CINTIA APARECIDA LOPES GODOY-ESTEVES

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1 1 CINTIA APARECIDA LOPES GODOY-ESTEVES ESTUDO COMPARATIVO DA UTILIZAÇÃO DE MEMBRANAS AMNIÓTICAS DE COELHA E HUMANA COMO ENXERTO EM CERATOPLASTIA LAMELAR EM COELHOS Tese apresentada ao Programa de Pósgraduação em Cirurgia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para obtenção de título de Doutor em Medicina Veterinária Departamento: Cirurgia Área de concentração: Cirurgia Orientador: Prof. Dr. Paulo Sergio de Moraes Barros São Paulo 2005

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3 FICHA CATALOGRÁFICA 2

4 PARECER BIOÉTICA 3

5 4 FOLHA DE AVALIAÇÃO Nome: GODOY-ESTEVES, Cintia A. Lopes Título: Estudo comparativo da utilização de membranas amnióticas de coelha e humana como enxerto em ceratoplastia lamelar em coelhos Tese apresentada ao Programa de Pósgraduação em Cirurgia da da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para obtenção de título de Doutor em Medicina Veterinária Data: / / Banca Examinadora Prof. Dr. Paulo Sergio de Moraes Barros Assinatura Prof. Dr. José Luís Laus Assinatura Prof. Dr. José Álvaro Pereira Gomes Assinatura Prof. Dr. Maria Regina Baccaro Assinatura Prof. Dr. Idércio Luiz Signorini Assinatura Instituição: Julgamento: Instituição: Julgamento: Instituição: Julgamento: Instituição: Julgamento: Instituição: Julgamento:

6 5 RESUMO GODOY-ESTEVES, C. A. L. Estudo comparativo da utilização de membranas amnióticas de coelha e humana como enxerto em ceratoplastia lamelar em coelhos. [Comparative study about the use of human amniotic membrane and amniotic membrane of rabbit as graft in lamelar keratoplasty in rabbits] f. Tese (Doutorado em Medicina Veterinária) - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, Recentemente, têm-se visto notáveis avanços nas cirurgias de reconstrução da superfície ocular com a introdução do transplante de membrana amniótica. Para alcançar esses bons resultados, muitas pesquisas têm sido feitas em laboratório, utilizando o coelho como modelo animal experimental. Contudo, muitas dessas investigações são sobre os efeitos da membrana amniótica humana na superfície ocular de coelhos e pesquisadores já relataram a possibilidade de a membrana amniótica humana incitar reações de rejeição xenogênica no olho do coelho. Frente à inexistência de relatos de estudos comparativos dos efeitos da membrana amniótica de origem humana em relação à de coelha, objetivou-se o estudo comparativo da utilização de membranas amnióticas de coelha e humana como enxerto em ceratoplastia lamelar em coelhos. Foram utilizados 32 coelhos, raça Nova Zelândia, brancos, machos, com peso 1,5-2,0kg, divididos em 4 grupos de 4 animais cada, para cada membrana e após períodos de evolução de 2, 7, 15 e 30 dias, os animais foram submetidos à eutanásia, as córneas trepanadas e fixadas em glutaraldeído a 2% tamponado, processadas e avaliadas por meio de microscopia óptica (HE, picrosírius, alcian blue) e contagem de células inflamatórias e neovasos. Nas avaliações clínicas, ambos os grupos apresentaram comportamento semelhante. Nas avaliações microscópicas, a membrana amniótica tanto de origem humana quanto a de coelha foram incorporadas e reabsorvidas, contudo os animais do grupo I (membrana amniótica humana) apresentaram maior grau de infiltrado inflamatório e neovascularização do

7 6 que o grupo II (membrana amniótica de coelha), diferença estatisticamente significativa (p<0,05) no teste de Mann-Whitney. Palavras-chave: Oftalmologia. Córnea. Membrana Amniótica. Coelho.

8 7 SUMMARY GODOY-ESTEVES, C. A. L. Comparative study about the use of human amniotic membrane and amniotic membrane of rabbit as graft in lamelar keratoplasty in rabbits. [Estudo comparativo da utilização de membranas amnióticas de coelha e humana como enxerto em ceratoplastia lamelar em coelhos] f. Tese (Doutorado em Medicina Veterinária) - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, Recently, we have seen a remarkable advance on ocular surface reconstruction surgeries with the adjuvant amniotic membrane transplantation. To achieve these results, a lot of laboratory research has been made, using the rabbit as an experimental animal model. However, almost all investigations have been about the effects of the human amniotic membrane on the rabbit ocular surface and, investigators have reported that the human amniotic membrane can incite xenoresponse by the rabbit eye. The inexistence of papers comparing the effects of human amniotic membrane and amniotic membrane of rabbit in the cornea of rabbit was the purpose of this study. Thirty two New Zealand white rabbits, males, weighing 1,5-2.0 kg were used, divided in 4 groups with 4 animals each, for each membrane. After 2, 7, 15 and 30 days post operatively, the animals were euthanized and the cornea trephined, fixed in 2% tapped glutaraldehyd, evaluated under optical microscopy (HE, picrosirius and alcian blue) and inflamamatory cells and blood vessels in stroma were counted. Clinically, one could observe similar reactions in both groups. At microscopic evaluations, one could observe incorporation and resorption of amniotic membranes from both groups, however the number of inflammatory cells and blood vessels in group I (human amniotic membrane) was greater than in group II (rabbit amniotic membrane), diference statistically significant with Mann-Whitney test (p<0,05). Key words: Ophthalmology. Cornea. Amniotic Membrane. Rabbit.

9 8 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO REVISÃO DA LITERATURA Aspectos histológicos Aspectos imunológicos Preparo e armazenamento da membrana amniótica Aplicações da membrana amniótica Características da membrana amniótica MATERIAL E MÉTODO Animais Grupos experimentais Obtenção da membrana amniótica Procedimento cirúrgico Ceratoplastia Avaliação macroscópica Avaliação microscópica Análise estatística RESULTADOS Avaliação macroscópica Avaliação microscópica Análise estatística DISCUSSÃO CONCLUSÕES REFERÊNCIAS... 85

10 9 1 INTRODUÇÃO A utilização da membrana amniótica humana tem se consagrado na última década como ótimo adjuvante nas cirurgias de reconstrução da superfície ocular. Muitas das propriedades da membrana amniótica sobre a superfície ocular foram determinadas a partir de pesquisas realizadas em coelhos. Contudo, o uso de membrana de origem humana pode induzir reações ao tecido transplantado, o que interfere na interpretação dos resultados. Têm sido pouco estudados os efeitos do transplante com membrana amniótica de coelha nesses animais, bem como as reações desses receptores a enxertos xenógenos e alógenos. Devido à escassez de dados comparativos entre os enxertos com membranas amnióticas de origem humana e de coelha, propusemos comparar as reações dos enxertos com membrana amniótica humana (xenógena) e membrana amniótica de coelha (alógena) em ceratoplastia lamelar em coelhos, utilizando-se parâmetros clínicos e histológicos (hematoxilina-eosina) com determinação da distribuição e caracterização das proteoglicanas pela coloração com alcian blue, determinação do tipo de colágeno com a utilização da técnica de picrosirius e contagem de células inflamatórias e neovasos.

11 10 2 REVISÃO DA LITERATURA As pesquisas em relação ao uso de membranas biológicas na oftalmologia têm avançado nas últimas décadas demonstrando resultados promissores, principalmente concernente à utilização da membrana amniótica para a reconstrução da superfície ocular. A investigação da viabilidade da utilização de membranas fetais e, posteriormente, de membrana amniótica propriamente, como enxerto, não é inédita; Davis 1 (1910, appud TRELFORD e TRELFORD-SAUDER, 1979) fez o primeiro relato do emprego de membranas fetais para transplantes de pele. Sabella 2 (1913, appud TRELFORD e TRELFORD-SAUDER, 1979), relataram independentemente o uso da membrana amniótica em superfícies cutâneas queimadas e ulceradas. No olho, foi utilizada, pela primeira vez por DeRoth, em 1940, na reparação de simbléfaro e defeitos conjuntivais. Trelford et al. (1972) relataram os resultados do uso do âmnion isolado como autoenxerto e aloenxerto em ovelhas, quando comprovou-se que os resultados eram melhores com o lado mesenquimal voltado para o receptor. Foram diversos os experimentos utilizando a membrana amniótica, sendo finalmente aclamada a sua aplicação em feridas não cicatrizadas de diabéticos, como enxerto sobre defeitos cirúrgicos de glossectomia total, como recobrimento biológico de onfaloceles e na prevenção da adesão tecidual em cirurgias da cabeça, abdômen, pélvis, vagina e laringe (TRELFORD; TRELFORD-SAUDER, 1979). Em 1992, no congresso da Sociedade Dominicana de Oftalmologia na República Dominicana, foi apresentado o trabalho intitulado "Membranas placentárias como substituto conjuntival", no qual descrevia-se o uso de "tecidos soviéticos" como transplantes alógenos 1 DAVIS, J. W. Skin transplantation with a review of 550 cases at The Johns Hopkins Hospital, Johns Hopkins Medical Journal v. 15; p. 307, SABELLA, N. Use of fetal membranes in skin grafting. Medicine Records. v. 83, p. 478.

12 11 em cirurgias de conjuntiva, tarso, órbita e tendão. Após muitas investigações, descobriu-se que o misterioso tecido soviético se tratava de placenta humana (DUA et al., 2004). Mais recentemente, o transplante de membrana amniótica foi reintroduzido na reconstrução da superfície ocular. Kim e Tseng (1995), induziram lesões corneais severas em coelhos, seguidas de transplante de membrana amniótica. Os resultados foram promissores, evidenciando que a membrana amniótica é capaz de substituir algumas propriedades da membrana basal corneal. Esse relato impulsionou as pesquisas e aplicações da membrana amniótica na reconstrução da superfície ocular. A partir de então, a membrana amniótica tem sido utilizada como adjuvante no tratamento cirúrgico de diversas alterações oculares e resultados encorajadores têm sido relatados por diferentes pesquisadores, atribuídos presumivelmente pela melhora do método de processamento e preservação, o qual mantém as propriedades inerentes do âmnion. 2.1 Aspectos histológicos A membrana amniótica, juntamente com o córion e a alantóide compõem a membrana fetal ou placenta. O córion, a camada mais externa, está em contato com as células maternas e consiste em tecido trofoblástico e mesenquimal; a alantóide é a camada intermediária e a membrana amniótica é a camada mais interna do saco embrionário (DUA; AZUARA- BLANCO, 1999). As placentas diferem de espécie para espécie, sendo a placenta humana do tipo hemocorial (JAINUDEEN; HAFEZ, 1988) e a da coelha hemodicorial corion-alantóica labiríntica (ENDERS; BLANKENXHIP, 1999). A espessura do âmnion na espécie humana varia de 0,02mm a 0,5mm (BOURNE, 1960). Ele é avascular e não possui fonte direta de suprimento sangüíneo. Bourne (1960) descreveu que, durante o estágio inicial da gestação, a membrana amniótica é composta por 5

13 12 camadas: epitélio, membrana basal, camada compacta, camada de fibroblastos e camada esponjosa. A camada epitelial é constituída por uma única camada de células que variam de colunares a cuboidais ou achatadas. Ultraestruturalmente, observa-se que a superfície apical das células epiteliais amnióticas apresenta microvilosidades e sua base expressa processos celulares ou pedículos que se estendem para dentro da membrana basal como um podócito. Os processos basais têm junções do tipo hemidesmossomos e a membrana basal contém tonofilamentos, e a substância basal da membrana é parcialmente amorfa e microfibrilar. O citoplasma contém muitas vesículas pinocíticas, abundantes organelas, incluindo retículo endoplasmático e complexo de Golgi. O núcleo tem uma configuração muito regular com indentações na membrana nuclear. Os nucléolos são freqüentemente grandes e homogêneos, sugerindo atividade nucleolar (POLLARD; AYE; SYMONDS, 1976). A ultra-estrutura do epitélio sugere que o âmnion possui funções especializadas, realizando três papéis primordiais: como epitélio de revestimento, como epitélio ativamente secretor e realizando transporte intercelular e transcelular intenso. A membrana basal é uma camada fina composta de fibras reticulares e está firmemente aderida ao epitélio amniótico por processos interdigais. A lâmina basal da membrana amniótica contém grandes quantidades de proteoglicanos ricos em heparin sulfato. Acreditase que os proteoglicanos atuem como uma barreira restringindo a permeabilidade do âmnion. O âmnion contém uma grande quantidade de colágeno, hialuronato e predominantemente pequenos proteoglicanos tais como o biglican e o decorin (MEINERT et al., 2001). Outros autores acrescentam componentes como colágenos do tipo I, III, IV, V e VII (APLIN; CAMPBELL; ALLEN, 1985; KEENE; SAKAI; LUNSTRUM, 1987; MODESTI; SCARPA; DORAZI, 1989; YURCHENKO; RUBEN, 1987), laminina e fibronectina (APLIN;

14 13 CAMPBELL; ALLEN, 1985) identificados na membrana basal e no estroma da membrana amniótica. A camada compacta é uma densa camada quase totalmente isenta de células e consiste principalmente de um complexo reticular. A camada de fibroblastos é a mais espessa e os fibroblastos encontram-se imersos em uma malha reticular frouxa. A camada mais externa, a esponjosa, forma uma interface entre a membrana amniótica e o córion e consiste de bandas de retículo banhados de mucina (BOURNE, 1960). Completado o período gestacional, o âmnion consiste de uma única camada de células firmemente aderidas à camada mesenquimal cuja espessura é de 6 a 8 camadas de células e está frouxamente aderida ao córion. (TRELFORD; TRELFORD-SAUDER, 1979) Fukuda et al. (1999), observaram que a distribuição das cadeias de colágeno IV na membrana basal da membrana amniótica é semelhante à distribuição presente na conjuntiva, diferindo no entanto da existente na córnea. Essa observação baseou-se na presença das cadeias α5(iv) no epitélio corneal e na ausência destas na membrana amniótica e na conjuntiva. Endo et al. (2004), verificaram por meio de estudos imunohistoquímicos, em amostras previamente tratadas com uréia, cadeias de colágeno tipo IV α5 nas membranas amniótica e basal corneal. Entretanto, sua presença não foi detectada na membrana basal conjuntival. Vários fatores de crescimento (TGF- β1 e β 2,EGF, TGF-α, KGF, HGF, bfgf) foram identificados na membrana amniótica preservada a -80ªC por 1 mês. Constatou-se que a provável origem dessas citoquinas seja epitelial, uma vez que a membrana amniótica com epitélio apresentou os maiores níveis dessas substâncias (KOIZUMI; INATOMI; SOTOZONO, 2000).

15 Aspectos imunológicos Imunologicamente, sugere-se, após observações clínicas e experimentais, que o córion tanto alógeno quanto autógeno são mais antigênicos que a membrana amniótica, o que pode ser devido ao maior contato dessa membrana com a face materna da placenta. O âmnion autógeno é reconhecido como próprio, e o alógeno é minimamente ativo (TRELFORD; TRELFORD-SAUDER, 1979). Adinolfi et al. (1982) afirmaram que as células da membrana amniótica não expressam antígenos HLA-A,B,C ou DR ou microglobulinas β 2 em sua superfície. Porém, Houlihan et al., 1995, evidenciaram a expressão de HLA-E e HLA-G. HLA-A, HLA-B e HLA-C são antígenos de histocompatibilidade maior (MHC) classe I, os quais são responsáveis pela regulação da resposta de linfócitos T CD8 (citotóxicos) e estão relacionados ao controle de rejeição de transplantes. O HLA-G também é classe I e é expresso na placenta com papel de proteção do feto contra ataques de células Natural Killers da mãe. HLA-D é classe II e relaciona-se à ação de linfócitos CD4 (helper) (FORRESTER et al., 2002). A resposta imune a um enxerto alógeno é, geralmente, iniciada pelas células T CD4 (helper) reconhecendo os antígenos de histocompatibilidade maior (MHC) e menor (mh) expressos no tecido enxertado. A indução de resposta inflamatória a aloenxertos mediada por células T CD4 leva à diferenciação de células T CD8 contra o tecido enxertado, à produção de anticorpos pelas células B e ativação de fagócitos. Recentemente, demonstrou-se que a aloimunidade pode desencadear uma resposta auto-imune direcionada a antígenos órgão-específicos (OSA) do enxerto. (ILLIGENS et al., 2002). A ativação do CD 4 é desencadeada via dois mecanismos distintos: o direto (via MHC) e o indireto (via mh). Os transplantes de córnea representam um modelo interessante de investigação das vias direta e indireta da alo-resposta. Os enxertos de córnea naturalmente

16 15 não possuem células apresentadoras de antígeno MHC classe II e possuem pequena quantidade de moléculas MHC classe I. Na rejeição da córnea, os antígenos mh são mais potentes mediadores do que os antígenos MHC, portanto a rejeição corneal é comandada por uma alo-resposta indireta, enquanto que a resposta direta não ocorre (ILLIGENS et al., 2002). A aloimunidade é mediada por uma combinação doador/receptor, direta ou indireta, que varia de acordo com a natureza do tecido ou órgão transplantado. O local receptor do enxerto ou órgão, considerando-se seus sistemas linfático e vascular, pode ser um fator chave no comando da escolha das vias direta ou indireta para a resposta imune após o transplante. É pouco esclarecido o papel da predominância de reposta direta ou indireta influenciando na natureza do processo de rejeição. É provável que respostas imunes por via direta, policlonal de curta duração, induza formas de rejeição agudas e rápidas, enquanto que as que ocorrem por via indireta, oligloclonal mas persistente, estejam associadas às formas agudas tardias ou crônicas (ILLIGENS et al., 2002). Kubo et al. (2001) demonstraram que a membrana amniótica criopreservada expressa fortemente antígenos classe I, mesmo após 6 meses de preservação, sugerindo que a membrana amniótica criopreservada pode conter células viáveis expressando HLA-G. Apesar disso, no mesmo experimento, foi evidenciada que a membrana amniótica pode comportar-se como tecido imune-privilegiado. Esses pesquisadores, utilizando modelos de transplante xenógeno (membrana humana em rato Lewis) no limbo (local sem privilégio imunológico) e na córnea (local de privilégio imunológico), observaram discreto infiltrado celular no transplante límbico, contudo não havia destruição ou lise completa da membrana amniótica. Por meio de análises imunohistoquímicas, realizadas uma semana após o enxerto no limbo, foram observadas células T (especialmente CD 4+) ao redor da membrana amniótica transplantada, indicando reação mediada por células. Todos os transplantes intracorneais não

17 16 demonstraram qualquer reação imune e conservou plena transparência a longo prazo. Enxertos de pele, utilizados como controle, foram todos rejeitados, mesmo nos espaços intracorneais. Complementando a pesquisa, realizaram-se enxertos com membrana amniótica e pele sob a cápsula renal, local considerado sem privilégio imune e fora do olho. Observaram-se discreta reação inflamatória ao redor da membrana amniótica com poucas células infiltrando o estroma amniótico e infiltração exuberante de células do hospedeiro na pele enxertada. 2.3 Preparo e armazenamento da membrana amniótica A membrana amniótica, previamente ao seu uso, deve ser submetida a processamento e preservação realizados sob condições estéreis. Antibióticos com ação contra bactérias Gram negativas e Gram positivas e contra fungos são usados na lavagem e na solução de armazenamento. Quanto aos métodos de preservação, podem-se utilizar dois protocolos. O desenvolvido pelo grupo de Tsubota (SHIMAZAKI; YANG; TSUBOTA, 1997) recomenda o corte da membrana em fragmentos de 10cmX10cm e lavagem seqüencial por 5 minutos em cada uma das soluções - 0,5M dimethyl sulfoxido (DMSO), 1.0M DMSO e 1.5M DMSO. O outro protocolo consiste na preservação da membrana em glicerina a 50% em meio Eagle modificado de Dulbeco (KIM; TSENG, 1995; LEE; TSENG,1997). Em ambos, a membrana é mantida congelada a -80º C até sua utilização. Adds, Hunt e Dart (2001) compararam os resultados da aplicação da membrana amniótica congelada (-80º C) e a fresco (+4º C). Apesar de ambos os procedimentos terem resultado em melhora da acuidade visual, com leve superioridade do material a fresco, a membrana a fresco demonstra desvantagens, tais como a inviabilidade de sorologia do doador devido ao curto período entre a captação e o transplante e realizar a captação para um receptor

18 17 específico, sendo desprezado o restante da membrana. O método de congelamento beneficia até trinta pacientes com a membrana amniótica de uma única placenta. Outro método de preservação sugerido é o congelamento a seco da membrana amniótica, acondicionada à vácuo e esterilizada com radiação gama. Testes realizados demonstraram que esse método preservou as características físicas, biológicas e morfológicas, da mesma forma que a criopreservação, conseqüentemente sendo um método útil (NAKAMURA et al., 2004). Em medicina veterinária, tem-se utilizado a membrana amniótica preservada em glicerina 98%. Mackie (1997) descreve a glicerina como sendo meio satisfatório na preservação de membranas biológicas, a qual mantém as características bactericidas, antivirais e a integridade morfológica da estrutura. Maral, Borman e Arslan (1999) preservaram a membrana amniótica em glicerol 85% a 4ºC por mais de um ano e demonstraram que sua performance foi tão boa quanto a membrana utilizada a fresco no tratamento de queimaduras cutâneas. O método de preparação é importante para manter a baixa taxa de infecções microbianas após o transplante de membrana amniótica (MARANGON et al., 2004). 2.4 Aplicações da membrana amniótica As principais aplicações da membrana amniótica nas cirurgias de reconstrução da superfície ocular foram descritas por Dua et al. (2004) em uma extensa revisão sobre a utilização do âmnion na oftalmologia. Quando a membrana amniótica é utilizada para recobrir uma área da superfície ocular e ela é removida ou cai espontaneamente, refere-se como sendo "patch" (recobrimento). Se a membrana é utilizada esperando-se que ela se torne epitelizada e incorporada ao tecido

19 18 receptor, refere-se como enxerto. No "patch", a epitelização ocorre sob a membrana, enquanto que no enxerto, o epitélio cresce sobre ela, utilizando-a como um substrato. A aplicação da membrana amniótica sobre a córnea pode ser total ou parcial, dependendo da severidade e extensão das lesões. Cirurgias de pálpebra e conjuntiva também podem ser indicações para seu uso. É importante dar atenção à orientação da membrana amniótica. Quando há a necessidade da membrana funcionar como substrato para a migração celular, isto é, quando utilizada como enxerto, a membrana tem que ser suturada no local com a membrana basal ou o lado epitelial para cima. Quando utilizada como bandagem biológica, primariamente para conter reação inflamatória enquanto a epitelização ocorre sob a membrana, ela é suturada com o lado epitelial em contato com a superfície ocular. O lado estromal da membrana encarcera células inflamatórias e induz apoptose, reduzindo inflamação. Os dois métodos podem ser utilizados em associação, bem como podem-se utilizar várias camadas de membrana para, por exemplo, preencher uma área de ceratomalácia ou afinamento corneal. Advoga-se que a última camada seja maior que as outras e seja suturada com o lado epitelial para cima. A membrana amniótica pode ser utilizada como uma matriz para recuperar o estroma danificado da superfície ocular em diferentes indicações clínicas, tais como Síndrome de Stevens-Johnson (GOMES et al., 2003; HONAVAR et al., 2000; TSUBOTA et al., 1996) ; queimaduras químicas e térmicas (GOMES et al., 2003; MELLER et al., 2000; SHIMAZAKI; YANG; TSUBOTA, 1997); reconstrução da superfície conjuntival (TSENG; PRABHASAWAT; LEE, 1997); defeitos epiteliais com ulceração (LEE; TSENG, 1997; PRABHASAWAT; TESAVIBUL; KOMOLSURADEJ, 2001; TSENG, 2001); pterígio (PRABHASAWAT et al., 1997); cirurgias filtrantes para glaucoma (BARTON et al., 1997; FUJISHIMA et al., 1998); pterígio recidivante associado a simbléfaro (SHIMAZAKI;

20 19 SHINOZAKI; TSUBOTA, 1998); deficiência de células germinativas do limbo (ANDERSON et al., 2001; TSENG et al., 1998); ceratopatia bolhosa (PIRES et al., 1999); úlceras corneais profundas (KRUSE; ROHRSCHNEIDER; VÖLCKER, 1999); ceratoconjuntivites cicatriciais (GOMES et al., 1999); úlcera corneal neurotrófica (CHEN; PIRES; TSENG, 2000); perfuração escleral (RODRIGUEZ-ARES et al., 1999); perfuração corneal com a combinação do uso de adesivos (SU; LIN, 2000); úlceras em escudo de ceratoconjuntivite vernal (SRIDHAR et al., 2001); ceratite necrosante por HSV-1 (HEILIGENHAUS et al., 2001); ceratopatia em faixa (ANDERSON et al., 2001); calázio conjuntival sintomático refratário a tratamento médico (MELLER et al., 2000); melanoma conjuntival maligno (PARIDAENS et al., 2001); para redução de haze pós fotoablação com excimer laser em coelhos (CHOI et al., 1998; WANG et al., 2001; WOO et al., 2001); necrose epidérmica tóxica aguda (JOHN et al., 2002). Em algumas ocasiões não houve sucesso com a utilização da membrana amniótica, em casos de defeitos epiteliais com afinamento estromal (AZUARA-BLANCO; PILLAI; DUA,1999) e em perfurações corneais (LEE; TSENG, 1999). Esses insucessos com úlceras profundas ou defeitos epiteliais persistentes com afinamento estromal foram superados com a utilização da técnica de transplante de diversas camadas de membrana amniótica, como relatado por Kruse, Rohrschneider e Völcker (1999), Prabhasawat, Tesavibul e Komolsuradej (2001) e Rodriguez-Ares et al. (2004). Fazendo-se um levantamento das indicações do transplante de membrana amniótica, pode-se constatar que ela tem vasta aplicação nas ceratoconjuntivites cicatriciais. As ceratoconjuntivites cicatriciais são consideradas um grupo heterogêneo de doenças que possuem como denominador comum o processo cicatricial secundário à inflamação e seus efeitos na superfície ocular (ALVES; LUI NETTO; GOMES, 2002). Seis são os tipos de alterações principais decorrentes das ceratoconjuntivites cicatriciais: olho seco; alterações

21 20 palpebrais; destruição do limbo e células germinativas corneais; destruição da membrana basal; processo inflamatório; alteração na integração neuro-anatômica da superfície ocular (GOMES, 2000). As ceratoconjuntivites caracterizadas por deficiências das células germinativas do limbo podem ser divididas em dois grupos: I) Aplasia: perda da população de células germinativas do limbo por destruição primária e II) Hipofunção: disfunção do meio estromal das células germinativas do limbo. Como representantes do grupo I podemos citar: injúrias químicas ou térmicas, Síndrome de Stevens-Johnson ou necrólise epidérmica tóxica, múltiplas cirurgias ou crioterapias no limbo (iatrogênica), toxicidade por antimetabólitos, ceratopatia induzida por lente de contato, infecção microbiana severa. No grupo II encontram-se: aniridia hereditária, ceratites associadas à deficiências endócrinas múltiplas (hereditária), ceratopatia neurotrófica (neuronal ou isquêmica), ceratopatia induzida por radiação, inflamação e ulceração corneal periférica ou limbite crônica, pterígio e pseudopterígio e idiopática. (PIRES; GOMES, 2002). Os efeitos observados no transplante de membrana amniótica foram a epitelização facilitada, manutenção do perfil fenotípico epitelial normal (ESPANA et al., 2003), redução da inflamação, bem como da vascularização e da cicatrização (PIRES; GOMES, 2002). Nas ocasiões em que a deficiência de células germinativas do limbo é total, faz-se necessário o transplante de limbo do olho contralateral ou, nos casos de doença bilateral, de doador com HLA compatível. Nesse contexto, Tseng et al. (1998) avaliaram a eficiência do transplante de membrana amniótica isolado e associado a enxertos alógenos de limbo na reconstrução da superfície ocular de pacientes com deficiência das células germinativas do limbo. Para deficiências límbicas parciais, a membrana amniótica é suficiente e até superior ao transplante alógeno de limbo, face à não necessidade da administração de ciclosporina ao paciente. Nas deficiências

22 21 totais, o transplante de limbo é essencial, pois nele estão localizadas as células responsáveis para a renovação apropriada do epitélio corneal. Em 2003, um grupo de pesquisadores (MARINHO et al., 2003) questionou a participação da membrana amniótica na recuperação de pacientes submetidos ao transplante associado dessa membrana com enxerto de limbo. Para tal investigação, realizou-se experimento a longo prazo com coelhos submetidos a queimadura química severa, desenvolvendo deficiência total de limbo. Subseqüentemente procederam o transplante de limbo isolado e transplante de limbo associado a transplante de membrana amniótica. A conclusão foi a de que o transplante de limbo é efetivo para o tratamento da deficiência límbica e que o transplante de membrana amniótica não acrescentou benefícios nesse modelo experimental em coelhos. Sob o aspecto morfológico, os efeitos do transplante de membrana amniótica foram analisados em córnea de pacientes que tiveram que ser submetidos a ceratoplastia penetrante para melhora da acuidade visual. Gris et al. (2002), descreveram os achados histológicos da córnea de dois pacientes que receberam enxertos de membrana amniótica devido a defeito epitelial persistente e úlcera neurotrófica. A epitelização foi bem sucedida em ambos os casos. No primeiro paciente, cuja córnea não sofreu a invasão de vasos, três meses após o implante pôde-se observar uma faixa de tecido espessa correspondente à membrana amniótica implantada, com desaparecimento de alguns fragmentos desse material. Não foram encontradas células gigantes, constantes nas reações de corpo estranho, tampouco células monocíticas ou histiocíticas foram identificadas por meio de imunohistoquímicas (esperadas no processo de reabsorção). No outro paciente sete meses após o implante, à microscopia óptica, não foram identificados resquícios da membrana amniótica, em seu lugar foi encontrado tecido fibroso espesso recém formado, diferente do tecido estromal adjacente. Em contraste com o primeiro caso, vascularização e intenso infiltrado inflamatório composto por

23 22 histiócitos, linfócitos T e, em pequena proporção, linfócitos B. Portanto, uma vez que a membrana amniótica é reabsorvida, é substituída por tecido estromal fibrótico que conserva parcialmente a espessura estromal, mas não a mesma transparência do estroma saudável. Em córneas com vascularização estromal, o enxerto é rapidamente absorvido devido à abundância de células inflamatórias. O oposto ocorre nas córneas avasculares, nas quais a reabsorção da membrana amniótica é lenta e nenhum tipo de reação inflamatória é produzida. A histopatologia de córneas, 5 a 13 meses decorridos do transplante de membrana amniótica e células germinativas do limbo de pacientes que sofreram queimadura química severa, também foi realizada por Stoiber et al. (2002). Nesse estudo, realizaram-se análises à microscopia óptica, eletrônica de transmissão e imunofluorescência direta. Todas as amostras apresentaram epitélio estratificado sem evidências de células caliciformes, o que implicaria em contaminação por epitélio conjuntival. As células basais demonstraram firme conexão aos resquícios de membrana amniótica, os quais em alguns locais pareceram estar em um estado de modificação ou remodelagem das fibras de colágeno. Por meio de imunohistoquímica, colágeno tipo IV e VII, integrin α6 e β4, laminin5 e hemidesmossomos foram identificados na região da membrana basal. Colágeno IV também foi identificado nos resquícios de membrana amniótica, bem como na membrana amniótica criopreservada. A membrana amniótica transplantada aparentemente sobrevive e se integra ao tecido do hospedeiro sendo modificada e remodelada pelas células receptoras. Tosi et al. (2005), avaliaram sob microscopia óptica córneas de cinco pacientes submetidos a transplante de córnea ou a enucleação devido a causas diversas, 2 a 20 meses após terem recebido transplante de membrana amniótica. O material das cirurgias, bem como córneas e membranas amnióticas controles, foram fixados em formalina tamponada e os cortes corados com hematoxilina-eosina, ácido periódico de Schiff (PAS), tricromio de Gomori e Masson e Alcian Blue (ph 2,5), além da realização de várias provas

24 23 imunohistoquímicas. As membranas amnióticas controles coraram-se em azul pelo Alcian Blue, seu estroma corou em verde claro com ao uso do tricrômio de Masson e sua membrana basal foi evidenciada pelo PAS, contudo nenhum desses métodos foi eficiente em demonstrar a presença de resquícios da membrana amniótica nas córneas dos pacientes que foram submetidos ao transplante de membrana amniótica, evidenciando sua completa integração e reabsorção. Esses achados indicam que a membrana basal da membrana amniótica promove a reconstrução da superfície ocular logo em seguida ao transplante e, posteriormente, a membrana amniótica, por meio de suas propriedades biológicas, favorece a restauração da membrana basal pelas células epiteliais corneais basais. Apesar dos avanços alcançados nos tratamentos de certas afecções oculares com o advento do transplante de membrana amniótica para a superfície ocular, ainda há a necessidade de obtenção de tecidos que substituam a córnea, o que parece ser possível através da bioengenharia. A produção de tecidos por bioengenharia e sua aplicabilidade na substituição da córnea tem sido demonstrada em estudos in vitro, em animais de maneira experimental e, muito recentemente em pacientes sofrendo de doenças da superfície ocular. Em cultura de tecidos, a membrana amniótica suporta o crescimento de células epiteliais do limbo por cultura de explantes e, em seguida, a membrana amniótica com células epiteliais pode ser transplantada para a superfície corneal afetada (PIRES; GOMES, 2002). A expansão ex-vivo de população celular colhida e o cultivo diretamente sobre uma membrana amniótica modificada resulta em um tecido resistente o suficiente para ser facilmente transplantado e que biologicamente mimetiza a superfície corneal (PIRES; GOMES, 2002).

25 24 A expansão ex vivo de células epiteliais corneais sobre camadas de fibrina e subsequente transferência para a superfície conjuntival para o manejo de deficiência de células germinativas foi descrita primeiramente por Pellegrini, Traverso e Franzi (1997). He et al. (1999) relataram o transplante experimental de células de limbo humano e de células epiteliais amnióticas cultivadas sobre a superfície côncava de lentes de contato de colágeno para a superfície corneal, concluindo que o transplante foi bem sucedido na córnea desepitelizada, onde houve firme adesão do enxerto por meio de hemidesmossomos. Koizumi et al. (2000) utilizaram a membrana amniótica humana como substrato para o cultivo de células epiteliais corneais límbicas e realizaram seu transplante autógeno em coelhos, concluindo que o procedimento é factível. Nesse mesmo ano, avaliou-se o cultivo de células epiteliais extraídas da córnea central de coelhos com a utilização de membrana amniótica humana com e sem epitélio como substrato, obtendo-se melhores resultados com a membrana amniótica desepitelizada (KOIZUMI et al., 2000). Considerando os resultados dos experimentos realizados em coelhos com o transplante de células cultivadas ex vivo em membrana amniótica, pacientes humanos estão sendo submetidos ao mesmo tipo de procedimento. Schwab, Reyes e Isseroff (1999) fizeram o primeiro relato da utilização de tecido produzido por bioengenharia em pacientes com doenças na superfície ocular, descrevendo que as células germinativas epiteliais da córnea podem ser colhidas com segurança do limbo, expandidas com sucesso in vitro e cultivadas em membrana amniótica desepitelizada. O tecido resultante pode ser transplantado e parece gerar bons resultados em olhos com alterações da superfície ocular, incluindo deficiência de células germinativas. Shimazaki et al. (2002), realizaram transplante de epitélio límbico humano cultivado em membrana amniótica para o tratamento de alterações severas da superfície ocular,

26 25 revelando que a taxa de sucesso desse método não difere do método convencional de transplante de limbo associado ao transplante de membrana amniótica. Na mesma linha, Sangwan et al. (2003) realizaram reconstrução da superfície ocular de paciente com severa deficiência de células germinativas límbicas parcial, bilateral utilizando epitélio conjuntival e límbico autógenos cultivados em uma única membrana amniótica, o que demonstrou ser uma excelente opção em pacientes selecionados com pequenas áreas de limbo saudável, evitando assim o risco de rejeição. Nakamura et al. (2003) relataram o sucesso da cultura e auto-transplante de células epiteliais da mucosa oral de coelhos em membrana amniótica. O dano na superfície ocular de coelhos foi provocado com a realização de ceratectomia lamelar e excisão da conjuntiva, se estendendo até o limbo. Amostras de mucosa oral foram obtidas e cultivadas por três semanas em uma membrana amniótica humana sem células epiteliais. Após três a quatro semanas de evolução da lesão, a superfície ocular conjuntivalizada foi reparada transplantando-se as células epiteliais da mucosa oral cultivadas em membrana amniótica. O resultado pós cirúrgico foi bom e, com dez dias de evolução, a córnea estava transparente e completamente epitelizada. Além disso, através de pesquisa da presença de queratina por meio de imunohistoquímica, demonstrou-se que as queratinas presentes são as que imprimem a característica de epitélio não queratinizado, como o epitélio corneal. Grueterich, Espana e Tseng (2003), realizaram estudo in vitro e chegaram à conclusão de que culturas de limbo em membrana amniótica intacta mantém o fenótipo epitelial do limbo, enquanto que as culturas feitas em membrana amniótica desepitelizada se diferencia em fenótipo corneal. Mais recentemente, em 2004, Ishino et al., realizaram o cultivo de células endoteliais corneais humanas em membrana amniótica, atingindo densidades maiores que 3000 céls/mm 2 e transplantou esse tecido na face interna de córneas de coelhos já destituídas de membrana de

27 26 Descemet e endotélio. Com o auxílio de biomicroscopia e paquimetria, a espessura corneana foi monitorada e, aos 7 dias de pós-transplante, os enxertos foram avaliados sob microscopia óptica, eletrônica de varredura e de transmissão. As córneas que receberam o transplante apresentaram pouco edema e mantiveram sua espessura e transparência. Os resultados indicaram que a membrana amniótica mantém a morfologia e a função das células endoteliais corneais humanas e que pode servir como carreador dessas células para seu transplante. Bioengenharia de tecidos pode representar o futuro para o reparo de muitos tecidos e órgãos e, para a córnea, a realização desse feito encontra-se próxima. Utilizando-se células germinativas da córnea autólogas cultivadas permite que se faça um banco de células do próprio paciente, assim enxertos repetidos podem ser construídos a partir dessas células sempre que necessário. Não havendo a possibilidade de utilização de células autólogas, a colheita de células alógenas é feita de pequena área do limbo doador (2mm 2 ), minimizando danos iatrogênicos (SCHWAB; REYES; ISSEROFF, 2000). Um dos fatores impedientes da extrapolação dos resultados obtidos dessas pesquisas para o homem é a utilização de membrana amniótica humana (xenógena) e não de coelha nos experimentos, o que pode induzir rejeição ao enxerto xenógeno por parte do receptor (KUBO et al., 2001). Experimento com a utilização de membrana amniótica de coelha foi relatado por Ti et al. (2002), no qual deficiência total de células germinativas do limbo foi provocada com o debridamento de todo epitélio corneal com n-eptanol e posterior remoção cirúrgica da margem límbica de todo o perímetro em olhos de coelhos. Foram constituídos 4 grupos experimentais. No grupo I, utilizou-se membrana amniótica de coelha. Nos grupos II e III, foi transplantado epitélio límbico expandido ex vivo em membrana amniótica de coelha, diferindo no modo de fixação. No grupo IV, foi utilizada membrana amniótica humana na forma de patch além do epitélio límbico expandido ex vivo em membrana amniótica de coelha. Nos animais do grupo I, nos quais foi utilizada membrana amniótica isolada, não houve

28 27 epitelização e todos os olhos permaneceram inflamados. A superfície ocular foi rapidamente invadida por epitélio conjuntival. Os grupos II e III tiveram evoluções satisfatórias e semelhantes. No grupo IV, o uso da membrana amniótica humana como patch temporário promoveu rápida supressão da inflamação da superfície ocular. Além disso, o epitélio transplantado era mais estável. O autor atribuiu o sucesso desse modelo ao uso de membrana amniótica de coelha como substrato de cultura e como carreador para o transplante, resultando na ausência de inflamações decorrentes do xenotransplante. A utilização da membrana amniótica humana como patch foi decorrente da facilidade de obtenção dessa membrana em relação à de coelha e, quando utilizada na forma de patch por menos de 2 semanas, não induz rejeição ao xenotransplante. Em moldes semelhantes, Ti et al. (2004), provocaram deficiência total de células germinativas do limbo no olho esquerdo de 52 coelhos. Em 10 deles, transplantou-se membrana amniótica de coelha, enquanto que nos outros 42 coelhos foram utilizadas células límbicas colhidas do olho direito expandidas em membrana amniótica de coelha para o transplante. Foram avaliados parâmetros clínicos para determinação de sucesso parcial ou total e de insucesso no tratamento proposto. O fenótipo epitelial foi determinado por meio de imunohistoquímica. No grupo no qual foi utilizada apenas a membrana amniótica de coelha, observaram-se 100% de insucesso, prevalecendo epitélio conjuntival nas provas imunohistoquímicas. A porcentagem de sucesso observada nos grupos de animais nos quais células límbicas expandidas foram transplantadas juntamente com a membrana amniótica foi de 26% e a presença do tipo epitelial corneal determinado pelas provas imunohistoquímicas extremamente alta. Esses pesquisadores concluíram que existe forte correlação entre o sucesso clínico e o fenótipo epitelial corneal resultante.

29 28 Em Medicina Veterinária, a membrana amniótica foi utilizada preservada em glicerina no reparo de feridas cutâneas de membros locomotores de eqüinos (OLIVEIRA; ALVARENGA, 1998). Em Oftalmologia Veterinária, Barros et al. (1998) descreveram a utilização experimental da membrana amniótica xenógena (eqüina) para a reparação de perfuração corneal criada por ceratectomia penetrante em cães, com ótimos resultados anatômicos e funcionais. Safatle (1998) estudou comparativamente a capacidade angiogênica do pericárdio e da membrana amniótica de eqüino em córnea de ratos, concluindo que ambas as membranas induziram angiogênese, sendo porém a provocada pela implantação de pericárdio xenógeno mais intensa e mais duradoura do que a da membrana amniótica xenógena. Godoy (2001), realizou estudo da viabilidade da aplicação da membrana fetal (membrana amniótica, córion e alantóide) eqüina como enxerto em ceratoplastia lamelar em cães, obtendo bons resultados, não evidenciando reação de rejeição do material implantado. Souza (2003), comparou os efeitos dos enxertos de membranas amniótica e alantoamniótica alógenas preservadas em glicerina, em ceratoplastia lamelar em cães, concluindo que as membranas implantadas evoluíram de forma semelhante, foram bem toleradas e constituem métodos de real valor na reparação da córnea. No mesmo ano, Freddo discorreu sobre a avaliação do efeito da ciclosporina A a 0,2% tópica sobre a neovascularização em córnea de ratos após implante de membrana amniótica xenógena em microbolsa no estroma corneal, cuja conclusão foi de que a membrana amniótica induziu neovascularização corneal até o 15ª dia de pós-operatório, com posterior regressão e que o uso da Ciclosporina A 0,2% intensificou o processo de neovascularização até o 7ª dia de pós-operatório, mas após esse período, a diminuição dos neovasos foi mais rápida e intensa do que a que ocorreu no grupo controle.

30 29 Recentemente, Barros et al. (2005) relataram o transplante de membrana amniótica canina para a reconstrução da superfície ocular em cão com ceratomalácia bolhosa severa, em gato com anquilobléfaro e após ressecção de histiocitoma esclero-corneal de cão, com ótimos resultados. 2.5 Características da membrana amniótica Cotejando-se os vários estudos que utilizaram a membrana amniótica, pode-se concluir que ela possui várias características inerentes que a tornam um bom material para o tratamento de diversas oftalmopatias. Deve-se salientar que alguns mecanismos de ação da membrana amniótica são descritos por meio de dedução de acordo com sua composição e não por meio de provas científicas de sua aplicação em cirurgias oculares. A membrana amniótica é um material biológico de fácil obtenção com disponibilidade quase ilimitada (DUA; AZUARA-BLANCO, 1999; SHIMAZAKI; SHINOZAKI; TSUBOTA, 1998); pode ser preservada em glicerina a 98% para uso em Medicina Veterinária (BARROS et al., 1998; GODOY, 2001; SOUZA, 2003); para sua utilização em humanos, ela tem sido conservada a 80ºC, por vários meses (DUA; AZUARA-BLANCO, 1999; DUA et al., 2004; KIM; TSENG, 1995; SHIMAZAKI; YANG; TSUBOTA, 1997). Não provoca rejeição imunológica pós-transplante (ADINOLFI et al., 1982; AZUARA-BLANCO et al., 1999), provavelmente por ser um tecido imune-privilegiado (KUBO et al., 2001); possui propriedades antimicrobianas, reduzindo o risco de infecções pós-cirúrgicas (TRELFORD; TRELFORD-SAUDER, 1979). Possui atividade antifibroblástica (KIM et al., 1998; TSENG; LI; MA, 1999; TSENG et al., 1998). Fibrose é conseqüência comum no processo de cicatrização após uma variedade

31 30 de insultos patológicos. Ela envolve processos biológicos complexos mediados por citoquinas, dentre elas o TGF-β (fator de crescimento transformante). Sua expressão aberrante tem sido implicada em diversas lesões fibróticas e inflamatórias. O TGF-β estimula a síntese e a deposição de várias proteínas da matriz extracelular, acompanhadas pelo aumento na síntese de inibidores de proteases, regulando moléculas de adesão celular e suprimindo a síntese de proteases degradadoras de matriz. Coletivamente, essas ações resultam em aumento das interações e adesividade da matriz celular levando à fibrose (TSENG; LI; MA, 1999). Tseng, Li e Ma (1999) demonstraram que a matriz da membrana amniótica suprime o sistema de sinalização do TGF-β, a síntese de DNA e subsequente diferenciação miofibroblástica, o que explica, em parte, os resultados de diminuição da fibrose com o uso da membrana amniótica em cirurgias de reconstrução da superfície ocular. Pode explicar também porque a cura de feridas em fetos não produz cicatriz. O estroma da membrana amniótica é normalmente avascular e acredita-se que ele inibe a incursão de novos vasos. Serve de substrato para o restabelecimento das camadas da córnea (BARROS et al.,1998; SHIMAZAKI; YANG; TSUBOTA, 1997) podendo o transplante de membrana amniótica ser considerado como um transplante de substrato (SHIMAZAKI; YANG; TSUBOTA, 1997); sendo capaz de substituir algumas propriedades da membrana basal corneal (SHIMAZAKI; SHINOZAKI; TSUBOTA, 1998), de promover a diferenciação epitelial (GRUETERICH; ESPANA; TSENG, 2003; KURPAKUS et al., 1992;), e de impedir a apoptose epitelial (CHEN et al., 2000). A membrana amniótica serve como uma membrana basal transplantada, atuando como substrato saudável apropriado para a adequada epitelização. Além disso, a membrana amniótica produz vários fatores de crescimento, como o fator de crescimento fibroblástico, fator de crescimento do hepatócito e fator de crescimento transformante beta, o que pode estimular a epitelização (CHEN et al., 2000; DUA; AZUARA-BLANCO, 1999). A

32 31 membrana basal da membrana amniótica pode prolongar a vida das células epiteliais progenitoras (CHEN et al., 2000) e quando transplantada sobre a superfície ocular não induz alteração na concentração de proteoglicanos (ANDRADE, 2003). Possui efeito antiadesivo (AZUARA-BLANCO et al., 1999; SHIMAZAKI; SHINOZAKI; TSUBOTA, 1998; TRELFORD; TRELFORD-SAUDER, 1979); promove redução da dor (AZUARA-BLANCO et al., 1999; TRELFORD; TRELFORD-SAUDER, 1979), o que pode ser explicado pela restauração do epitélio corneal (PIRES et al.,1999), proteção da ferida (AZUARA-BLANCO et al., 1999; TRELFORD; TRELFORD-SAUDER, 1979), redução da inflamação (PIRES et al., 1999), redução da vascularização (SHAO et al., 2004) e da cicatrização (TSENG; LI; MA, 1999). Solomon et al. (2001) demonstraram in vitro que a matriz da membrana amniótica suprime regulação induzida por lipopolissacarídeos de interleucinas 1α e 1 β em cultura de células epiteliais corneais límbicas, explicando, em parte, o efeito do transplante de membrana amniótica de reduzir inflamação da superfície ocular. A membrana amniótica especificamente inibe o crescimento de células endoteliais e assim suprime a neovascularização da córnea, pois ela libera o fator derivado do epitélio pigmentar (PEDF), fator essencial para a manutenção da avascularidade da córnea e do vítreo (SHAO et al., 2004). Cobrindo-se áreas inflamadas ou expostas com a membrana amniótica, isto é como uma bandagem biológica, influencia positivamente o processo de cura, bem como tem um efeito favorável na diminuição da dor e do desconforto (DUA et al., 2004). A matriz estromal da membrana amniótica contém também várias formas de inibidores de proteases, importantes para promover a cura epitelial e reduzir a inflamação e a ulceração (PIRES et al., 1999). Kim et al. (2000) comprovaram, por meio de modelo experimental de queimadura química em coelhos, que a membrana amniótica aplicada na

33 32 forma de patch estimula a cicatrização e inibe a atividade de proteases. O grupo de animais no qual foi feita apenas a injúria ocular demonstrou maior quantidade de células polimorfonucleares e atividade de proteases muito maior que os grupos que receberam patch de membrana amniótica. Provavelmente, os efeitos terapêuticos da membrana amniótica sejam conseqüência de inibição da infiltração de células polimorfonucleares e da atividade de proteases. Muitos dos trabalhos científicos foram realizados utilizando o coelho como modelo experimental (AVILA et al., 2001; HE et al., 1999; KIM; TSENG, 1995; KIM et al., 2000; KIM et al., 2001; MARINHO et al., 2003; NAKAMURA et al., 2003; NAKAMURA et al., 2004; TI et al., 2002; WANG et al., 2001; WOO et al., 2001). A córnea do coelho possui diâmetro horizontal de 15mm e vertical de 13,5-14mm, sendo um pouco ovalada. A espessura é de apenas 0,4mm em média, com a camada epitelial perfazendo µm, a estromal no mínimo 0,24 mm (90% da espessura total), a membrana de Descemet 7-8 µm e o endotélio 3-5 µm. A presença da camada de Bowman é questionável nessa espécie, sendo mais aceita como inexistente, pois não é evidente à microscopia eletrônica como a observada no homem. Após a remoção do epitélio corneal, sua regeneração é processada rapidamente e só cessa quando a espessura da camada atinge aproximadamente 200% da espessura original, o que se completa em cerca de 24 horas após o trauma. Após 1-4 dias, a camada epitelial recupera sua espessura original (PRINCE, 1964). Contudo, como mencionado anteriormente, muitas das pesquisas realizadas podem ter conferido resultados distorcidos devido à utilização de membrana amniótica xenógena, fato que contribuiu para a investigação comparativa dos efeitos dos enxertos de membranas amnióticas humana e de coelha em córnea de coelhos.

34 33 3 MATERIAL E MÉTODO Para a realização do projeto, foram utilizados coelhos albinos da raça Nova Zelândia como modelo experimental. Esses animais foram divididos em 2 grupos para serem submetidos à ceratoplastia lamelar utilizando membrana amniótica de origem humana e de coelha. Realizaram-se avaliações clínicas durante os períodos de evolução e microscópicas pós-morten. 3.1 Animais Foram utilizados 32 coelhos, raça Nova Zelândia, adultos jovens, com peso médio de 1,5-2,0 kg, obtidos de criatório particular, de acordo com as normas da ARVO (Association for Research in Vision and Ophthalmology) para a realização de pesquisa com experimentação em animais. Foi eliminada qualquer possibilidade de alterações sistêmicas que pudessem comprometer o desenvolvimento do experimento, bem como quaisquer alterações oculares, por meio de exame clínico e oftalmológico que consistiu em exame biomicroscópico com lâmpada de fenda, teste de fluoresceína, tonometria por aplanação e fundoscopia direta e indireta. 3.2 Grupos experimentais Para a avaliação de cada membrana foram utilizados 16 animais divididos em grupos de 4 animais cada, que tiveram períodos de observação distintos de 2, 7, 15 e 30 dias. Convencionou-se chamar o grupo da membrana amniótica humana de gupo I MAH e o da membrana amniótica de coelha de grupo II MAC (Quadro 1).

35 34 Grupo I MAH - Membrana Amniótica Humana EVOLUÇÃO COELHO 2 DIAS 2 2 DIAS 30 2 DIAS 31 2 DIAS 32 7 DIAS 1 7 DIAS 3 7 DIAS 11 7 DIAS DIAS 5 15 DIAS 8 15 DIAS DIAS DIAS 4 30 DIAS 9 30 DIAS DIAS 13 EVOLUÇÃO COELHO 2 DIAS 21 2 DIAS 22 2 DIAS 23 2 DIAS 25 7 DIAS 16 7 DIAS 19 7 DIAS 20 7 DIAS DIAS 6 15 DIAS 7 15 DIAS DIAS DIAS DIAS DIAS DIAS 29 G II MAC - Membrana Amniótica de Coelha Quadro 1 - Constituintes dos grupos experimentais GI MAH (membrana amniótica humana) e GII MAC (membrana amniótica de coelha), São Paulo, 2005

36 Obtenção da membrana amniótica As membranas amnióticas humanas foram obtidas por doação feita pelo Laboratório de Doenças Externas Oculares do setor de Patologias Externas e Córnea, do Departamento de Oftalmologia da UNIFESP. As placentas humanas foram obtidas de operação cesariana e lavadas com solução fisiológica 0,9% em ambiente estéril. A membrana amniótica foi separada do restante dos envoltórios fetais, por meio de dissecação romba e foi estendida sobre papel filtro de nitrocelulose estéril (Micropore, Bedfort, MA, EUA) com a face epitelial para cima. A membrana amniótica e o filtro foram lavados com solução tampão fosfato contendo 1000U/ml de penicilina, 20µg/ml de estreptomicina e 2,5µg/ml de anfotericina B. Fragmentos de aproximadamente 5cmX5cm foram cortados e colocados em recipiente estéril contendo glicerol (Baxter Healthcare corporation, Stone Mountain, GA, EUA) e meio de preservação de córnea (Ophthalmos, São Paulo, SP, Brasil), na proporção 1:1 e congelados a -80ºC (GOMES et al., 1999). A placenta de coelha foi obtida após ovariosalpingohisterectomia de coelha com 28 dias de gestação. Após a separação da membrana amniótica dos outros envoltórios, seguiu-se o mesmo protocolo de preparação utilizado para a membrana amniótica humana, excetuandose o recorte dos fragmentos que foi de 3cmX3cm. 3.4 Procedimento cirúrgico Após jejum alimentar de 2 horas, foi feita pré-medicação anestésica com acepromazina - 0,4mg/kg associada a meperidina 10mg/kg via intramuscular. Nesse mesmo

37 36 momento, instilou-se colírio anestésico à base de cloridrato de proparacaína. Após 15 minutos, realizou-se a indução com a associação de ketamina 10mg/kg com midazolan 0,3 mg/kg por via intravenosa. A manutenção foi feita com ketamina 5-10mg/kg por via intravenosa, com reaplicações quando necessário. Foi mantida infusão intravenosa de solução ringer lactato. Foi administrado flumixin meglumine 1mg/kg por via intravenosa, na veia da orelha. Com o animal anestesiado, procederam-se a antissepsia, a colocação dos campos operatórios e a blefarostase. Convencionou-se realizar a cirurgia apenas no olho direito, evitando maiores desconfortos para o animal. Devido a insucesso da cirurgia no olho direito do coelho nº 26, realizou-se cirurgia no olho esquerdo desse animal. 3.5 Ceratoplastia Sob aumento de 10x do microscópio cirúrgico, produziu-se inicialmente uma ceratectomia com o auxílio de trépano de Castroviejo 5 mm de diâmetro, de forma semipenetrante em região temporal superior, com profundidade de 0,1mm, que serviu de leito para o implante do fragmento da membrana amniótica humana ou de coelha. O recorte da membrana amniótica humana foi feito com trépano de 5mm, e a de coelha com trépano de 6mm, devido às diferenças de elasticidade das duas membranas e para permitir um perfeito posicionamento. A fixação do enxerto foi efetuada com ponto contínuo, utilizando-se fio de mononylon 10-0 encastoado de fábrica. No período pós-operatório, os animais foram mantidos em gaiolas individuais. Colírio de tobramicina foi instilado 3 vezes ao dia na primeira quinzena. Não houve a necessidade de colar elizabetano.

38 Avaliação macroscópica Os animais foram avaliados com o auxílio de biomicroscópio com lâmpada de fenda portátil a intervalos de 24 horas na primeira semana e posteriormente, a cada 3 dias até serem eutanasiados de acordo com os períodos de evolução. Na avaliação diária, foram observados sinais de fotofobia, blefarospasmo, secreção ocular (presença e tipo), edema, hiperemia conjuntival, neovascularização, permanência e viabilidade do enxerto. As alterações foram designadas por valores de graduação subjetivos (0) ausente; +(1): discreto; ++(2): moderado; +++(3): intenso). 3.7 Avaliação microscópica Após o término dos períodos pré-estabelecidos, os animais foram submetidos à eutanásia, com anestesia profunda com tiopental sódico e parada cardiorrespiratória provocada por injeção intravenosa de cloreto de potássio 19,1%. A seguir, procedeu-se a trepanação da córnea contendo região de transição esclero-corneal (Figura 1), fixando-a em glutaraldeído 2% tamponado. O material foi mantido sob refrigeração a 4ºC até a confecção das lâminas. O material fixado foi processado para avaliação em microscopia óptica (HE, método de picrosirius e coloração com alcian blue). Nos cortes corados com hematoxilina-eosina, além da análise descritiva dos fenômenos decorrentes da enxertia, realizou-se a contagem das células inflamatórias que invadiram o estroma (CHOI et al., 1998), e vasos presentes no estroma corneano com o auxílio do programa Image Pro Plus acoplado a Microscópio óptico Nikon E-800. A área de

39 38 enxertia foi dividida em pequenas áreas (35401,2µ cada área) e cinco dessas pequenas áreas (177006µ a área total), distribuídas ao longo do local do enxerto, foram examinadas sob aumento de 20x. Padronizou-se descartar as áreas referentes aos pontos de sutura. O método de picrosirius permitiu, sob luz polarizada, a demonstração do colágeno presente (DAGLI et al., 1998; SIEVERT et al., 1998). Sugere-se que as fibras espessas de tonalidade laranja avermelhada visibilizadas por esse método sejam colágeno tipo I, enquanto que as menos espessas de tonalidade esverdeada sejam colágeno tipo III (MASSIRONI et al., 2005). O método de coloração utilizando Alcian blue cora glicosaminoglicanos ácidos em azul (MASSIRONI et al., 2005) permitindo demonstrar a distribuição e caracterização das proteoglicanas (TAWARA et al., 1996). Amarelo: esclera Azul: limbo (junção esclero-corneal) Verde: tecido implantado Vermelho: corte Figura 1 - Representação esquemática do material para o estudo histopatológico 3.8 Análise estatística Os valores obtidos na contagem de células inflamatórias e vasos presentes nos cortes histológicos dos diferentes animais foram submetidos ao teste para amostras não paramétricas de Mann-Whitney. Se p 0,05 foi encontrado, os resultados foram considerados significativos.

40 39 4 RESULTADOS Os resultados do projeto foram obtidos por avaliações macroscópica e microscópicas e foram submetidos a análise estatística descritas a seguir. 4.1 Avaliação macroscópica Todos os animais do grupo I MAH permaneceram isentos de desconforto ocular durante todo o período de evolução, enquanto que no grupo II MAC, os coelhos 28 e 29 apresentaram blefarospasmo leve aos 15 dias de evolução, porém ausente aos 30 dias. O coelho 27, por sua vez, apresentou blefarospasmo nos últimos dias de evolução, estando evidente no momento de sua eutanásia (Quadros 2A e 2B e Gráficos 1 e 2). Quanto à secreção, no grupo I MAH os coelhos 2 e 4 apresentaram secreção mucosa moderada, nas primeiras horas do experimento. No grupo II MAC, os coelhos 26 e 27 apresentaram secreção discreta aos 15 dias, a qual evoluiu para intensa aos 30 dias. No coelho 28, observou-se discreta secreção mucosa aos 15 e aos 30 dias (Quadros 3A e 3B e Gráficos 3 e 4). A hiperemia foi evidente logo nos primeiros dias apenas nos coelhos 2 e 4 do grupo I MAH, em grau moderado. Os coelhos 6,7, 23 e 25 do grupo II MAC apresentaram grau leve nos primeiros dias, com remissão completa logo em seguida. O coelho 27 apresentou grau moderado de hiperemia aos 30 dias de evolução (Quadros 4A e 4B e Gráficos 5 e 6). O grau de opacidade se manteve praticamente inalterado, considerado leve em todos os animais do grupo II MAC, durante todos os períodos experimentais. No grupo I MAH, a maioria dos animais apresentou grau leve de opacidade com exceção de 5 animais(1,3,4,5,11)

41 40 aos 7 dias, 3(9,10,13) aos 15 dias e 1(9) aos 30 dias, com grau moderado. Apenas 1 animal apresentou opacidade mais intensa, o coelho 13 do grupo I MAH, aos 30 dias de evolução(quadros 5A e 5B e Gráficos 7 e 8). A formação de vasos na córnea, para os grupos I MAH e II MAC, progrediu de acordo com a evolução do experimento, sendo discreta aos 15 dias e exuberante aos 30 dias. Os animais do grupo II MAC não exibiram neovasos nos primeiros dias de pós-operatório (Quadros 6A e 6B e Gráficos 9 e 10).

42 41 EVOLUÇÃO 2 DIAS 7 DIAS 15 DIAS 30 DIAS ANIMAIS Ausente 1 - Discreto 2 - Moderado 3 - Intenso Quadro 2A - Demonstrativo do grau de fotofobia/blefarospasmo de coelhos submetidos a ceratoplastia lamelar com enxerto de membrana amniótica humana. São Paulo, SP, EVOLUÇÃO 2 DIAS 7 DIAS 15 DIAS 30 DIAS ANIMAIS Ausente 1 - Discreto 2 - Moderado 3 - Intenso Quadro 2B - Demonstrativo do grau de fotofobia/blefarospasmo de coelhos submetidos a ceratoplastia lamelar com enxerto de membrana amniótica de coelha. São Paulo, SP, 2005.

43 42 blefarospasmo MAH evolução 2 dias 7 dias 15 dias 30 dias Gráfico 1 - Representação gráfica do fenômeno fotofobia/blefarospasmo de coelhos submetidos a ceratoplastia lamelar com enxerto de membrana amniótica humana. São Paulo, SP, 2005 blefarospasmo MAC evolução 2 dias 7 dias 15 dias 30 dias Gráfico 2 - Representação gráfica do fenômeno fotofobia/blefarospasmo de coelhos submetidos a ceratoplastia lamelar com enxerto de membrana amniótica de coelha. São Paulo, SP, 2005

44 43 EVOLUÇÃO 2 DIAS 7 DIAS 15 DIAS 30 DIAS ANIMAIS Ausente 1 - Discreto 2 - Moderado 3 - Intenso Quadro 3A - Demonstrativo do grau de secreção de coelhos submetidos a ceratoplastia lamelar com enxerto de membrana amniótica humana. São Paulo. SP, EVOLUÇÃO 2 DIAS 7 DIAS 15 DIAS 30 DIAS ANIMAIS Ausente 1 - Discreto 2 - Moderado 3 - Intenso Quadro 3B - Demonstrativo do grau de secreção de coelhos submetidos a ceratoplastia lamelar com enxerto de membrana amniótica de coelha. São Paulo. SP, 2005.

45 44 secreção MAH 1,5 1 0,5 0 evolução 2 dias 7 dias 15 dias 30 dias Gráfico 3 - Representação gráfica do fenômeno secreção ocular de coelhos submetidos a ceratoplastia lamelar com enxerto de membrana amniótica humana. São Paulo, SP, 2005 secreção MAC 2 1,5 1 0,5 0 evolução 2 dias 7 dias 15 dias 30 dias Gráfico 4 - Representação gráfica do fenômeno secreção ocular de coelhos submetidos a ceratoplastia lamelar com enxerto de membrana amniótica de coelha. São Paulo, SP, 2005

46 45 EVOLUÇÃO 2 DIAS 7 DIAS 15 DIAS 30 DIAS ANIMAIS Ausente 1 - Discreto 2 - Moderado 3 - Intenso Quadro 4A - Demonstrativo do grau de hiperemia conjuntival de coelhos submetidos a ceratoplastia lamelar com enxerto de membrana amniótica humana. São Paulo, SP, 2005 EVOLUÇÃO 2 DIAS 7 DIAS 15 DIAS 30 DIAS ANIMAIS Ausente 1 - Discreto 2 - Moderado 3 - Intenso Quadro 4B - Demonstrativo do grau de hiperemia conjuntival de coelhos submetidos a ceratoplastia lamelar com enxerto de membrana amniótica de coelha. São Paulo, SP, 2005

47 46 hiperemia MAH evolução 2 dias 7 dias 15 dias 30 dias Gráfico 5 - Representação gráfica do fenômeno hiperemia ocular de coelhos submetidos a ceratoplastia lamelar com enxerto de membrana amniótica humana. São Paulo, SP, 2005 hiperemia MAC evolução 2 dias 7 dias 15 dias 30 dias Gráfico 6 - Representação gráfica do fenômeno hiperemia ocular de coelhos submetidos a ceratoplastia lamelar com enxerto de membrana amniótica de coelha. São Paulo, SP, 2005

48 47 EVOLUÇÃO 2 DIAS 7 DIAS 15 DAS 30 DIAS ANIMAIS Ausente 1 - Discreto 2 - Moderado 3 - Intenso EVOLUÇÃO 2 DIAS 7 DIAS 15 DIAS 30 DIAS ANIMAIS Ausente 1 - Discreto 2 - Moderado 3 - Intenso Quadro 5A - Demonstrativo do grau de opacidade em córnea de coelhos submetidos a ceratoplastia lamelar com enxerto de membrana amniótica humana. São Paulo, SP, 2005 Quadro 5B - Demonstrativo do grau de opacidade em córnea de coelhos submetidos a ceratoplastia lamelar com enxerto de membrana amniótica de coelha. São Paulo, SP, 2005

49 48 opacidade MAH 2 1,5 1 0,5 0 evolução 2 dias 7 dias 15 dias 30 dias Gráfico 7 - Representação gráfica do fenômeno opacidade em córnea de coelhos submetidos a ceratoplastia lamelar com enxerto de membrana amniótica humana. São Paulo, SP, opacidade MAC evolução 2 dias 7 dias 15 dias 30 dias Gráfico 8 - Representação gráfica do fenômeno opacidade em córnea de coelhos submetidos a ceratoplastia lamelar com enxerto de membrana amniótica de coelha. São Paulo, SP, 2005.

50 49 EVOLUÇÃO 2 DIAS 7 DIAS 15 DIAS 30 DIAS ANIMAIS Ausente 1 - Discreto 2 - Moderado 3 - Intenso Quadro 6A - Demonstrativo do grau de neovascularização em córnea de coelhos submetidos a ceratoplastia lamelar com enxerto de membrana amniótica humana. São Paulo, SP, 2005 EVOLUÇÃO 2 DIAS 7 DIAS 15 DIAS 30 DIAS ANIMAIS Ausente 1 - Discreto 2 - Moderado 3 - Intenso Quadro 6B - Demonstrativo do grau de neovascularização em córnea de coelhos submetidos a ceratoplastia lamelar com enxerto de membrana amniótica de coelha. São Paulo, SP, 2005

51 50 neovascularização MAH evolução 2 dias 7 dias 15 dias 30 dias Gráfico 9 - Representação gráfica do fenômeno neovascularização em córnea de coelhos submetidos a ceratoplastia lamelar com enxerto de membrana amniótica humana. São Paulo, SP, 2005 neovascularização MAC evolução 2 dias 7 dias 15 dias 30 dias Gráfico 10 - Representação gráfica do fenômeno neovascularização em córnea de coelhos submetidos a ceratoplastia lamelar com enxerto de membrana amniótica de coelha. São Paulo, SP, 2005

52 51 CÓRION FETO ENVOLTO POR LÍQ.AMNIÓTICO E MEMB. AMNIÓTICA Figura 2 - Feto de coelho com 28 dias de gestação, envolto por líquido amniótico, membrana amniótica. O córion está separado acima Figura 3 - Membrana Amniótica em destaque MEMB.AMNIÓTICA

53 52 Figura 4 - Fotografia correspondente a 2 dias de evolução de implante de membrana amniótica humana. Observa-se bom posicionamento do enxerto no leito corneal. Pequena quantidade secreção mucosa aderida ao nó Figura 5 - Fotografia correspondente a 2 dias de evolução de implante de membrana amniótica de coelha. Bom posicionamento do enxerto no leito corneal Figura 6 - Fotografia correspondente a 7 dias de evolução de implante de membrana amniótica humana. Observa-se opacidade evidente na região do implante. Sutura presente Figura 7 - Fotografia correspondente a 7 dias de evolução de implante de membrana amniótica de coelha. Observam-se neovasos invadindo a área do implante. Sutura começando a se desprender na região ventral

54 53 Figura 8- Fotografia correspondente a 15 dias de evolução de implante de membrana amniótica humana. Observa-se pequena quantidade de neovasos invadindo área de enxertia. Sutura frouxa Figura 9- Fotografia correspondente a 15 dias de evolução de implante de membrana amniótica de coelha. Observam-se poucos neovasos invadindo a érea de enxertia. Sutura frouxa Figura 10 - Fotografia correspondente a 30 dias de evolução de implante de membrana amniótica humana. Área mais opaca e levemente irregular onde foi realizada a ceratoplastia, com a presença de neovasos. Ausência do fio de sutura Figura 11 - Fotografia correspondente a 30 dias de evolução de implante de membrana amniótica de coelha. Área mis opaca e levemente irregular onde foi realizada a ceratoplastia, com a presença de neovasos. Fio de sutura preso apenas na região dorsal do enxerto

55 Avaliação microscópica A representação dos resultados obtidos da observação histológica da área do implante foi feita de forma descritiva, obedecendo à ordem crescente de cada etapa experimental. Aos dois dias de implante, em ambos os grupos, foi possível observar o tecido implantado, caracterizado por matriz extracelular amorfa, acidófila, abundante. Imediatamente abaixo, observou-se migração e invasão de células inflamatórias junto ao tecido de implante (Figura 12). Logo acima do tecido implantado, observou-se camada única ou dupla de epitélio plano (Figura 12C). No corte histológico representativo do animal 23 do grupo II MAC, uma camada mais evidente de células epiteliais foi notada entremeando o tecido implantado. (Figura 12F) No período de 7 dias, o tecido implantado apresentava-se integrado ao tecido autóctone, o qual exibia remanescentes que eram ainda evidenciados por áreas de material amorfo e acidófilo (seta). Toda a superfície encontrava-se epitelizada com epitélio plano estratificado. Havia numerosos elementos celulares infiltrando a área do implante (Figura 13). Com a objetiva de maior aumento, observou-se no tecido implantado células com morfologia de fibroblastos, denotando proliferação desses elementos sobre o substrato que era representado pelo tecido implantado. (Figura 13C e 13F) Aos 15 dias de evolução, no corte histológico representativo do grupo I MAH, notouse a presença da membrana amniótica totalmente integrada, caracterizada por áreas de material amorfo acidófilo, apresentando descontinuidade em sua extensão. A superfície corneal apresentava-se completamente epitelizada com epitélio do tipo pavimentoso estratificado. Nas áreas subjacentes ao enxerto, observaram-se muitos elementos celulares de

56 55 natureza inflamatória, bem como células com morfologia de fibroblastos. Na periferia do corte, visibilizou-se imagem negativa do ponto de sutura circundado por intenso infiltrado inflamatório (Figura 14A, 14B, 14C). No corte representativo do grupo II MAC, não se observou a membrana com a mesma definição observada no representante do grupo I MAH. Constatou-se uma faixa delgada de material amorfo acelular imediatamente abaixo da camada epitelial, o que sugeria ser resquícios da membrana amniótica utilizada como enxerto. O epitélio foi caracterizado por tipo pavimentoso estratificado e no estroma subjacente à área de implante, notaram-se numerosas células inflamatórias e outras com morfologia de fibroblastos. Na periferia do corte, pôde-se notar imagem negativa do ponto de sutura com moderado infiltrado inflamatório circunjacente (Figura 14D, 14E, 14F). Aos 30 dias de evolução, em ambos os grupos, observou-se a membrana amniótica integrada e bem definida, sob epitélio pavimentoso estratificado (Figura 15). No corte histológico representativo do grupo I MAH, observou-se intenso infiltrado de células inflamatórias no estroma subjacente à área de enxertia (Figura 15A, 15B, 15C). No corte histológico do grupo II MAC, observaram-se resquícios da membrana amniótica, com células com morfologia de fibroblastos e moderado infiltrado inflamatório no estroma, tanto acima, quanto abaixo do tecido implantado. Na periferia do corte, observou-se infiltrado inflamatório intenso correspondente ao ponto de sutura (Figura 15D, 15E, 15F). Os cortes avaliados sob luz polarizada corados com picrosírius, demonstraram a membrana amniótica em tonalidade alaranjada, avermelhada, o que pode sugerir presença de colágeno tipo I (Figura 16). Nos cortes histológicos corados com Alcian blue, observou-se a membrana amniótica na tonalidade rosada e áreas onde o colágeno provavelmente estava se remodelando

57 56 impregnadas pelo corante azul, sugerindo a presença de glicosaminoglicanas ácidas nesses locais (Figura 17). A contagem de células inflamatórias e vasos presentes no estroma adjacente à área de enxertia realizada com o auxílio do programa Image-Pro Plus acoplado ao microscópio óptico Nikon E-800, revelou uma variação tanto individual quanto entre os grupos I e II (Quadro 7 e Gráficos 11-14). No grupo I MAH, observou-se uma contagem mais expressiva em relação ao grupo II MAC. A presença da membrana amniótica foi observada em 11 dos 15 animais do grupo I MAH e em 11 dos 16 animais do grupo II MAC (Quadros 8 e 9). A espessura do tecido integrado ao estroma era evidentemente maior nos representantes do grupo I MAH. 4.3 Análise estatística Os valores obtidos na contagem de células inflamatórias e vasos presentes nos cortes histológicos dos diferentes animais (Quadro 7) foram submetidos ao teste não paramétrico de Mann-Whitney. Em relação às células inflamatórias, a comparação entre os animais do subgrupo 2 dias com os de 7 dias, do subgrupo 7 dias com os de 15 dias e os do subgrupo 15 dias com os de 30 dias de cada grupo separadamente, não apresentou diferença significativa, isto é Z<2 e p> 0,05. Ainda em relação às células inflamatórias, fazendo-se a comparação entre os grupos I MAH e II MAC, com 2 dias e 7 dias não houve diferença estatística significativa (Z<2 e p> 0,05). Porém, a diferença foi significativa ao se compararem grupos I MAH e MAC com 15 e com 30 dias de evolução (Z= 2,02 e p= 0,043 (<0,05)).

58 57 A contagem do número de vasos observados nos dois grupos demonstrou diferença significativa entre os dois grupos nos períodos de evolução de 15 e de 30 dias (p<0,05). No grupo I MAH, houve ainda diferença significativa intra-grupo dos animais com período de evolução de 30 dias quando comparado com os demais períodos de evolução para vasos na córnea. No grupo II MAC, a comparação entre os animais com períodos de evolução diferentes dentro do mesmo grupo não demonstrou diferença significativa.

59 58 MAH CEL INF VASOS MAC CEL INF VASOS 2 DIAS DIAS DIAS DIAS DIAS DIAS DIAS DIAS DIAS DIAS DIAS DIAS DIAS DIAS DIAS 14* DIAS DIAS DIAS DIAS DIAS DIAS DIAS DIAS DIAS DIAS DIAS DIAS DIAS DIAS DIAS DIAS DIAS * lâmina perdida Quadro 7 - Contagem do número de células inflamatórias e de vasos em µ de área total por lâmina, segundo período de evolução de cada grupo experimental. São Paulo, SP, 2005

60 59 CÉLULAS INFLAMATÓRIAS - MAH QTE CÉL DIAS 7 DIAS 15 DIAS 30 DIAS GRUPOS Gráfico 11 - Representação gráfica da contagem de células inflamatórias em amostras representativas de córneas de coelhos submetidos a ceratoplastia lamelar com enxerto de membrana amniótica humana. São Paulo, SP, 2005 CÉLULAS INFLAMATÓRIAS - MAC QTE CÉL DIAS 7 DIAS 15 DIAS 30 DIAS GRUPOS

61 60 Gráfico 12 - Representação gráfica da contagem de células inflamatórias em amostras representativas de córneas de coelhos submetidos a ceratoplastia lamelar com enxerto de membrana amniótica de coelha. São Paulo, SP, 2005 NEOVASOS - MAH QTE VASOS DIAS 7 DIAS 15 DIAS 30 DIAS GRUPOS Gráfico 13 - Representação gráfica da contagem de vasos em amostras representativas de córneas de coelhos submetidos a ceratoplastia lamelar com enxerto de membrana amniótica humana. São Paulo, SP, 2005

62 61 NEOVASOS - MAC 4,5 4 3,5 3 QTE VASOS 2,5 2 1,5 1 0,5 0 2 DIAS 7 DIAS 15 DIAS 30 DIAS GRUPOS Gráfico 14 - Representação gráfica da contagem de vasos em amostras representativas de córneas de coelhos submetidos a ceratoplastia lamelar com enxerto de membrana amniótica de coelha. São Paulo, SP, 2005 MAH ANIMAIS PRESENÇA MAH 2 DIAS 2 SIM 2 DIAS 30 SIM 2 DIAS 31 SIM 2 DIAS 32 SIM 7 DIAS 1 NÃO 7 DIAS 3 SIM 7 DIAS 11 SIM 7 DIAS 14* DIAS 5 NÃO 15 DIAS 8 SIM 15 DIAS 12 SIM 15 DIAS 15 SIM 30 DIAS 4 SIM 30 DIAS 9 NÃO 30 DIAS 10 NÃO 30 DIAS 13 SIM * lâmina perdida acordo com o período de evolução. São Paulo, SP, 2005 Quadro 8 - Presença da membrana amniótica humana de

63 62 MAC ANIMAIS PRESENÇA MAC 2 DIAS 21 SIM 2 DIAS 22 SIM 2 DIAS 23 SIM 2 DIAS 25 SIM 7 DIAS 16 SIM 7 DIAS 19 SIM 7 DIAS 20 SIM 7 DIAS 24 SIM 15 DIAS 6 NÃO 15 DIAS 7 NÃO 15 DIAS 17 SIM 15 DIAS 18 NÃO 30 DIAS 26 SIM 30 DIAS 27 NÃO 30 DIAS 28 SIM 30 DIAS 29 NÃO Quadro 9 - Presença da amniótica de acordo com o evolução. São 2005 membrana coelha de período de Paulo, SP, Figura legenda legendana napágina página64 63 C

64 63 Legenda Figura 12 A - Fotomicrografia de corte histológico da área do implante de membrana amniótica humana do animal n. 31, aos 2 dias de evolução, mostrando imagem negativa do ponto de sutura, deslizamento epitelial sobre o tecido implantado. Coloração: Hematoxilina-eosina. Aumento 4X. B- Detalhe em maior aumento da fotomicrografia anterior evidenciando invasão de células inflamatórias na região do implante. Coloração HE. Aumento 10X. C - Fotomicrografia destacando o tecido implantado (seta ) do animal n.30 aos dois dias de evolução, com recobrimento de monocamada de epitélio. Coloração: HE. Aumento 20X. D- Fotomicrografia de corte histológico da área de implante de membrana amniótica de coelha do animal n.23, aos dois dias de evolução, mostrando o tecido implantado caracterizado por material amorfo e acidófilo. Coloração: HE. Aumento 4X. E - Detalhe em maior aumento mostrando recobrimento epitelial. Aumento: 10X. F- Em maior aumento, nota-se tecido epitelial recobrindo e entremeando o tecido implantado destacado pelas setas ( )e células inflamatórias invadindo a área do enxerto. Coloração: HE. aumento 20X.

65 64 Legenda Figura13 A - Fotomicrografia de corte histológico da área de implante de membrana amniótica humana aos 7 dias de evolução do animal n.1 mostrando imagem negativa do ponto de sutura e regeneração de toda extensão da área de enxertia por epitélio plano estratificado. Coloração: HE. Aumento 4X. B - Detalhe em maior aumento da fotomicrografia anterior onde se observa área de tecido implantado (seta ) integrado ao estroma autóctone. Coloração HE. aumento: 10X. C - Fotomicrografia da área de enxertia do animal n.3 aos 7 dias de evolução, evidenciando a presença da membrana amniótica humana ainda íntegra (seta ), caracterizada por material amorfo e acidófilo e presença de células com morfologia de fibroblastos. Coloração: HE. Aumento 20X. D - Fotomicrografia de corte histológico da área de implante de membrana amniótica de coelha do animal n.19, delimitada pelas imagens negativas dos pontos de sutura nas margens e regeneração epitelial. Coloração: HE. Aumento 4X. E - Detalhe em maior aumento da fotomicrografia anterior, destacando resquícios da membrana amniótica (seta ), numerosas células inflamatórias e outras com morfologia de fibroblastos no estroma subjacente. Coloração: HE. Aumento 10X. F - Detalhe em maior aumento de remanescente da membrana amniótica de coelha mostrado na fotomicrografia anterior. Coloração: HE. Aumento 20X.

66 65 A B D C E F Figura 14 - legenda na página 66 A B D E Figura 15 - legenda na página 67 C F

67 66 Legenda Figura14 A - Fotomicrografia de corte histológico da área do implante com membrana amniótica humana do animal n.12 aos15 dias de evolução, mostrando tecido implantado perfeitamente integrado ao tecido autóctone com regeneração epitelial. Imagem negativa do ponto com intenso infiltrado inflamatório circunjacente. Coloração: HE. Aumento 4X. B - Detalhe em maior aumento da fotomicrografia anterior mostrando a membrana amniótica humana fragmentada (seta ) e estroma adjacente sendo remodelado com inúmeras células com morfologia de fibroblastos e células inflamatórias. Coloração: HE. Aumento 10X. C - Detalhe em maior aumento da fotomicrografia anterior destacando o fragmento da membrana amniótica humana (seta ) abaixo do epitélio pavimentoso estratificado. Coloração: HE. Aumento 20X. D - Fotomicrografia de corte histológico da área de implante de membrana amniótica de coelha do animal n. 7 aos 15 dias de evolução, mostrando epitélio regenerado, imagem negativa do ponto com infiltrado inflamatório circunjacente e células inflamatórias em estroma. Coloração: HE. Aumento 4X. E - Detalhe em maior aumento da fotomicrografia anterior, mostrando delgada faixa de material amorfo e acelular (membrana amniótica) logo abaixo do epitélio (seta ). Coloração HE. Aumento 10X. F - Detalhe em maior aumento da fotomicrografia anterior destacando a membrana amniótica (seta ) abaixo do epitélio. Coloração: HE. Aumento 20X.

68 67 Legenda Figura15 A - Fotomicrografia de corte histológico da área de implante de membrana amniótica humana aos 30 dias de evolução mostrando a membrana amniótica íntegra abaixo do epitélio pavimentoso estratificado e intenso infiltrado inflamatório no estroma subjacente. Coloração: HE. Aumento 4X. B - Detalhe em maior aumento da fotomicrografia anterior destacando intenso infiltrado inflamatório. Coloração: HE. Aumento 10X. C - Detalhe em maior aumento da fotomicrografia anterior, evidenciando infiltrado inflamatório misto, composto por mononucleares e neutrófilos, no estroma subjacente à membrana amniótica humana (seta ). Coloração: HE. Aumento 20X. D - Fotomicrografia de corte histológico da área de implante de membrana amniótica de coelha do animal n.28 aos 30 dias de evolução, mostrando resquícios de material amorfo correspondente à membrana amniótica implantada. Intenso infiltrado inflamatório na periferia do corte relativo à presença do ponto de sutura. Coloração: HE. Aumento 4X. E - Detalhe em maior aumento da fotomicrografia anterior, destacando fragmento da membrana amniótica de coelha (seta ) e estroma adjacente repleto de células com morfologia de fibroblastos e células inflamatórias. Coloração: HE. Aumento 10X. F - Detalhe em maior aumento da fotomicrografia anterior, mostrando detalhes do fragmento da membrana amniótica de coelha (seta ) e estroma sendo remodelado. Coloração: HE. Aumento 20X.

69 68 Figura 16- legenda na página 69 A Figura 17 - legenda na página 69 B C