CONSTRUÇÃO DE BIBLIOTECA GÊNICA DE MOLÉCULAS scfv DE ANTICORPOS ANTI-PLACENTAS SINEPTELIOCORIAIS

Transcrição

1 UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO SEMI-ÁRIDO UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE PROGRAMA INTEGRADO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO ANIMAL - PPGPA CONSTRUÇÃO DE BIBLIOTECA GÊNICA DE MOLÉCULAS scfv DE ANTICORPOS ANTI-PLACENTAS SINEPTELIOCORIAIS PAULO HENRIQUE COSTA DE LIMA MOSSORÓ/RN-BRASIL SETEMBRO/2011

2 PAULO HENRIQUE COSTA DE LIMA CONSTRUÇÃO DE BIBLIOTECA GÊNICA DE MOLÉCULAS scfv DE ANTICORPOS ANTI-PLACENTAS SINEPTELIOCORIAIS Dissertação apresentada à Universidade Federal Rural do Semi Árido UFERSA, Campus de Mossoró, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Produção Animal. Oreintador: Profº. Dr. Luiz Augusto Vieira Cordeiro MOSSORÓ/RN-BRASIL SETEMBRO/2011 ii

3 PAULO HENRIQUE COSTA DE LIMA CONSTRUÇÃO DE BIBLIOTECA GÊNICA DE MOLÉCULAS scfv DE ANTICORPOS ANTI-PLACENTAS SINEPTELIOCORIAIS Dissertação apresentada à Universidade Federal Rural do Semi Árido UFERSA, Campus de Mossoró, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Produção Animal. DISSERTAÇÃO APROVADA EM: 29/09/2011 BANCA EXAMINADORA: Profº Dr. Luiz Augusto Vieira Cordeiro Presidente Orientador UFERSA Profª. Drª. Silvia Catarina Salgado Oloris Primeiro Membro Externo UFERSA Profº Dr. Marcos Antônio Nóbrega de Sousa Segundo Membro (Primeiro Tutor) UFERSA iii

4 Dedico este trabalho: Em primeiro lugar a Deus e a seu filho Jesus Cristo, que proporcionaram a mim a saúde e a energia necessárias para seguir em frente. Hoje e sempre. Aos meus pais Pedro Ângelo e Dorinha pelos bons exemplos de vida transmitidos, pelo carinho, amizade, incentivo e apoio a minha caminhada profissional. A Paulinha, minha jóia rara, obrigado por ser minha filha e deixar minha vida mais iluminada. A minha querida esposa Mônica pela força, paciência e companheirismo durante este período de dedicação ao mestrado. Muito obrigado! iv

5 Deus não escolhe os capacitados, capacita os escolhidos. Fazer ou não fazer só depende de nossa vontade e perseverança. Albert Einstein v

6 AGRADECIMENTOS À minha família, que é a razão da minha persistência (pai, mãe, esposa, filhos, irmãos, sobrinhos, cunhados e cunhadas). A TODOS!!!! Ao meu orientador, Profº Dr. Luiz Augusto Vieira Cordeiro (UFERSA), a minha eterna gratidão, por tudo que me ensinou, por ter confiado no meu trabalho, por ter ampliado a minha visão para o mundo da docência e pesquisa e sem dúvida, por ter proporcionado e contribuído com o meu crescimento pessoal e profissional. Muito obrigado! A Profª Dra. Débora Façanha (UFERSA) pela amizade e conhecimentos transmitidos durante este período. E aproveito também para parabenizar por sua gestão que estabeleceu e fortaleceu o Programa de Pós-graduação em Produção Animal nos seus dois primeiros anos de vida, no período em que foi coordenadora do programa na UFERSA. Ao Profº Dr. Sidney Sakamoto (UFERSA), pela cordialidade e pelo ensinamento transmitido sobre a biologia molecular. Ao Profº Dr. Emerson Aguiar (UFRN), como primeiro coordenador geral do programa de Pós-graduação em Produção, por sua dedicação e presteza aos alunos e docentes, onde sempre vislumbrou o bom funcionamento do programa. Ao Profº Dr. Henrique Medeiros (UFRN), pelo apoio e supervisão durante o meu estágio docência como bolsista REUNI. Aos meus grandes amigos Miguel Angello e Kelly Mery, pelo companheirismo, pela amizade e pelos excelentes momentos juntos. Muito obrigado por serem meus amigos, hoje e sempre. As minhas grandes amigas Luana e Vanessa pelo apoio, amizade e carinho. Ah! Também muito obrigado por serem minhas amigas, hoje e sempre. Aos meus amigos de laboratório Eliezer e Renan. Valeu pela amizade e pelas palavras de incentivo. As amigas da biotecnologia vegetal, Emanuele, Leidiane e Carol, pelos conhecimentos transmitidos na biologia molecular. Aos professores da banca de qualificação, Dr. Marcos (UFERSA) e Dra. Priscila (UERN), pelas sugestões construtivas para melhoria do meu projeto de pesquisa. Aos funcionários Servulo (laboratório de Citologia UFERSA), André e Erinaldo (laboratório de análises clínicas do Hospital Veterinário - UFERSA) pela ajuda e presteza durante todo o meu período experimental. vi

7 Ao Profº Dr. Benito (UFERSA) pela contribuição nas minhas análises de proteína. Ao Programa de Pós-graduação em Produção Animal, a UFERSA e UFRN. A Fundação de Apoio a Pesquisa do Estado do Rio Grande do Norte (FAPERN), ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelo financiamento deste projeto de pesquisa. A Pró-reitória de Pós-gradução da UFRN pela concessão da bolsa REUNI e aos seus colaboradores pelo profissionalismo. A todos os estagiários, funcionários e professores do departamento de Ciência Animal da UFERSA, que direta ou indiretamente contribuíram com este projeto. Aos colegas do Programa de Pós-Graduação em Produção Animal, pela solidariedade. vii

8 CONSTRUÇÃO DE BIBLIOTECA GÊNICA DE MOLÉCULAS scfv DE ANTICORPOS ANTI-PLACENTAS SINEPTELIOCORIAIS De Paulo Henrique Costa de Lima. CONSTRUÇÃO DE BIBLIOTECA GÊNICA DE MOLÉCULAS scfv DE ANTICORPOS ANTI-PLACENTAS SINEPTELIOCORIAIS f. Dissertação (Mestrado em Produção Animal: sub área: Caracterização, Conservação e Melhoramento Genético de Recursos Locais) - Universidade Federal Rural do Semi-Árido (UFERSA), Mossoró-RN, RESUMO: Há muito se tem buscado na produção de anticorpos monoclonais, marcadores moleculares, para a detecção in situ, de células trofoblásticas em placenta de animais ruminantes. Os antígenos utilizados como marcadores até o presente não são específicos desta população celular, em sua maioria tratando-se de moléculas estruturais ou resultantes da fisiologia trofoblástica temporariamente expressas. Galinhas de linhagem de postura foram imunizadas com um macerado de placentomas caprino e ovino e um segundo grupo com macerado de placentomas bovino. As imunizações se repetiram a cada 15 dias para os dois grupos experimentais. Os ovos foram coletados ao longo das 04 imunizações, a IgY isolada, e sua concentração mensurada. Após 60 dias do início das imunizações as galinhas foram sacrificadas. Os baços desses animais foram isolados e fragmentados para extração de RNA total pelo método de Trizol. Realizada a síntese do cdna, amplificou-se, através de PCR, os fragmentos variáveis de imunoglobulinas G aviária de cadeia leve (V L ) e de cadeia pesada (V H ). Fragmentos de V L e V H foram utilizados na constituição do produto final recombinante pelo processo de overlap-pcr. Os resultados preconizam a viabilidade da construção de biblioteca gênica de scfv anti-placenta caprina e ovina e sua utilização na confecção de kits de diagnósticos para diversas situações fisiológicas de células trofoblásticas pertencentes a placentas destas espécies. PALAVRAS CHAVE: imunoglobulina G aviária, células trofoblásticas, placentoma, sinepteliocorial, marcadores moleculares viii

9 ANTI-SYNEPTHELICHORIAL PLACENTA scfv LIBRARY CONSTRUCTION Of Paulo Henrique Costa de Lima. Gene Library Construction of scfv Antibody Molecules Anti-placenta Synepitheliochorial f. Master in Animal Production: sub area: Characterization, Conservation and Breeding Local Resources - Universidade Federal Rural do Semi-Árido (UFERSA), Mossoró-RN, ABSTRACT: There has long been sought in the production of monoclonal antibodies, molecular markers, for in situ detection, of trophoblast cells in placenta of ruminants. The antigens used as markers to date are not specific to this cell population, mostly in the case of moleculares resulting from structural or physiological trophoblastic temporarily expressed. Hens were immunized with a macerate of goat and sheep placentomes and a second group with bovine placentomes macerate. Immunizations were repeated every 15 days for both groups over a period of 04 immunizations. Eggs were collected, IgY isolated, and its concentration measured. After 60 days of the onset of immunizations chickens were cullet. The spleens of these animals were isolated and fragmented to total RNA extraction by Trizol method. Performed the synthesis of cdna, was amplified by PCR the fragments of immunoglobulin G avian variable light chain (V L ) and heavy chain (V H ). Fragments of V L and V H were used to constitute the final product by recombinant Overlap-PCR. The results presented the feasibility of building a library of scfv anti goats and sheep placenta, opening the possibility of manufacture diagnostic kits for various physiological situations of placental trophoblast cells belonging to these species. KEY WORDS: avian immunoglobulin G, trophoblast cells, placentomes, syneptheliochorial, molecular markers ix

10 SUMÁRIO CAPÍTULO I 13 REFERENCIAL TEÓRICO INTRODUÇÃO ANTICORPOS PROVENIENTES DE GALINHA (Gallus Gallus Domesticus) O FRAGMENTO scfv CÉLULAS TROFOBLÁSTICA PLACENTA SINEPTELIOCORIAL MARCADOR MOLECULAR PARA DETERMINAÇÃO DAS CÉLULAS TROFOBLÁSTICAS PERSPECTIVAS REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 27 CAPÍTULO II 40 CONSTRUÇÃO DE BIBLIOTECA GÊNICA DE MOLÉCULAS scfv DE ANTICORPOS ANTI-PLACENTAS SINEPTELIOCORIAIS INTRODUÇÃO MATERIAIS E MÉTODOS IMUNIZAÇÕES DOS ANIMAIS E COLETAS DAS AMOSTRAS EXTRAÇÃO E MENSURAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE IMUNOGLOBULINA Y (IgY) DA GEMA DE OVO DE GALINHA PURIFICAÇÃO DE IMUNOGLOBULINA Y (IgY) POR ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA COM DODECIL SULFATO DE SÓDIO (SDS-PAGE) EXTRAÇÃO E ISOLAMENTO DO RNA TOTAL CONSTRUÇÃO DO cdna E DAS MOLÉCULAS CADEIA LEVE (V L ) E CADEIA PESADA (V H ) CONSTRUÇÃO DE FRAGMENTOS VARIÁVEIS DE CADEIA ÚNICA (scfv) ATRAVÉS DE OVERLAP-PCR ANÁLISE ESTÁTISTICA RESULTADOS MENSURAÇÃO DA IMUNIZAÇÃO ANÁLISE ESTÁTISTICA PRODUTO DA AMPLIFICAÇÃO DO cdna DE CADEIA LEVE (V L ) E CADEIA PESADA (V H ) DE scfv DE IMUNOGLOBULINA G DE GALINHA PRODUTO DA SOBREPOSIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS DE FRAGMENTOS scfv POR OVERLAP-PCR DISCUSSÃO CONCLUSÃO AGRADECIMENTOS REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 61 x

11 ANEXO 67 CONSTRUÇÃO DE BIBLIOTECA GÊNICA DE MOLÉCULAS scfv DE ANTICORPOS ANTI-PLACENTAS SINEPTELIOCORIAIS 67 ANTI-SYNEPTHELICHORIAL PLACENTA scfv LIBRARY (Artigo submetido à publicação na Revista Animal Reproduction Science - An International Journal) 67 CAPÍTULO I - LISTA DE FIGURAS FIGURA 1 - Característica estrutural dos anticorpos policlonais de aves (IgY) e mamíferos (IgG). Adaptado de Chalghoumi et al (2009) 16 FIGURA 2 - Mecanismos de rearranjo gênico, conversão gênica e hiper-mutação que ocorrem na cadeia leve e pesada das imunoglobulinas de galinha, ao nível de DNA 19 FIGURA 3 - Placentoma proveniente de gestação com exposição de artérias e veias do cordão umbilical. Artérias umbilicais injetadas com látex (SCHLAFER et al., 2000) 23 CAPÍTULO I I - LISTA DE FIGURAS FIGURA 01 Esquematização do processo de amplificação para cadeia leve (V L ) e cadeia pesada (V H ) de fragmentos scfv de imunoglobulina G de galinha 47 FIGURA 02 Esquematização do processo de overlap-pcr para cadeia leve (V L ) e cadeia pesada (V H ) de fragmentos scfv de imunoglobulina G de galinha 50 FIGURA 03 Resultado da purificação de imunoglobulina Y (IgY) anti-placenta caprina e ovina em diferentes momentos de imunização. Purificação realizada por eletroforese em gel de poliacrilamida a 6% (SDS-PAGE). MPM, Marcador de peso molecular (kda). 53 FIGURA 04 Resultado da purificação de imunoglobulina Y (IgY) anti-placenta bovina em diferentes momentos de imunização. Purificação realizada por eletroforese em gel de poliacrilamida a 6% (SDS-PAGE). MPM, Marcador de peso molecular (kda) 54 FIGURA 05 - Resultado da amplificação do fragmento de cdna de cadeia leve (V L ) e cadeia pesada (V H ) de scfv de imunoglobulina G de galinha (IgY). Resultado obtido através da eletroforese em gel de agarose a 1% 56 xi

12 FIGURA 06 Resultado do overlap-pcr dos fragmentos de cdna de cadeia leve (V L ) e cadeia pesada (V H ) de scfv de imunoglobulina G de galinha (IgY) anti-placenta caprina e ovina. Resultado obtido através da eletroforese em gel de agarose a 1% 57 CAPÍTULO I I - LISTA DE GRÁFICOS GRÁFICO 01- Concentração da imunoglobulina Y (IgY) em relação ao número de imunização realizada com a mistura dos macerados de placentomas de placenta caprina e ovina mg/ml 52 GRÁFICO 02 - Concentração da imunoglobulina Y (IgY) em relação ao número de imunização realizada com o macerado de placentomas de placenta bovina mg/ml 53 CAPÍTULO I I - LISTA DE TABELAS TABELA 01 - Análise de variância (ANOVA) dos grupos de imunização GSP e BOP 55 TABELA 02 Médias e medidas dos grupos de imunização GSP e BOP 55 TABELA 03 Médias e medidas das concentrações de IgY no grupo imunizado com GSP 55 TABELA 04 Médias e medidas das concentrações de IgY no grupo imunizado com BOP 56 xii