1.3- Resultados e discussão

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1 13- Resultados e discussão 131- Determinação da fracção proteica, mais representativa, na semente seca da Vicia Extraíram-se, fraccionadamente, as diferentes classes de proteínas constituintes da semente seca de Vicia cv Caia A extracção fez-se como descrito em 12211, e de acordo com o método de Osborne (Osborne, 1924), optimizado por Melo et al (1994), com vista a um maior rendimento na extracção das globulinas totais (mediante a utilização de 10 mm EDTA e 10 mm EGTA na solução de extracção de globulinas), a fracção maioritária das proteínas de reserva das leguminosas Um dos objectivos foi determinar a fracção mais representativa, e consequentemente, proceder à sua caracterização Determinou-se a proteína total da semente seca, em termos do N total, segundo o método de Kjeldahl Este é o método de referência para a determinação da proteína total em amostras cuja compartimentação exija condições químicas severas de modo a se obter uma conversão total de todo o N orgânico em N mineral O teor de proteína total é geralmente estimado multiplicando o azoto total pelo factor 6,25 (para as proteínas em geral, a razão de massas proteína/seu conteúdo em azoto, é de aproximadamente 100/16, ou 6,25) Este procedimento, sobrevaloriza, por vezes, o teor proteico, uma vez que os tecidos vivos, e as sementes de leguminosas em particular, contêm quantidades consideráveis de compostos azotados não proteicos, nomeadamente de aminoácidos não proteicos Devido a uma percentagem considerável do azoto total destas sementes ser proveniente dos alcalóides (Hatzold et al, 1983) e aminoácidos não proteicos (alguns podem constituir 10 a 15% do peso destas sementes), Gross e Baer (1977) propuseram o factor de 5,7 para as proteínas de leguminosas e Pompei e Lucisano (1976), o factor de 5,4 para as sementes de Lupinus De modo a ultrapassar estas incertezas, preferimos expressar os resultados obtidos pelo método de Kjeldahl em termos de miligramas de azoto por grama de peso fresco de semente O teor proteico total das fracções de albuminas, globulinas, glutelinas e prolaminas foi determinado pelo método de Lowry (1951), modificado por Bensadoun e Weinstein (1976) Os resultados destes ensaios estão apresentados na Tabela II-11 e na FigII-13 Alguns pormenores merecem um breve comentário: (i) Após o cálculo do azoto total da semente estimado para 43,85 mg por g peso fresco, a proteína total de semente 97

2 (1,1 mg por g de peso fresco) compreende 41,6% do azoto total da semente (Tabela II-11) (ii) A proteína total constitui aproximadamente 11,4% do peso fresco da semente (iii) As fracções contendo as albuminas totais (FigII-13, coluna 2), globulinas totais (FigII-13, coluna 3) e prolaminas totais (FigII-13, coluna 5) são constituídas por classes distintas de polipéptidos As albuminas são constituídas por polipéptidos muito diferentes, cobrindo uma vasta gama de massas moleculares ( a 116 ), enquanto as globulinas são essencialmente representadas por seis polipéptidos maioritários (, 21, 23,, 55 e ) As prolaminas exibem massas moleculares baixas, no intervalo dos aos Contudo, a composição polipeptídica da fracção glutelínica (FigII-11, coluna 4) é quase idêntica à das globulinas, sugerindo que uma pequena percentagem destas proteínas possa ter sido coextraída com a fracção de glutelinas (iv) As globulinas constituem o componente proteico mais representativo das sementes de Vicia, 50,8% (valor que é quase de certeza subestimado), se bem que as albuminas são também abundantes, com 43,6% das proteínas totais da semente A fracção albumínica surpreende pelo seu valor elevado, apesar da fracção das globulinas continuar a ser a preponderante, como é vulgar nas leguminosas A relação encontrada entre estas duas fracções já foi registada para algumas linhas genéticas da Vicia faba (Pasqualini et al, 1991) As fracções menores são representadas pelas prolaminas (0,4% da proteína de semente) e glutelinas (5,2% da proteína da semente; valor que é, por certo, grosseiramente sobre-estimado), que representa a menor fracção proteica da semente da V Da análise dos resultados (Tabela II-11, Gráfico II-11 e FigII-13) concluiu-se que sendo a fracção de globulinas, a fracção proteica mais representativa da semente seca da Vicia, deveria esta fracção ser estudada mais profundamente 98

3 Tabela II-11 Teor proteico das sementes de V proteína total das sementes mg de proteína / g de peso fresco 11 N proteico / N total (%) 416 albuminas mg de proteína /g de peso fresco 497 N albuminas / N total (%) 181 globulinas mg de proteína /g de peso fresco 580 N globulinas / N total (%) 212 prolaminas mg de proteína /g de peso fresco 05 N prolaminas / N total (%) 02 glutelinas mg de proteína /g de peso fresco 59 N glutelinas / N total (%) A proteína total das sementes secas, foi determinada pelo Método de Kjeldahl 2- O teor proteico total das fracções de albuminas, globulinas, glutelinas e prolaminas, foi determinado pelo método de Lowry (1951), modificado por Bensadoun e Weinstein (1976) Representatividade das diferentes fracções das proteínas de reserva da semente de Vicia 40,0% 0,5% 5,5% 54,0% albuminas globulinas glutelinas prolaminas Gráfico II-11- Gráfico circular representativo da percentagem individualizada de cada uma das fracções proteicas da semente de Vicia 99

4 FigII-13- SDS-PAGE-R representativo do padrão polipeptídico das diferentes fracções proteicas extraídas dos cotilédones de sementes de Vicia Aplicaram-se 50 μg de proteína de cada uma das fracções Coluna 1- Marcadores de massa molecular (), coluna 2- fracção de albuminas totais, coluna 3- fracção de globulinas totais, coluna 4- fracção de glutelinas, coluna 5- fracção de prolaminas 132- Fraccionamento das globulinas totais de Vicia por cromatografia de troca aniónica Sendo as globulinas totais a fracção proteica maioritária da semente de Vicia, procedeu-se ao seu fraccionamento com o propósito de isolar e purificar as principais proteínas constituintes das globulinas totais, ie, a α-conglutina, a β- conglutina e a γ-conglutina, tal como está descrito na literatura para as leguminosas em geral (Shewry, 1995) Para o efeito fez-se o fraccionamento das globulinas por cromatografia de troca aniónica (coluna de gel Q-Sepharose, da Pharmacia) em FPLC (da Pharmacia LKB), tal como descrito em Métodos Fez-se a análise do cromatograma resultante do primeiro fraccionamento das globulinas totais (FigII-14A) bem como do gel de SDS-PAGE das fracções colhidas (FigII-14B) 100

5 1,2 A 1 B γ- δ- β- α- Abs (280 nm) α 0,8 0,5 γ 0,4 β δ 0, Volume de Eluição (ml) NaCl (M) 24 FigII-14- Cromatograma e gel representativos do fraccionamento das globulinas totais de sementes de Vicia (A) Fraccionamento das globulinas totais por cromatografia de troca aniónica em FPLC, em coluna de Q-Sepharose, tendo como tampão de trabalho Tris-HCl 50 mm, ph 7,5 (tampão A); o gradiente obtido fez-se adicionando, ao tampão A, NaCl 1M (tampão B- Tris-HCl 50 mm, ph 7,5, 1 M NaCl) Injectaram-se 6 ml de globulinas (44 mg de proteína) na coluna, o fluxo da solução tampão foi de 1,5 ml / min A eluição das proteínas foi continuamente registada por leitura da absorvência a 280 nm (B) gel SDS-PAGE-R, 12,5% (m/v) em acrilamida, que ilustra a variedade de polipéptidos eluídos durante o fraccionamento Aplicaram-se 40 μg de proteína por poço Os eluídos aplicados representam os picos registados: coluna 1- globulinas totais antes da aplicação, colunas 2 e 3- proteínas não adsorvidas à coluna Q-Sepharose, coluna 4- eluído 34, coluna 5- eluído 35, coluna 6- eluído 46, coluna 7- eluído 48, coluna 8,- eluído 52, coluna 9- eluído 55, coluna 10- eluído 58, coluna 11- eluído 61, coluna 12- eluído, coluna 13- eluído 70, coluna - eluído 92 O fraccionamento das globulinas totais das sementes de Vicia, por cromatografia troca aniónica a ph 7,5, em sistema FPLC, resultou na obtenção de quatro picos principais de proteína (FigII-14A) Seguindo uma terminologia similar à usada para designar as globulinas principais de L albus (α-, β- and γ-conglutinas) e de Lathyrus sativus (α-, β- e γ-latirinas), Rosa et al, (00), propusemos os termos α- vicinina (pico α - FigII-14A), β-vicinina (pico β FigII-14A), γ-vicinina (pico γ - FigII- 14 A) e δ-vicinina (pico δ FigII-14A) Pela análise cromatográfica, verifica-se que a primeira fracção a ser eluída, que se denominou δ-vicinina, não está muito fortemente adsorvida, pelo que é eluída entre os 8 e os 16% de NaCl A β- e α-vicininas são eluídas da coluna entre os 17 a 27% de NaCl e entre 27 a 42% de NaCl, respectivamente A fracção de γ-vicinina não foi adsorvida à coluna A análise electroforética, por SDS-PAGE-R, de todas as fracções eluídas por coluna de troca aniónica (Figura 4B), revela 2 classes principais de proteínas, α- e β-vicinina e, ainda uma fracção que revelou ser diferente das anteriores, caracterizada por uma banda 101

6 de 47, a fracção δ-vicinina As β- e α-vicininas são, contudo, eluídas da coluna com sobreposição, resultando numa contaminação cruzada destas fracções, enquanto a fracção γ-vicinina contém algumas bandas polipeptídicas, sugerindo a presença de mais do que uma proteína Prosseguiu-se, com o objectivo de purificar e isolar as diferentes fracções proteicas individuais constituintes das globulinas totais 133- Purificação e isolamento das principais proteínas de reserva das sementes de Vicia Purificação das α- vicinina e β- vicinina Os eluídos da FigII-14A enriquecidas em α-vicinina (eluídos11, e ) ou β- vicinina (eluídos 6, 7 e 8) foram reunidas e sujeitas a mais dois fraccionamentos consecutivos, por cromatografia troca aniónica em FPLC, executadas nas mesmas condições descritas para a FigII-14A, exceptuando o equilíbrio da coluna, que foi feito com tampão a ph superior, o que significa que: na primeira corrida, o tampão de equilíbrio estava a ph 7,5 (FigII-14A), a ph 8,0 durante a segunda corrida (cromatograma não apresentado), e a ph 8,5 durante a terceira corrida (FigII-15A) O resultado desta metodologia, ilustrado pela FigII-15AB, indica que as α- e (-vicininas foram purificadas, livres de contaminações cruzadas No que respeita à δ-vicinina, esta fracção parece revelar algumas particularidades (FigsII-14A e 4B): não exibe uma carga eléctrica tão forte, quanto as fracções mais representativas (α- e β-vicinina) e, o seu perfil proteico (eluídos 4 e 5), revela uma banda bem evidente, e que parece ser característica, de massa molecular de aproximadamente 47, que desaparece do seu perfil proteico assim que a eluição da β-vicinina é iniciada, logo após os 17% de NaCl 102

7 A 1 B ,12 Abs (280 nm) α 0,08 0,5 0,04 β 0, Volume de Eluição (ml) NaCl (M) 24 FigII-15- Cromatograma e gel representativos da purificação das principais fracções da globulina total de sementes de Vicia (A) Fraccionamento final da α-vicinina e da β- vicinina por cromatografia troca aniónica por FPLC, em coluna de Q-Sepharose, tendo como tampão de trabalho Tris-HCl 50 mm, ph 8,5 (tampão A); o gradiente obtido fez-se adicionando ao tampão A, NaCl 1M (tampão B- Tris-HCl 50 mm, ph 8,5, 1 M NaCl) Injectaram-se separadamente ml de α-vicinina e 12 ml β-vicinina na coluna O fluxo da solução tampão foi de 1,5 ml / min A eluição das proteínas foi continuamente registada por leitura da absorvência a 280 nm (B) gel SDS-PAGE-R, 12,5% (m/v) em acrilamida, que ilustra a purificação e a variedade de polipéptidos constituintes de cada fracção Aplicaram-se 50 μg de proteína por coluna Os eluídos aplicados representam os picos registados: coluna 0- marcadores de massa molecular, coluna 1- globulinas totais antes do processo de fraccionamento, coluna 2- β-vicinina, coluna 3- α-vicinina Purificação da δ-vicinina Utilizou-se a coluna de afinidade con-a-sepharose, no processo de purificação desta fracção globulínica Esta metodologia revelou ser adequada, uma vez que a coluna de afinidade reteve a banda de 47, anteriormente referida (FigII-16 e FigII-17) 103

8 FigII-16- SDS-PAGE-R das diferentes fracções resultantes da aplicação da δ-vicinina à coluna de Con-A-Sepharose As colunas 1 e 1 representam os marcadores de massa molecular, respectivamente A coluna 2 representa a amostra controlo, fracção não adsorvida à coluna Q- Sepharose; as colunas 3, 4, 5, 7 e 8 as fracções obtidas após a deposição da amostra na coluna; as colunas 6 e 9 dão-nos as fracções resultantes das lavagens com o tampão de ligação; e as colunas 10, 11 e 12 os eluídos resultantes da desadsorção dos polipéptidos à coluna de Con-A- Sepharose Em cada coluna foi aplicada a totalidade das amostras colectadas, ie, colheram-se fracções de 2,7 ml que foram dessalinizadas para água a ph 7,5, liofilizadas, e o respectivo liofilizado ressuspenso em tampão de amostra desnaturante e redutor, num volume total de 80 μl, que se aplicou na totalidade a cada um dos poços FigII-17 - Análise electrofotrética da δ-vicinina em condições desnaturantes e redutoras (SDS-PAGE-R) Coluna 1, δ- vicinina; coluna 0, marcadores de massa molecular 104

9 1333- Purificação da γ-vicinina O pico correspondente à γ-vicinina representa a fracção com menor evidência entre as globulinas, que não possui carga negativa ao ph 7,5, pelo que não é adsorvida à coluna de troca aniónica Q-Sepharose (FigII-14A) Exibe uma contaminação por outras classes de proteínas (FigII-14B), pelo que foi limpa por passagem por coluna dietilaminoetil-celulose (DE-52), para adsorver a maioria das proteínas contaminantes, reaplicada ao FPLC, e a fracção proteica não ligada finalmente sujeita a cromatografia de afinidade em coluna de concanavalina A-Sepharose (descrito em Métodos II3) A análise por gel SDS-PAGE-R do eluído representativo da eluição registada pela coluna de afinidade (FigII-18), mostra a existência de, pelo menos, 4 bandas, de massas moleculares aproximadas de 32, 21, 23 e 16, que, devido à especificidade, são glicoproteínas FigII-18- Análise electroforética da γ-vicinina realizada em condições desnaturantes e não redutoras (SDS-PAGE) Perfil electroforético da γ-vicinina, após eluição da coluna de afinidade concanavalina-a-sepharose Aplicaram-se 50 μg de proteína Coluna 1, γ-vicinina; colunas 0 e 0, marcadores de massa molecular 105