O B O B. Miyoko Jakabi A L S TI D I AG N Ó INSTITUTO ADOLFO LUTZ MICROBIOLOGIA ALIMENTAR INSTITUTO ADOLFO LUTZ

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1 : O M S I L U T O B D I AG N Ó L A I R O T A R O B A L O C S TI Miyoko Jakabi MICROBIOLOGIA ALIMENTAR

2 BOTULISMO Doença neurológica grave; Súbita e progressiva; Causada pela toxina botulínica; Emergência médica e de saúde pública; Notificação obrigatória.

3 BOTULISMO Microrganismo descrito pela primeira vez em 1879, por Ermengen, na Bélgica - surto com 33 casos; Botulismo - surto de origem caseira na Alemanha relacionada com ingestão de salsicha; botulus : latim=salsicha.

4 características Bacilos GRAM +, retos ou ligeiramente curvos; 0,5-2,0 µm de largura e 1,6-22,0 µm de comprimento; Esporos ovais e subterminais.

5 distribuição No ambiente Largamente distribuído no ambiente; Trato intestinal de animais, pássaros e peixes; Cadáveres de animais silvestres e pássaros contém > quantidade; Tipos A, B e F: terrestres; Tipo E: ambientes aquáticos; Tipo A: oeste dos EUA; Tipo B leste dos EUA e Europa; Tipo G: restrito a Argentina.

6 condições IDEAIS Anaerobiose; ph (4,8 a 8,5); Atividade de água de 0,95 a 0,97; Temperatura ótima de 37ºC. Os tipos A e B (25º a 40ºC); Tipo E, multiplicação > 3ºC.

7 Classificação GRUPO I II III IV C,D G C. baratii C. butyricum (não proteolíticas) Tipo A,B,F B,E,F F E TEMPERATURA ( C) Ótima Mínima ,

8 TOXINA TOXINA botulínica botulínica Tipos de toxinas A, B, E, F: patogênicas para o homem; C, D: patogênicas para os animais; Toxinas termolábeis inativadas a 100ºC por 15 minutos.

9 toxina Dose letal: ng; Bioterrorismo;

10 toxina Toxina - exotoxina ativa (mais que a tetânica), de ação neurotrópica, única que tem a característica de ser letal por ingestão; Proteína de 150 kda cadeia pesada de 100 kda e cadeia leve de 50 kda ligadas por pontes de sulfeto.

11 Síntese da toxina Presente em pequena quantidade na fase logarítmica; Liberada durante a autólise; Bacteriófagos: tipos C e D; Plasmídeos.

12 toxina Neurotoxina; Resistente ao ácido estomacal; Absorvida intacta pelo trato gastrointestinal e entra na corrente sangüínea; Se liga as células nervosas via gangliosídeos; JUNÇÃO NEUROMUSCULAR NORMAL JUNÇÃO NEUROMUSCULAR COM PRESENÇA DA TOXINA BOTULÍNICA

13 Cont. 1. Ligação da cadeia leve aos receptores na membrana; 2. Internalização da toxina ativa; 3. Translocação da toxina p/ o interior da célula (pinocitose); 4. Fase lítica - bloqueio da liberação da acetilcolina.

14 Ação da toxina O neurotransmissor envia impulsos elétricos p/contrair o músculo; Terminações nervosas secretam a acetilcolina responsável pela contração muscular; Pacientes com botulismo: neurotoxina liga-se aos terminais nervosos inibindo a liberação da acetilcolina, o músculo não contrai, ocorrendo a paralisia.

15 Formas de transmissão Alimentar: ingestão de alimentos contaminados com a toxina; Ferimento: multiplicação do microrganismo com produção de toxina em feridas contaminadas; Intestinal: produção endógena da toxina pela germinação de esporos do C. botulinum no intestino (< 1 ano) adultos (cirurgias intestinais, acloridria, doença de Crohn, uso prolongado de antibióticos).

16 botulismo alimentar Período de incubação: horas (2hs - 10 dias); Quanto > concentração de toxina no alimento ingerido, < período de incubação.

17 Com o botulismo Alimentos associados Alimentos enlatados ou envasados em vidros; Industrializados: subprocessamento ou contaminação pós-processo; Conservas caseiras: subprocessamento e acidez.

18 alimentos envolvidos Conserva de peixe caseira (Brasil, 2007); Suco de cenoura (EUA e Canadá, 2006); Tofu (Brasil, 2005); Patê de fígado industrializado (Brasil, 2005); Sardinha em molho de tomate (África do Sul, 2002); Carne em lata (Brasil, 2002); Mortadela (Marrocos, 1999); Torta, Brasil (2006 e 2007).

19 Controle Impedir a germinação de esporos e a proliferação das células vegetativas; Importância da microbiota competitiva (ex. bactérias lácticas); Conservantes químicos nitritos e nitratos; Tratamento térmico elevado; ph.

20 botulismo infantil SINTOMAS Letargia; Constipação; Dificuldade para alimentar-se; Choro fraco; Flacidez muscular e perda do controle dos movimentos da cabeça; Morte súbita.

21 fonte Mel (Midura, 1996); Ambiente (Long, 1985; Nevas et al., 2005b; Fox et al., 2005); Fórmula infantil - Reino Unido (Brett et al., 2005); Ervas (chás) - Argentina (Satorres et al., 1999; Bianco et al., 2008); Cereal infantil - Canadá (Hauschild et al., 1988).

22 QUADRO CLÍNICO sta doença pode ser confundida com outras enfermidades neurológicas: índrome de Guillain-Barré; üller-fischer ; iastenia gravis.

23 COLETA DE AMOSTRAS Deve ser realizada o mais precocemente possível, até sete dias após o início dos sintomas; Antes da administração do soro anti-botulínico; Coleta tardia pode revelar um resultado falso negativo.

24 TRANSPORTE Acondicionar as amostras em recipientes à prova de vazamento em caixas isotérmicas com gelo reciclável obedecendo as normas de biossegurança; Devem ser devidamente endereçados e etiquetados com os seguintes dizeres: EMERGÊNCIA MÉDICA, PERIGO BIOLÓGICO E REFRIGERAR NA CHEGADA. Obs.: Espécimes de ferimentos devem ser transportados em temperatura ambiente

25 DIAGNÓSTICO laboratorial Bioensaio em camundongos; Amostras clínicas e bromatológicas.

26 DIAGNÓSTICO laboratorial Evidência da toxina (soro, vômito, lavado gástrico, fezes e alimentos) para todas as formas de botulismo; Evidência da presença de C. botulinum, produtor de toxina (fezes de bebê e exsudato de ferimento); botulismo infantil/intestinal e ferimento; Cultura de C. botulinum: exsudato de ferimento, vômito, lavado gástrico e fezes; botulismo infantil/intestinal e ferimento.

27 amostras clínicas Soro: 15 a 20 ml de sangue total em frasco sem anticoagulante, para obtenção de 10 ml de soro; Fezes/lavado gástrico: 25 a 50g ou Ml; Ferimento: coletar com swab a parte mais profunda do ferimento, inocular num meio de cultura redutor (tioglicolato com rezasurina).

28 bromatológicas amostras Sobras do alimento efetivamente consumido pelo afetado; Na ausência de sobras, enviar recipientes vazios que contiveram o alimento consumido.

29 Extração Da toxina Solução de gel fosfato (1:1 p/v, homogeneização); Centrífuga refrigerada (4ºC/ x g/20 min.).

30 tratamento Do sobrenadante Separado em 2 porções: Tratada termicamente: água ebulição/10 min.; Tripsinizada: acertar o ph p/ 6,2; 1,8 ml do sobrenadante, acrescente 0,2 ml de sol. Tripsina; incubar a 37ºC/1h.

31 Triagem da Presença de toxina Selecionar no mínimo 8 camundongos (20-25g); 2 animais: inoculados com porção fervida já resfriada; 2 animais: inoculados com porção tripsinizada; 2 animais: inoculados c/ a porção extraída, não tratada termicamente e não tripsinizada; 2 animais são controle do ensaio.

32 INTRAPERITONEAl INOCULAÇÃO

33 SINTOMATOLOGIA Observação constante por 6h; Após este período, os animais são observados a cada 6h, até um período máximo de 96h; Sintomas: respiração difícil, elaborada, acinturamento tipo cintura de vespa, por paralisia do diafragma em contração; Morte.

34 SINTOMATOLOGIA ANIMAL ACINTURADO ANIMAL SEM SINTOMAS FONTE:

35 identificação Da toxina Misturar amostra positiva com anti-soros polivalentes e monovalentes (A,B,E e F); Inocular em camundongos; Os animais inoculados, deverão apresentar os sintomas de botulismo, exceto aqueles que foram inoculados com a antitoxina que foi capaz de inativação.

36 interpretação Os animais que não apresentarem sintomas permitem a identificação do tipo presente; Se os camundongos não forem protegidos por 1 dos monovalentes: 1. Pode ter muita toxina no alimento; 2. Pode ter mais de 2 tipos de toxinas; 3. Mortes podem ser devidas a outras causas. Se ambos os sobrenadantes, aquecido e não aquecido, forem letais, as mortes provavelmente não são devidas a toxina botulínica.

37 Aplicação da Toxina botulínica Tratamento de espasmos musculares de vários tipos: estrabismos, dores musculares de faces e pescoço; Limitação da terapia: injeção deve ser repetida.

38 botox TOXINA BOTULÍNICA TIPO A (BOTOX) TRATAMENTO DE RUGAS COM APLICAÇÃO DO BOTOX

39 DE BOTULISMO Vigilância nacional 1982: Implantação do diagnóstico de botulismo, IAL/SP; 1999: Início da estruturação da vigilância CR Bot/SP; 2001: Notificação obrigatória; 2002: Implantação da vigilância nos Estados; 2003: Produção de antitoxina pelo Instituto Butantan; 2008: Habilitação do IAL como LRN pela ANVISA.

40 BOTULISMO Laboratório de INAUGURAÇÃO DO LABORATÓRIO NB-2

41 Desenho e organização Laboratório de botulismo Portas de acesso duplas com fechamento automático (trava); Pass-trough para passagem de amostras e animais; Área de preparação de amostras; Área de inoculação; Área de manutenção dos animais; Ar de exaustão não circulante, fluxo de ar negativo dentro do laboratório.

42 BOTULISMO Laboratório de Cabine de segurança biológica com exaustão/filtro HEPA; Centrífuga refrigerada ( x g); Ambiente climatizado (22 ± 2 C) e sem ruído; Câmara de CO2 (eutanásia); Autoclave (descarte de amostras bromatológicas e biológicas).

43 De laboratório Descarte de animais Acondicionamento para descontaminação (saco autoclavável); Acondicionamento para descarte (NBR 9191/ ABNT); Congelamento; Preenchimento de planilha (biossegurança); Coleta pela Prefeitura.

44 BOTULISMO Laboratório de PORTAS COM FECHAMENTO AUTOMÁTICO (TRAVAS)

45 BOTULISMO Laboratório de PASS-THROUGH (PASSAGEM DE AMOSTRAS E ANIMAIS

46 BOTULISMO Laboratório de ÁREA DE INOCULAÇÃO / PRATELEIRAS P/ CAMUNDONGOS

47 BOTULISMO Laboratório de CABINE DE SEGURANÇA BIOLÓGICA NÍVEL 2

48 Recomendações desafios/ Capacitação de médicos; Melhoria no diagnóstico clínico; Coleta oportuna de amostras; Administração de antitoxina oportunamente; Tratamento adequado; Desenvolvimento de métodos laboratoriais rápidos.

49 BOTULISMO MIJ A K A B I@IA L.S P.G O V.B R Laboratório de O T I U M! A D A O B R IG?!? S A D Ú V ID