Purificação de Proteínas
Propriedades usadas na purificação de proteínas através de cromatografia líquida Na separação a amostra contendo a mistura de proteínas é preparada em solução aquosa, a solução é colocada em contato com um suporte sólido poroso (fase estacionária) e eluída através deste suporte com uma solução aquosa (fase móvel). A separação ocorre devido a diferenças entre as propriedades das diferentes proteínas. Propriedades exploradas: Tamanho (massa molecular) Carga líquida Polaridade (hidrofobicidade) Afinidade química (especificidade)
Sistema para FPLC amostra Coluna cromatográfica Detector UV 280nm Coletor de frações
Recuperação da atividade enzimática Etapa de purificação 100 U 80 U 2ml de lisado contendo 50 U/mL 10ml de material contendo 8 U/mL Recuperação = 80% = 80 U/100 U Recuperação: indica qual a porcentagem de atividade enzimática recuperada após o procedimento de purificação
Recuperação em relação ao início 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 etapas Recuperação de 90% em cada etapa
100 U de alfa-glicosidase 1 mg de proteína 100U/mg 100 U de alfa-glicosidase 2 mg de proteína 50U/mg 100 U de alfa-glicosidase 10 mg de proteína 10U/mg
Enriquecimento 100 U/mg Etapa de purificação 200 U/mg Enriquecimento = 2 = 200/100 Enriquecimento: indica o aumento da atividade específica após o procedimento de purificação.
Filtração em Gel ou Cromatografia de Exclusão Molecular Tamanho: 20 kd 100 kd Fluxo de solução tamponante através da coluna abs280 volume
5 µm
fluxo
fluxo volume
Seletividade As dimensões dos poros da matriz determinam a faixa de peso molecular das proteínas que podem ser separadas na cromatografia.
Tipos de resina Sephacryl (dextrana + bis-acrilamida) 50 µm Sepharose (dextrana + epiclorohidrina) 10 120 µm
Cálculo de peso molecular relativo utilizando cromatografia de filtração em gel Definições v e = volume de eluição da amostra (proteína de interesse) v o = volume morto ou void. Volume no qual são eluídas proteínas totalmente excluídas dos poros das resinas. Corresponde ao volume externo aos grãos da resina v t = volume total da coluna. Pode ser calculado geometricamente a partir das dimensões da coluna.
v e = volume de eluição da amostra (proteína de interesse)
v o = volume morto ou void. Volume no qual são eluídas proteínas totalmente excluídas dos poros das resinas. Corresponde ao volume externo aos grãos da resina Pode ser medido usando macromoléculas muito grandes, em geral blue dextrana (milhões de Daltons)
v t = volume total da coluna. Pode ser calculado a partir das dimensões da coluna.
Definições razão de eluição K av = (v e v o )/(v t -v o ) Log PM K av
Cromatografia de Troca Iônica Carga líquida: Aminoácidos possuem cadeias laterais ionizáveis; Proteínas possuem terminais C e N ionizáveis. pi (ponto isoelétrico) = ph no qual o número total de cargas positivas é igual ao número total de cargas negativas. Logo, a proteína não tem carga líquida. Se o ph > pi, a carga líquida da proteína é negativa Se o ph < pi, a carga líquida da proteína é positiva
+ Fluxo de solução tamponante com ph definido
+ Fluxo de solução tamponante com ph definido volume
Na + Cl - Na + Cl - Na + Cl - Cl - Cl - + Na + Cl - Na + Cl - Na + Cl- Cl - Na + Fluxo com solução tamponante contendo NaCl NaCl volume
+ pi = 7 pi = 9 ph = 6 +++ F α q1.q2
NaCl +++ volume + +++
Tipos de resina
Cromatografia de Hidrofobicidade Polaridade: Adição de sal
Série de Hofmeister Cátions: NH 4 + > K + > Na + > Li + > Mg +2 > Ca +2 > guanidina Efeito precipitante Ânions: SO 4-2 > HPO 4-2 >acetato>citrato>tartarato> Cl - > NO 3- > SCN -
Adição de sal Precipitação por sulfato de amônio é usada para concentrar e/ou purificar parcialmente amostras contendo proteínas
Cromatografia de Hidrofobicidade Polaridade: (NH 4 ) 2 SO 4
(NH 4 ) 2 SO 4 Fase estacionária apolar Abs 280 volume
(NH 4 ) 2 SO 4 Abs 280 volume
Abs 280 volume
Tipos de resina
Cromatografia líquida de fase reversa Polaridade: (Material poroso apolar é a fase estacionária) 1 o. 2 o. Eluição: aumento da % de solvente orgânico na solução eluente Proteína ricas em aminoácidos mais apolares: mais retidas Proteínas ricas em aminoácidos mais polares: menos retidas