AVALIAÇÃO IN VITRO DA ATIVIDADE DO TRICRESOL FORMALINA POR CONTATO E POR VOLATILIZAÇÃO FRENTE AO ENTEROCOCCUS FAECALIS E AO BACILLUS SUBTILIS

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1 Revista de Endodontia Pesquisa e Ensino On Line - Ano 2, Número 4, Julho/Dezembro, AVALIAÇÃO IN VITRO DA ATIVIDADE DO TRICRESOL FORMALINA POR CONTATO E POR VOLATILIZAÇÃO FRENTE AO ENTEROCOCCUS FAECALIS E AO BACILLUS SUBTILIS ANTIMICROBIAL ACTIVITY EVALUATION OF TRICRESOL FORMALIN OPPOSITE OF ENTEROCOCCUS FAECALIS AND BACILLUS SUBTILIS. Karine Polesso da Silva a Luis Eduardo Duarte Irala b Alexandre Azevedo Salles c Orlando Limongi d Renata Grazziotin Soares e Resumo O presente estudo teve o propósito de investigar a ação antimicrobiana de uma medicação intracanal: o tricresol formalina, através do método de difusão em ágar por contato e à distância. Foram utilizadas duas cepas bacterianas, Enterococcus Faecalis e Bacillus Subtilis. A avaliação foi realizada com 06 placas de Petry com 60 ml de BHIA, onde foram inoculadas com 300 µl das suspensões microbianas. Os dentes pré-selecionados foram transfixados em 4 tampas de placas de petry para testar a capacidade volátil dos fármacos. Posteriormente, foi feita a colocação da medicação intracanal nos dentes selecionados e a colocação das mesmas nos discos de papel filtro em duas técnicas: com 30 µl e com o excesso removido com gaze estéril de cada fármaco, sendo também utilizado o disco com ausência da medicação como caso controle. Estes foram colocados sobre a superfície de BHIA e mantidos por 1 hora em temperatura ambiente e colocados em estufa à 37ºC por 24 horas. Foram medidos os diâmetros dos halos dos dois materiais estudados. Dos resultados, pode-se constatar que não houve nenhuma ação por volatilização quando o fármaco esteve no canal radicular. Os halos apresentados nos discos quando em contato com as culturas microbianas foram de difusibilidade e não de inibição, já que houve crescimento microbiano na contraprova. PALAVRAS-CHAVE: endodontia, medicação intracanal, microbiota endodôntica. a Especialista em endodontia pela ULBRA, Canoas - RS. b Professor do curso de graduação em odontologia e pós-graduação em endodontia da ULBRA, Canoas - RS. c Professor do curso de graduação em odontologia e pós-graduação em endodontia da ULBRA, Canoas - RS. d Professor do curso de graduação em odontologia e pós-graduação em endodontia da ULBRA, Canoas - RS. e Mestranda em Endodontia pela ULBRA, Canoas - RS.

2 Revista de Endodontia Pesquisa e Ensino On Line - Ano 2, Número 4, Julho/Dezembro, Abstract The present study had the purpose to investigate the antimicrobial activity on a intracanal medication: the tricresol formaline by agar diffusion test when in contact and the action at the distance. Two species of bacteria were used: Enterococcus Faecalis and Bacillus Subtilis. The evaluation was done getting 6 Petry plates with 60 ml of BHIA that were inoculated with 300 µl of the microbial suspension. The priviosly selected teeth were transfixed on 2 Petry lid plates to test the volatile capacity of the experimental materials. Subsequently, the intracanal drugs were placed in the selected teeth and put in the filter paper discs using two techniques: with 10 µl and with the excess removed with sterile gauze of each drug, also using a disc without the experimental material like control case. All of them were put on the BHIA surface and keeped about one hour on room temperature staying in a stove on 37ºC for 24 hours. The diameters of the experimental material halos were mensurated. Of the results, it was established that there were no action by volatile capacity when the drugs were in root canal. The halos of the discs when in contact with the microbial cultures were of diffusely and not of inhibition, already there was a microbial growth in the againstprove. KEYWORDS: Endodontics, Endodontic Microbial, Intracanal Medication

3 Revista de Endodontia Pesquisa e Ensino On Line - Ano 2, Número 4, Julho/Dezembro, INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Na atualidade, a grande ênfase do tratamento endodôntico está direcionada ao bom preparo biomecânico dos canais e a sua tridimensional obturação. Embora esses aspectos do tratamento sejam fundamentais, não devem ser encarados como únicos na obtenção do reparo pós-tratamento endodôntico. Por isso, outras fases, notadamente, a da desinfecção e saneamento perdurada pela medicação intracanal, não devem ser relegadas a plano secundário, uma vez que, no seu conjunto, levam a um maior sucesso no tratamento endodôntico (MELO; ALBUQUERQUE; CASTRO, 2004). Os dados encontrados na literatura deixam evidente que a porcentagem de sucesso obtida após tratamento dos canais radiculares com necrose pulpar, principalmente portador de reações periapicais crônicas, é menor quando comparada ao tratamento efetuado em dentes com polpa vital (SELTZER et al., 1963; SOARES et al., 1990). Tanomaru Filho et al. (2002) atribuem às bactérias um papel decisivo no desenvolvimento das lesões periapicais crônicas, o que significa que a sua eliminação deve ser o grande objetivo do tratamento endodôntico de dentes infectados. Bactérias Gram-positivas anaeróbias estritas ou facultativas como o Enterococcus Faecalis, parecem ter maior influência sobre o prognóstico da terapia endodôntica, apesar de bacilos Gram-negativos anaeróbios estritos exerçam um papel relevante na ocorrência de sintomatologia clínica (HAAPASALO, 1993). Na grande maioria das vezes, uma infecção persistente do canal radicular é resultante do preparo químico-mecânico e de uma medicação intracanal inadequados. Embora enterococcus sejam raramente encontrados em caso de infecção primária, eles são os microorganismos mais comumente isolados de casos em que a terapia endodôntica fracassou. Isto é especialmente verdadeiro para a espécie E. faecalis (MOLLER, 1966). Avaliando casos de fracasso da terapia endodôntica, Moller (1966) relatou encontrar 51% de cepas correspondentes a bactérias anaeróbias estritas e 29% dos casos de E. faecalis. Segundo Sundqvist et al. (1998) observou 42% de bactérias anaeróbias estritas e 38% de E. faecalis. O emprego de uma medicação no interior do sistema de canais radiculares está indicado em situações rotineiras ou esporádicas na clínica endodôntica. Embora esta etapa não possa substituir qualquer outra relacionada à terapia endodôntica, sua utilização assume um papel auxiliar bastante importante em determinadas condições clínicas e patológicas (SIQUEIRA JÚNIOR; LOPES; UZEDA, 1996). Nos dentes despolpados, o conteúdo microbiano e tóxico da cavidade pulpar determina a opção por substâncias antisépticas. A medicação intracanal será então um auxiliar valioso na desinfecção do sistema de canais radiculares, principalmente em locais inacessíveis à instrumentação, como as ramificações do canal principal e os túbulos dentinários. Portanto o emprego da medicação intracanal no intervalo das sessões do tratamento endodôntico potencializa a desinfecção do sistema de canais radiculares, tornando seu uso fundamental (ESTRELA; BAMMANN, 2001). De outra forma, a escolha de uma medicação para uso no interior do canal radicular deve considerar que os anti-sépticos capazes de controlar a infecção podem, também, causar irritação ou destruição dos tecidos vivos. Segundo Soares; Goldberg (2001), o emprego da medicação intracanal em endodontia justifica-se em diferentes situações, como, manutenção do saneamento conquistado durante o preparo do canal radicular em dentes com polpa vital e controle microbiano em dentes com necrose pulpar. As substâncias utilizadas como curativo de demora são: associação

4 Revista de Endodontia Pesquisa e Ensino On Line - Ano 2, Número 4, Julho/Dezembro, corticóide-antibiótico, hidróxido de cálcio, paramonoclorofenol canforado e tricresol formalina. Medicamentos que atuam através de volatilização possuem efeitos antimicrobianos que podem atuar como uma barreira química contra a microinfiltração, eliminando microorganismos e impedindo sua entrada no canal. Tricresol formalina e Paramonoclorofenol canforado agem desta maneira (LOPES & SIQUEIRA JR, 2004). Dos produtos utilizados como medicação intracanal, com poder germicida comprovado, destaca-se o tricresol formalina, o qual, segundo a literatura, tem uma atuação à distância, através de vapores ou por contato, cuja porção formaldeídica é a responsável pela principal ação antimicrobiana, que se dá pela ação alquilante sobre proteínas e ácidos nucléicos dos microorganismos, sendo também responsável pela ação altamente irritante aos tecidos vivos. É um produto composto por formaldeído (90%) e cresol (19 a 43%) (Lopes, Siqueira Junior, 1999), sendo tradicionalmente usado como anti-séptico, desde que foi popularizado por Buckley (1904). Melo; Albuquerque; Castro (2004) comparou a atividade antimicrobiana do tricresol formalina na sua fórmula comercial e diluído na proporção de 1:2, 1:3, 1:5, 1:10 sobre as bactérias: Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis e a mistura das mesmas, a avaliação foi realizada através de teste da ação à distância utilizando tubos de ensaio. Os resultados demonstraram que nas diluições de 1:2 e 1:3 se manteve uma efetiva ação bactericida tal qual a sua fórmula comercial. No entanto, o potencial antimicrobiano através de vapores, tanto do tricresol formalina ou paramonoclorofenol ainda carece de maiores resultados, principalmente frente à mimetização de uma real circunstância clínica que é sua evaporação via forame apical. Frente ao exposto, acreditamos ser oportuna a realização de novos trabalhos sobre o assunto. Assim sendo, este estudo tem como objetivo investigar a atividade antimicrobiana do Tricresol Formalina e do Paramonoclorofenol Canforado, tanto por contato quanto por volatilização. METODOLOGIA Local da realização do trabalho Dependências do laboratório de Microbiologia e Mutagênese da Universidade Luterana do Brasil (ULBRA), em Canoas/RS. Aquisição das cepas bacterianas Foram utilizadas culturas puras de Bacillus Subtillis-ATCC 6633 (bacilo gram-positivo) e Enterococcus Faecalis ATCC (coco gram-positivo) obtidas do Instituto Nacional Oswaldo Cruz-Fiocruz. A semeadura das culturas microbianas foi realizada através de repiques, conforme a exigência de cada cepa em meio Brain Heart Infusion Agar (BHIA; DIFCO; Maryland, Estados Unidos), que após o período de incubação adequado, foram mantidos em geladeira à temperatura de 4ºC. Preparo dos espécimes Foram selecionados quatro dentes pré-molares inferiores, portadores de canal único, extraídos por razões ortodônticas e deixados em hipoclorito de sódio a 1%. Nestes realizou-se aberturas coronárias com ponta diamantada esférica nº 1014 (Fava) com posterior uso de brocas nº 2 e 4 esféricas carbide de haste média (Dentsply-Maillefer) para remoção da dentina, trepanação e desgaste do teto coronário. Foram utilizadas, respectivamente, brocas Largo I e II (Moyco Union Broach)

5 Revista de Endodontia Pesquisa e Ensino On Line - Ano 2, Número 4, Julho/Dezembro, para o preparo do terço cervical, melhorando o acesso das limas. Com o dente envolto em uma gaze, foi realizado em seguida o preparo químico-mecânico, onde optamos pela técnica seriada com farta irrigação alternada de Hipoclorito de Sódio 1% e EDTA e cujo CRT foi estabelecido quando a lima tipo K nº #10 foi vislumbrada justaposta ao forame apical, recuando-se 1mm. O instrumento memória selecionado foi o de nº #40. Executouse após o término do preparo um desbridamento foraminal com lima #25, ultrapassando-o em 2 mm com objetivo de padronização.

6 Revista de Endodontia Pesquisa e Ensino On Line - Ano 2, Número 4, Julho/Dezembro, SUBSTÂNCIAS PARA AVALIAÇÃO DA Posteriormente, os dentes foram fixados com resina acrílica auto-polimerizável (Clássico) no centro de quatro tampas de placas de vidro tipo Petry (140x15cm), as quais foram previamente perfuradas com broca esférica diamantada de alta rotação 1016(Diamond), com diâmetro de 6 mm.sendo este conjunto (tampa e dente) autoclavado. Os dentes foram fixados de maneira que seus ápices ficassem a mais ou menos 3 mm do meio de cultura com a coroa dental para fora do compartimento interno da placa de Petry. As colônias microbianas foram obtidas do meio de cultura sólida BHIA e suspensas em 5ml de BHI estéril até se obter a turvação referente ao tubo nº1 da Escala Mc Farland (concentração aproximada de 3x10 células por ml) (ANTUNES, 1995), o qual significa crescimento bacteriano. Utilizaram-se um total de 06 placas de Petry 140x15cm (CRAL, Cotia, SP, Brasil) estéreis, nas quais foram vertidos 60ml do meio BHIA esterilizado, promovendo uma espessura de 4 mm de ágar em cada placa. Procedeu-se então a inoculação das placas com respectivos microrganismos, utilizando uma pipeta (Rainin, Oakland, CA, Estados Unidos) com ponteiras estéreis e descartáveis. Foi dispensado em cada placa um inóculo de 300 µl (1/10) de suspensão microbiana pura: Enterococus Faecalis/Bacillus Subtilis, que foi imediatamente espalhado sobre a superfície do meio com auxílio de uma alça de vidro estéril. Cada experimento foi repetido 3 vezes, utilizando-se uma nova placa para cada experimentação, sendo que o conjunto, tampa e dente implantado, foi esterilizado como dito anteriormente. CAPACIDADE ANTIMICROBIANA Foi utilizado: -Tricresol Formalina (IODONTEC, Porto Alegre, RS, Brasil). Em cada experimento foi utilizado o tricresol formalina como medicação intracanal, o qual foi colocado na câmara pulpar um penso de algodão de aproximadamente 3 mm de diâmetro umedecido na substância e removido o excesso com gaze estéril segundo a técnica de Buckley. Posteriormente, a câmara foi selada com Cavit (3M) deixando-se aproximadamente 4 mm de material, a partir do seu cavo superficial. Também foram utilizados 3 discos de filtro de papel estéreis com 6 mm de diâmetro (CEFAR, São Paulo, SP, Brasil), sendo um para controle e os outros dois com medicação, um com 10 µl de Tricresol e outro com o excesso de medicação removido em gaze estéril. O experimento foi realizado da seguinte maneira: nas três experimentações o medicamento foi colocado logo após a semeadura dos microorganismos. As placas permaneceram por uma hora à temperatura ambiente, sendo transferidas para estufa bacteriológica (Biomatic) permanecendo incubados a 37ºC por 24h. Após esse período foi realizada a leitura dos halos de inibição das placas para verificar a atividade antimicrobiana do material experimental (Tricresol Formalina), mensurando-se o tamanho do halo de inibição de crescimento microbiano ao redor de cada disco, com um paquímetro (SOMET, República Checa). Tal medida corresponde à distância entre a borda junto ao disco e a borda externa do halo, a qual se apresentou com aspecto liso e transparente evidenciando ausência de crescimento bacteriano.

7 Revista de Endodontia Pesquisa e Ensino On Line - Ano 2, Número 4, Julho/Dezembro, CONFIRMAÇÃO DO HALO DE INIBIÇÃO/DIFUSÃO (CONTRAPROVA) Onde houve halo, foi passada uma alça (sem marca) previamente esterilizada na região e inoculou-se em BHI líquido, verificando sua turvação para a confirmação do halo de inibição/difusão. Da mesma forma, confirmou-se a existência de microorganismo passando a alça abaixo dos ápices dos dentes com medicação intracanal e ao redor dos discos mesmo quando não existia halo.

8 Revista de Endodontia Pesquisa e Ensino On Line - Ano 2, Número 4, Julho/Dezembro, RESULTADOS Os resultados obtidos nesta pesquisa estão expostos nos quadros abaixo. O QUADRO I apresenta as medidas dos halos de inibição de crescimento microbiano para bactéria Enterococcus Faecalis, evidenciando a medida obtida para cada uma das placas, bem como a ausência/presença de turvação nos halos encontrados para cada medicação utilizada. Observase que o tricresol apresentou halos de inibição em todas as placas e que não houve formação de halo no grupo controle e no ápice. DISCUSSÃO Para a avaliação in vitro da capacidade antimicrobiana de substâncias odontológicas existem três técnicas que podem ser utilizadas: o método de diluição, o método de exposição direta e o teste de difusão em ágar. Cada uma das técnicas apresenta vantagens e desvantagens que devem ser consideradas no momento da escolha da metodologia a ser empregada em uma pesquisa (ESTRELA; PIMENTA; ESTRELA, 2001). O método de difusão em ágar constitui-se em um método simples, prático, eficiente e o mais utilizado para avaliação da ação antimicrobiana, sendo por este motivo a metodologia adotada nesta pesquisa para testar a capacidade antimicrobiana por contato e volatilização das medicações intracanais. Este teste permite a observação de zonas de inibição de crescimento microbiano adjacentes aos discos que contêm o agente a ser testado. O diâmetro desta zona de inibição expressa a difusão do agente antimicrobiano, entretanto, o tamanho da zona não necessariamente determina o poder antimicrobiano (DUARTE, 2001). Relativamente à análise do teste, este permite a observação de zonas demarcadas em halos que podem ser de inibição ou ser apenas de difusão de tal fármaco. Por este motivo, foram averiguados tais halos com uma cultura de contraprova. Portanto, o método de exposição direta fornece informações sobre a efetividade da substância e seu contato direto com o microorganismo, sendo tais informações qualitativas. Dos resultados obtidos, deve ser considerado ainda que a atividade in vitro não se pode correlacionar diretamente com a atividade in vivo, pois em um estudo in vitro não se pode simular perfeitamente uma situação in vivo, mas nele é possível controlar fatores que em um estudo in vivo não seriam possíveis (ESTRELA; PIMENTA; ESTRELA, 2001). O meio de cultura utilizado para avaliação de atividade antimicrobiana foi o Brain Heart Infusion Agar (BHIA), um meio rico em nutrientes e apropriado para o cultivo das cepas dos dois microrganismos vigentes nesta pesquisa. A escolha dos microrganismos testados buscou abranger espécies que geralmente são encontradas em lesões periapicais de longa duração, da mesma forma que estas são usualmente utilizadas em estudos para avaliação de atividade antimicrobiana. A escolha do Bacillus Subtilis deveu-se ao fato de que este microorganismo apresenta resistência aos processos de esterilização e desinfecção e aos antimicrobianos em geral, servindo como parâmetro para avaliação da eficiência do agente antimicrobiano testado. Em relação ao Enterococcus faecalis, este foi selecionado por ser um dos microorganismos

9 Revista de Endodontia Pesquisa e Ensino On Line - Ano 2, Número 4, Julho/Dezembro, mais resistentes da cavidade oral (SIQUEIRA; LOPES; UZEDA, 1996). Durante o experimento foi observada a presença de halo no contato direto da medicação com os microorganismos utilizados, o que não foi constatado onde a medicação atuou por vapor. Devemos considerar também que o vapor do fármaco testado pode ter ficado dentro da cavidade pulpar, tendo então, sua atuação restrita ao âmago do sistema de canais radiculares. Por outro lado, tem-se que levar em consideração que o espaço entre o ágar e a tampa da placa de Petry é demasiado grande e houve grande evaporação do fármaco, não havendo efeito sobre os microorganismos. Os inóculos das placas apresentaram turvação quando transferidos ao meio líquido indicado, portanto, houve crescimento bacteriano nas zonas de inibição, o que permite concluir que os halos formados pelo tricresol foram de difusão e não de inibição como o esperado. Em relação às medidas dos halos de inibição de crescimento microbiano, nenhum dos trabalhos estudados relacionou sua extensão com maior poder antimicrobiano. O tamanho deste halo está diretamente relacionado com a capacidade de difusão do material. Portanto, o halo expressa a difusibilidade do material. Neste estudo o tricresol apresentou capacidade de difusão sem, no entanto, apresentar ação antimicrobiana. Estrela et al. (2003) salientam que o tamanho do halo de inibição depende da solubilidade e difusibilidade do material testado, e, portanto, pode não expressar seu potencial efetivamente. Inicialmente o fato de o tricresol apresentar difusão é um dado positivo. Porém, este é um estudo in vitro que possui limitações em relação a real fidelidade clínica. Mais estudos são necessários para avaliar a capacidade de difusão dos materiais e quantificar até que ponto esta difusão é benéfica in vivo. Este estudo buscou obter uma simulação in vitro que buscasse a maior similaridade às situações clinicas, tanto pela medicação utilizada, quanto pela estratégia do mecanismo de uso da mesma em dentes pré-selecionados. Os resultados, obtidos através da metodologia empregada, não puderam constatar a ação antimicrobiana esperada, e sim a ação de difusão do fármaco. Em síntese, o presente trabalho espera contribuir para que os profissionais conduzam seus tratamentos avaliando criteriosamente os materiais utilizados como curativo de demora no tratamento endodôntico. Evidentemente, a comprovação dos resultados deverá ser alvo de futuras pesquisas. CONSIDERAÇÕES FINAIS Baseados na metodologia aplicada e nos resultados obtidos no presente estudo, podemos concluir que: O fármaco tricresol formalina não apresentou ação antimicrobiana por volatilização via forame apical. Relativamente à ação antimicrobiana por contato, os halos do Tricresol foram de difusão. REFERÊNCIAS BARBOSA, C.A.M. et al. Evaluation of the antibacterial activities of calcium hydroxide, chlorhexidine, and camphorated paramonochlorophenol as intracanal medicament. A clinical and laboratory study. J Endod, v.23, n.5, p , BATISTA, A.; BERGER, C.R. Tratamento da Polpa Morta. In: BERGER, C.R. et al. Endodontia Clínica. São Paulo: Pancast, p , DUARTE, M. A. H. Ação antimicrobiana de cimentos endodônticos. JBE, v.2, n.4, p.54-57, 2001.

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