 13 mai SANTOS, I. J., SANTOS, Y. L, OLIVEIRA, M. G. A., SILVA, P. H. A.. Expressão da alfa e beta amilase durante a germinação de cevada. Revista Brasileira de Produtos Agroindustriais, Campina Grande, v.12, n.1, p.67-73, Disponível em: < Acesso em: 9 mar VAN DER MAAREL, M.J.E.C.. Enzymes in Food Technology. 2 nd. Editora Ames: Wiley-Blackwell, VENTURINI FILHO, WALDEMAR GASTONI, coordenador. Bebidas alcoólicas: Ciência e tecnológica São Paulo. Editora Bucher, 2010, volume 1.