PURIFICAÇÃO DE DNA PLASMÍDICO POR CROMATOGRAFIA DE INTERACÇÃO HIDROFÓBICA

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1 PURIFICAÇÃO DE DNA PLASMÍDICO POR CROMATOGRAFIA DE INTERACÇÃO HIDROFÓBICA Ana Rita Gafaniz*, Nuno Santos** e Rúben Pereira*** * Nº55763 Mestrado Integrado em Engenharia Biomédica Instituto Superior Técnico Departamento de Física rita_gafaniz@hotmail.com ** Nº55746 Mestrado Integrado em Engenharia Biomédica Instituto Superior Técnico Departamento de Física dodgeps@hotmail.com *** Nº55754 Mestrado Integrado em Engenharia Biomédica Instituto Superior Técnico Departamento de Física rubens_dmap@hotmail.com Palavras-chave: Cromatografia de Interacção Hidrofóbica, Purificação de DNA Plasmídico Resumo Neste trabalho laboratorial pretendeu-se separar DNA plasmídico (pdna), pvax1-lacz, provenientes de um lisado alcalino de Escherichia coli por cromatografia de interacção hidrofóbica. Para tal, introduziu-se o lisado numa coluna cromatográfica por gravidade, após equilibrá-la com o eluente (solução 1,5 M de (NH 4 ) 2 SO 4 ) e ter medido o caudal; e recolheram-se várias fracções à saída da coluna, num intervalo de dois em dois minutos. A partir da análise da absorvância a 260nm concluiu-se que se obteve uma separação eficaz do DNA plasmídico de cadeia dupla dos contaminantes do hospedeiro (proteínas, RNA, DNA genómico, lipopolissacáridos). 1

2 1. INTRODUÇÃO TEÓRICA 1.1. Produção de DNA plasmídico Este trabalho laboratorial corresponde ao passo de purificação, num processo de produção em larga escala de pdna, esquematizado na Figura 1. O primeiro passo, após a fermentação e a recolha das células, é a lise alcalina, no qual a membrana celular é destruída e ocorre desnaturação dos ácidos nucleícos e das proteínas. De seguida, procede-se a uma neutralização do ph da mistura, havendo assim uma renaturação do pdna, e também a uma precipitação, uma vez que a preparação de DNA final deve estar livre não só do DNA genómico e RNA, como também de detritos celulares. O plasmídeo obtido pode posteriormente ser usado em aplicações terapêuticas, tais como terapia génica e vacinas de DNA. Fermentação Recolha de células Lise KAc pp lise alcalina HIC plasmídeo Etanol (NH 4 ) 2 SO 4 pp IsopOH pp concentração cromatografia clarificação e concentração Figura 1. Processo de produção em larga escala de DNA plasmídico (KAc acetato de potássio, IsopOH isopropanol, (NH 4 ) 2 SO 4 sulfato de amónio, HIC cromatografia de interacção hidrofóbica) Cromatografia de Interacção Hidrofóbica A cromatografia de interacção hidrofóbica (HIC) é uma técnica para separar proteínas, péptidos e outras biomoléculas, com base no seu grau de hidrofobocidade (vide Figura 2), que pode ser usada no processo descrito anteriormente, em particular, no passo de purificação. A fase móvel consiste num agente de salting-out (por exemplo o sulfato de amónio) que, a concentrações elevadas, retém os compostos a separar, devido ao aumento das interacções hidrofóbicas entre o soluto e a fase estacionária. Na presença de elevadas concentrações de sal, os grupos fenil da matriz impedem a passagem dos constituintes hidrofóbicos da mistura. Através de alterações da concentração de sal é possível controlar a força de ligação dos compostos retidos. Estes são eluídos pela diminuição da concentração do sal, daí utilizar-se água quando se quer libertar os compostos pretendidos. 2

3 Figura 2. Controlo do equilíbrio hidrofóbico pela variação de concentração do sal. 2. RESULTADOS Neste trabalho foram recolhidas as fracções à saída da coluna, em intervalos de dois minutos. A partir destas fracções determinaram-se as absorvâncias correspondentes, a um comprimento de onda de 260nm. No entanto, foram feitos dois ensaios. Sabe-se que as primeiras fracções foram obtidas sabendo que o eluente presente era o sulfato de amónio (1,5M), enquanto que as restantes, foram obtidas sendo o eluente a água. Os dois ensaios diferem-se apenas nos tempos considerados para cada eluente. Na Tabela 1 estão indicados os tempos considerados para ambos os ensaios, assim como os comprimentos dos leitos das duas colunas e o caudal, como medida da velocidade de escoamento do eluente. Tabela 1. Dados relevantes do trabalho. Ensaio 1 Ensaio 2 Comprimento do leito (cm) 8,3 7,8 Caudal (ml/min) 1,0 0,9 Tempo para cada eluente (min) Sulfato de Amónio 4,7 15 Água 40,3 30 Medidas: cm centímetro, ml milímetro, min minuto. Após a obtenção das fracções, determinaram-se as absorvâncias das mesmas. Na estão apresentados os gráficos das absorvâncias obtidas, referentes às fracções dos dois ensaios (dados disponíveis em anexo Tabela 2). 3

4 Figura 3. Gráfico que relaciona a absorvância com o tempo de escoamento decorrido, em minutos. A linha a tracejado ( ) representa os dados obtidos do ensaio 1, enquanto que os dados do ensaio 2 são apresentados pela linha contínua ( ). 3. DISCUSSÃO Neste trabalho, a cromatografia de interacção hidrofóbica permitiu separar os vários constituintes do lisado de E. coli, DNA genómico, DNA plasmídico, RNA e outros. Como já referido, este processo divide-se em duas partes distintas, caracterizadas pelo tipo de eluente utilizado e consequente eluido produzido. Durante a primeira separação, correspondente à eluição com sulfato de amónio, as substâncias mais hidrofóbicas (DNA de cadeia simples, RNA, proteínas) ficam retidas na coluna da matriz, uma vez que nos ligandos prevalecem ligações hidrofóbicas, que neste caso aumentam a sua especificidade devido à presença dos sais do eluente. As partículas com menos componentes hidrofóbicas à superfície, como as cadeias dupla de DNA plasmídico, que têm as bases azotadas voltadas para o interior da cadeia, passam pelos ligandos sem interagirem com estes. Na Figura 3 esta primeira fase é descrita pelas bandas apresentadas nos primeiros minutos. A banda do ensaio 2 aparece primeiro do que a do ensaio 1, sugerindo que houve uma passagem mais rápida do eluido, pela coluna. Isto justifica-se pelo menor comprimento da coluna no ensaio 2 (7,8, face aos 8,3 do ensaio 1), do que no ensaio 1. Outra razão está associada ao tempo que o sulfato de amónio passa na coluna, que é menor no ensaio 1. Este dado sugere que a água, no ensaio 1, possa ter atrasado o escoamento do eluido, o que não aconteceu no ensaio 2, em que o uso do sulfato de amónio se prolongou durante 15min. Relativamente à separação final, esta foi realizada com água, o que corresponde a uma diminuição das ligações hidrofóbicas dos ligandos da coluna com as partículas do meio, devido à diminuição da concentração de sais no eluente. Este passo na cromatografia gerou a separação dos ligandos com as componentes hidrofóbicas das substâncias. Estas substâncias apareceram assim nas fracções, instantes depois da troca 4

5 de eluentes, como é possível visualizar com as bandas de maior amplitude, dos gráficos da Figura 3. Ao contrário da primeira fase, em que a banda do ensaio 2 aparecia primeiro no tempo, do que a do ensaio 1, há, agora, um aumento de fracções com partículas de superfície hidrofóbica, no ensaio 1, em instantes de tempo anteriores ao ensaio 2. Este comportamento está uma vez mais, relacionado com o tempo disponível para cada eluente. O ensaio 1, que fez a troca de eluentes mais cedo que o ensaio 2, apresenta a banda de absorção mais cedo do que a outra. Outro aspecto a ter em conta nesta análise de resultados é o tamanho relativo das bandas de absorvância das duas fases. Uma vez mais, pela visualização dos gráficos da Figura 3, conclui-se que a curva de absorvâncias nos instantes iniciais é inferior, em amplitude, à da dos instantes finais. Esta conclusão é justificada pela maior abundância de substâncias com componentes superficiais hidrofóbicas, nomeadamente, RNA, DNA genómico desnaturado (cadeia simples), na segunda parte da separação; enquanto que, como o DNA plasmídico se apresenta em menor concentração, aparece uma banda de amplitude inferior inicialmente. 4. CONCLUSÃO Através da análise dos resultados obtidos e considerando os objectivos propostos, conclui-se que estes foram atingidos, uma vez que se conseguiram duas fases distintas do processo cromatográfico, uma delas contendo o DNA plasmídico pretendido. A HCI revelou ser uma técnica útil e eficaz num processo de purificação de material cromossómico, como DNA e RNA, tornando-se também indispensável em muitos casos. Uma das desvantagens presente neste método é o elevado tempo dispendido pelo utilizador, uma vez que foi necessário um completo acompanhamento do mesmo na recolha das fracções. No entanto, este compromisso pode ser facilmente resolvido, se se implementar um sistema robotizado, completamente autónomo que recolha as fracções e determine as suas absorvâncias. 5. ANEXOS Tabela 2. Valores de absorvância obtidos, a 260nm. Tempo (min) Ensaio 1 Ensaio , ,006 0, ,008 0, ,045 0, ,411 0, ,025 0, ,009 0, ,003 0, ,13 0, ,705 0, ,13 0, ,28 0, ,275 0, ,94 0, ,115 1, ,065 1, ,034 1, ,013 0,409 5

6 37 0,007 0, ,003 0, ,001 0, ,001 0,006 Os instantes temporais medidos correspondem ao instante médio do intervalo de recolha da fracção de eluente extraído. Medidas: min minuto. 6

7 BIBLIOGRAFIA [1] Diogo, M. M., Queiroz, J. A., Monteiro, G. A., Martins, S. A., Ferreira, G. N., & Prazeres, D. M. (2000). Purification of a cystic fibrosis plasmid vector for gene therapy using hydrophobic interaction chromatography. Biotechnology Bioengineering, 68, pp [2] Freitag, R. (18 de Dezembro de 2007). Plasmid Production - Large Scale Production of Plasmid DNA. Obtido em 20 de Dezembro de 2007, de Chair for Process Biotechnology: ion.htm [3] Prazeres, D. M. (2007). Purificação de DNA Plasmídico por Cromatografia de Interacção Hidrofóbica. [4] Rao, S., Borrdunov, A., & Pohll, C. (2006). High Resolution Silica Hydrophobic Interaction Chromatography (HIC) Column for Protein/Peptide Separations with Improved Hydrolytic Stability. Sunnvale, CA, USA: Dionex Corporation. 7