Clostridium botulinum

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1 FBA 0435 Enfermidades Microbianas de Origem Alimentar Clostridium botulinum Prof. Uelinton Pinto Departamento de Alimentos e Nutrição Experimental uelintonpinto@usp.br Objetivos da aula Entender sobre as principais características do C. botulinum e as principais fontes dos esporos Saber indicar quais alimentos apresentam maior risco de contaminação Entender os principais sintomas do botulismo Diferenciar os tipos de botulismo Entender as principais características da toxina (termo resistência, sítio de ação, tipos) Saber aplicar medidas preventivas e de controle em alimentos 1

2 Enfermidades transmitidas por alimentos Infecção Ingestão dos microorganismos e multiplicação no ser humano Febre Período de incubação horas a dias Intoxicação Toxina pré-formada no alimento Ausência de febre Período de incubação Minutos a horas, algumas vezes dias Toxinfecção Ingestão de grande quantidade de células vivas Esporulação no Trato Intestinal com liberação da toxina Período de incubação h Exotoxinas Mecanismos de ação Danos na membrana (formação de poros) e citotoxicidade Inibição da síntese protéica Ativação de mensageiros de vias secundárias Desbalanço de eletrólitos Inibição da liberação de neurotransmissores Ativação da resposta imune do hospedeiro 2

3 Mais de 150 espécies Clostridium 2 espécies envolvidas em doenças de origem alimentar C. botulinum C. perfringens Várias espécies causam deterioração em alimentos C. butyricum; C. tyrobutyricum; C. sporogenes etc. Outras de importância médica: C. tetani, C. difficile, C. sordelli Intoxicação Botulínica Agente causador: Clostridium botulinum 3

4 Características: Bastonetes Gram-positivos Anaeróbio estrito Clostridium botulinum oval ou cilindrico sub-terminal ou terminal ph de crescimento: 4,5 8,5 Aw mínimo para crescimento: ~0,94 Proteolíticos hidrolisam proteínas e produzem H 2 S Não Proteolíticos Clostridium botulinum Toxinas: Neurotoxinas A, B, C, D, E, F e G Toxinas termosensíveis (10 min a 80 o C, 5 min 100 o C) Toxina botulínica está entre as substâncias mais tóxicas da natureza - 30 ng podem ser suficientes para matar um indivíduo BIOTERRORISMO 4

5 Fontes e reservatórios Solo presente em todo o mundo Tipo A Oeste EUA; China; Brasil, Argentina Tipo B Leste EUA (proteolítica); UK; Europa continental (não proteolítica) Tipo E regiões frias e águas temperadas Tipos C e D regiões mais quentes Efeito de fatores físicos e químicos na multiplicação Eh - Ótimo é baixo mv para máximo desenvolvimento a +250 mv permitem início da multiplicação Embalagem a vácuo inibe multiplicação de deteriorantes, facilitando multiplicação de C. botulinum 5

6 Efeito de fatores físicos e químicos na multiplicação Conservantes Nitrito de sódio efetivo Nitrato de sódio Inefetivo Outros agentes efetivos Sorbatos, parabenos nisina polifosfatos metabissulfito 5 tipos de botulismo humano Botulismo de origem alimentar Clássico Botulismo infantil Botulismo de feridas Botulismo oculto Botulismo inadvertido 6

7 Botulismo de origem alimentar Período de Incubação: 12 a 36 horas Mortalidade: Pode ocorrer entre 3 e 6 dias Antigamente: 50% Atualmente: 5 15% UTI, tratamento de suporte, tratamento específico com soro antibotulínico 7

8 Botulismo de origem alimentar Inicialmente provoca fadiga e fraqueza muscular, tontura, cefaleia, queda de pálpebra, reflexos alternados da pupila a luz e visão dupla, secura na boca, dificuldade na deglutição e de controle da língua. A musculatura da respiração é progressivamente paralisada, podendo provocar morte em 3 a 5 dias (parada respiratória). Sintomas: Distúrbio digestivo, nauseas, vômitos, dores de cabeça, fadiga, visão dupla, fotofobia, dificuldade de falar e engolir, paralisia facial progressiva, asfixia. NÃO HÁ FEBRE E e as funções cognitivas não são afetadas. doi: / ch17f1 Botulismo Pode ser confundido com: Síndrome de Guillain-Barré Miastemia gravis Várias formas de envenenamento CO 2 Organofosforados A eletroneuromiografia permite a exclusão de outras síndromes 8

9 Agente causal Neurotoxina Natureza proteica Antigênica Alta toxicidade Dose infectiva mínima para camundongos 10pg não estabelecida em humanos 1 ng/kg (?) 30ng capaz de causar doença 7 tipos sorológicos da toxina botulínica A a G A, B, E causam doenças em humanos 98,5% dos casos C (C 1, C 2 ), D e F Botulismo animal Raramente associados a botulismo humano G 1 único caso relatado de ligação com doença Sonnabend et al., 1981 Outros gêneros de Clostridium também podem produzir neurotoxina botulínica. C. butyricum: Tipo E (30 casos na Índia em 1998) 9

10 7 tipos de neurotoxinas: A, B, C, D, E, F e G Espécie dividida em 3 grupos baseados em diferenças fisiológicas Importante para Importante Importante para para alimentos alimentos aves e outros envasados refrigerados animais Fonte: Dodds & Austin,

11 Outras espécies também podem produzir a toxina Propriedades C. botulinum IV I II III C. argentinense V C. butyricum VI C. baratii Tipos de neurotoxinas A,B,F B,E,F C, D G E F Temp. crescim. ( o C) Minima Ótima Máxima NA 45 ~40 NA ph mínimo 4,6 5,0 NA NA ~3,6 NA a w inibitória 0,94 0,97 NA NA? NA [NaCl] inibit. % >3 NA 5 D 100 o C esporos (min) D 121 o C esporos (min) ~ 2,5 <0,1 NA NA NA NA 0,21 <0,005 Toxina Botulínica Termolábil inativada a 85 o C/ 5 PM 150kDa L chain 50kDa; H chain 100kDa Vários domínios na cadeia H Cada qual com sua função Modo de Ação: Neurotoxina que bloqueia a liberação de Acetilcolina nos terminais nervosos em junções neuromusculares Dano permanente, mas o organismo pode se recuperar fazendo novas terminações nervosas. Demora de 1 a 12 meses para se recuperar porque precisa fazer novas terminações nervosas. 11

12 Toxina Botulínica Nature Reviews Microbiology Toxina botulínica Codificação da produção Varia com sorotipo BoNTs A, B, E e F e prot não tóxicas associadas Cromossomais BoNTs C 1 e D e prot não tóxicas associadas Bacteriófagos BoNT G Plasmidial 12

13 Mecanismo de patogenicidade Sinalização na junção sináptica 13

14 Toxina Botulismo Sintomas: a toxina liga-se às membranas pré-sinápticas nos neurônios motores na junção neuro-muscular, bloqueando a liberação de acetilcolina, impedindo a contração do músculo. 14

15 Clostridium botulinum Alimentos envolvidos: Produtos enlatados de baixa acidez Conservas caseiras ph>4,5 Vegetais (milho, beterraba, aspargo, cenoura Embutidos Peixes Clostridium botulinum Alimentos envolvidos: Produtos enlatados de baixa acidez Conservas caseiras Conservas comercialmente preparadas Restaurantes Batatas assadas Molho de queijo Oleo de alho 15

16 Clostridium botulinum Alimentos envolvidos: Produtos enlatados de baixa acidez Conservas caseiras Conservas comercialmente preparadas Alimentos processados com ph >4,6» Suco de cenoura (USA 2006)» Nachos to go Australia (2007)» Hot dog chili sauce USA (2007) - Falha no tratamento térmico - Produção parada por meses - Recall de grande quantidade de produto Clostridium botulinum Alimentos envolvidos: Produtos enlatados de baixa acidez Conservas caseiras Conservas comercialmente preparadas Alimentos processados com ph >4,6 com acidificação inadequada (2007)» Baby food - USA» Azeitonas italianas - recall 16

17 Botulismo Suco de cenoura comercial MMWR 55(40), 2006 Georgia Toxina tipo A no soro nas fezes resto do suco Florida Toxina A Botulismo Soro Resto do suco (mantido sem refrigeração) Mesma marca, lote diferente da Georgia Características do produto ph 6,0 Baixo teor de açúcar Refrigeração como única forma de controle! 17

18 Botulismo no Brasil BEPA, 38(4), 2007 Entre 1999 e casos 29 origem alimentar» 15 tipo A» 04 tipos A e B» 01 sem identificação» 9 sem identificação laboratorial 1 ferimento Alimentos: Botulismo em São Paulo Palmito industrializado (3, sendo 2 importados da Bolívia) Alimento não identificado consumido em bar ou restaurante (1) Conserva industrializada de tofu, importada da China (1 surto, 4 afetados, 1 óbito) Tortas de frango com requeijão/ palmito/ ervilha, etc compradas em padarias/ rotisseria (5 surtos, 7 afetados) Conserva caseira de peixe (1) Conserva caseira de jiló comercializada (4 afetados, 2 óbitos) Consulta 06/03/14 18

19 2007 Alimento Botulismo em São Paulo torta comercial de frango com palmito e ervilhas Toxinas A e B Soro do paciente Alimento BEPA, 38(4), 2007 comprado em rotisseria na cidade de SP sem BPF 19

20 Botulismo Infantil Crianças menores do que 1 ano de idade Ingestão de poucas células ou esporos Produção da toxina no organismo humano (infecção seguida de intoxicação) Inicialmente ocorre constipaçao seguida dos sinais neurologicos choro fraco, hipoatividade, paralisias bilaterais descendentes seguidos de paralisia respiratória. Dura de 2 a 6 semanas com instalação progressiva dos sinais e sintomas. Mel pode ter esporos do Clostridium e a toxina nao é produzida no alimento e sim no interior do organismo da criança. Aproximadamente 100 casos são reportados por ano, nos EUA 25% intoxicação alimentar 72% botulismo infantil 3% botulismo de ferida No Brasil entre 1999 e 2011 (MS-SVS) 68 casos confirmados 66 intoxicação alimentar (97%) 1 bolulismo infantil 1 botulismo de ferida 20

21 Botulismo de ferida Quadro sintomatológico semelhante ao botulismo alimentar Pode haver febre Não se identifica uma fonte alimentar Ferimentos ou cicatrizes Usuário de drogas intravenosas Aumento significativo de casos após

22 Botulismo oculto ( hidden ) Botulismo de colonização intestinal Adultos com sintomas semelhantes ao botulismo infantil Pacientes com anormalidades no TGI Uso Cosmético da Toxina Botulínica Botox foi aprovado pela FDA para uso cosmético em abril de 2002 Sadick, N. and A.R. Herman (2003). Comparison of Botulinum Toxins A and B in the Aesthetic Treatment of Facial Rhytides. Dermatologic Surgery 29:

23 Botulismo inavertido ( inadvertent ) Uso terapêutico do botox» Toxina 200x + potente do que o aprovado» Exposição acidental de pessoal de lab (3 casos relatados inalação) 23

24 Botulismo animal Botulismo animal Toxinas botulínicas tipo C e D

25 Animais silvestres Tratamento Remoção da toxina não absorvida do TGI Neutralizar a toxina com soro antibotulínico (mais efetivo nas primeiras 48 h) - CVE/Centro de referência de botulismo Fone: Internação em UTI (Unidade de Terapia Intensiva) e rigoroso monitoramento das funções vitais dos pacientes. Traqueostomia ou ventilação 25

26 Medidas preventivas Destruição do esporo: Tratamento térmico (esterilização) ph 4,6; Irradiação Impedir a germinação dos esporos ou multiplicação das células ph<4,5; aw baixa; Refrigeração/congelamento Conservantes (nitrito de sódio); defumação Melhor forma é a combinação de fatores (teoria das barreiras) Inativação da toxina: fervura 15 min, cloro não dar mel a crianças menores de um ano e pacientes em tratamento prolongado com antibióticos ou drogas imunosupressoras! Métodos de detecção Detecção baseada nos sintomas clínicos diferenciação de outros distúrbios é difícil (sindrome de Guillain-Barre). In vivo - Teste laboratorial (mouse neutralization test) para a presença da toxina no soro, fezes, secreção gástrica do paciente, alimentos consumidos. Injeção de soro e observação de sinais de botulismo. Aplicação de antitoxina para confirmar o tipo. In vitro - Teste ELISA 26

27 Comprovação de surto Gold standard Detecção da toxina Soro / conteúdo gastro-intestinal Recuperação de C. bot nas fezes Podem ficar (+) por até 1 mês Detecção da toxina em alimentos suspeitos Ajuda na identificação da fonte Evidência indireta de caso de botulismo Cuidados no laboratório Uso de luvas, máscara e óculos de proteção Trabalhos realizados sobre bandejas Evitar formação de aerosóis Neutralização da toxina com álcalis na pele - solução saturada (10%) de Ca 2 CO 3 em superfícies - solução 0,1N de NaOH Imunização com toxóide botulínico CDC 27

28 Detecção da toxina botulínica Principais amostras Alimento suspeito (10 50g) Soro sangüíneo (10-15ml) Fezes (10-50g) Conteúdo gástrico (10-50g) Amostras de alimentos, fezes e/ou conteúdo gástrico Homeogeneizar partes iguais (p/v) em tampão fosfato-gelatina (4ºC) Incubar a 4ºC/6-18h. Centrifugar a xg (4ºC) durante 20 Utilizar o sobrenadante para ensaio biológico Camundongos, tipo suíço, com 20-25g de peso. 28

29 Bioensaio Teste mais sensível Nível de detecção 1ug /ml Período 4 dias (24 48h) Atividade para discussão 1. Um produto a base de azeite, vinagre e alho provocou botulismo. Explique o que pode ter acontecido para haver crescimento, considerando que azeite tem baixa aw para permitir crescimento da bactéria e o vinagre diminui o ph para abaixo de 4,6. 2. Um produto refrigerado foi causa de botulismo. Sabendo que refrigeração controla a multiplicação desta bactéria, o que pode ter acontecido? Controlar botulismo apenas por refrigeração seria uma boa estratégia? Por que não? 3. Um produto que não parece fornecer condições de anaerobiose suficientes, ou seja, que foi embalado em um filme plástico com certa permeabilidade, foi implicado em um surto de botulismo. O que pode ter acontecido? 29

30 Alcançamos os objetivos da aula? Entender sobre as principais características do C. botulinum e as principais fontes dos esporos Saber indicar quais alimentos apresentam maior risco de contaminação Entender os principais sintomas do botulismo Diferenciar os diferentes tipos de botulismo Entender as principais características da toxina (termo resistência, sítio de ação, tipos) Saber aplicar medidas preventivas e de controle em alimentos Bibliografia Doyle et al. Food microbiology: fundamentals and frontiers. 2nd ed., Washington, DC, ASM., Franco, B. D. M.; Landgraf, M. Microbiologia de alimentos. São Paulo: Atheneu, p. 30