SÍNTESE E CARACTERIZAÇÃO DO POLI (ÁCIDO GLICÓLICO) E AVALIAÇÃO IN VITRO EM CULTURA DE CÉLULAS ODONTOBLÁSTICAS

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1 SÍNTESE E CARACTERIZAÇÃO DO POLI (ÁCIDO GLICÓLICO) E AVALIAÇÃO IN VITRO EM CULTURA DE CÉLULAS ODONTOBLÁSTICAS Fernanda J. de Siqueira 1*, Emanuelli L. Cabral 1, Vanusca D. Jahno 1, Hernane Barud, Karina F. Bombonato- Prado 3, Rosane Ligabue 1, Sandra Einloft 1. 1 Faculdade de Química, Pontifícia Universidade do Rio Grande do Sul, PUCRS, Porto Alegre, RS - fejukoski@hotmail.com Faculdade de Química, Universidade Estadual Paulista de Araraquara,UNESP,SP. 3 Faculdade de Odontologia, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, USP,SP Nos últimos anos vem crescendo a utilização de biomateriais, entre eles podemos citar o poli (ácido glicólico) que tem sido utilizado para diversas aplicações. Neste trabalho, estudamos a síntese e caracterização do poli (ácido glicólico) através da análise de Infravermelho, Calorimetria Diferencial de Varredura e Análise termogravimétrica e foi avaliada a sua citotoxicidade in vitro em cultura de células-tronco de linhagem odontoblástica de camundongos (MDPC 3). Pelas análises de caracterização estrutural e térmicas foi possível confirmar a polimerização do ácido glicólico e o estudo in vitro mostrou que o poli (ácido glicólico) possui viabilidade celular. Palavras-chave: Biomateriais, PGA, Síntese, Citotoxicidade Synthesis and characterization of poly (glycolic acid) and in vitro evaluation in cell culture odontoblastics In recent years the growing use of biomaterials, among them we mention the poly (glycolic acid) that has been used for various applications. In this work, we studied the synthesis and characterization of poly (glycolic acid) through the analysis of IR, differential scanning calorimetry and thermogravimetric analysis and their cytotoxicity was evaluated in vitro in cell culture of stem odontoblastics strain of mice (MDPC - 3 ). For the analysis of structural and thermal characterization was possible to confirm the polymerization of glycolic acid and in vitro study showed that the poly (glycolic acid) has cell viability. Keywords: Biomaterial, PGA, Synthesis, Citotoxicity Introdução Em 008, o mercado mundial de biomateriais foi estimado em 11,9 bilhões de dólares, além disso, tal mercado apresenta uma taxa de crescimento de 11% ao ano. Com a grande procura por biomateriais na área medica e odontológica e o aumento da longevidade das pessoas, torna-se cada vez mais importante o desenvolvimento de novos materiais e testes para avaliação de sua biocompatibilidade [1-3]. Uma definição clássica de biomaterial diz que é parte de um sistema que trata, aumenta ou substitui qualquer tecido, órgão ou função do corpo [4]. Esta definição deriva do Concensus Conference of the European Society for Biomaterials, que descreve biomaterial como todo material não vivo usado em dispositivo médico, objetivando interação com o sistema biológico [5]. A classificação de biomateriais é descrito no esquema abaixo, na Figura 1.

2 Biomateriais Biológicos ou naturais Artificiais Autógenos ou Antólogos Homógenos ou homólogos ou alógenos Heterógenos ou heterólogos ou xenógeno Biomimético Sintéticos Naturais poliméricos Compósitos Naturais cerâmicos Biodegradáveis/ bioabsorvíveis Bioativos Bioinertes Biotoleráveis Polímeros Cerâmicas Cerâmicas Metais Cerâmicos Polímeros Polimeros Figura 1. Classificação dos materiais de acordo com sua origem. Fonte: adaptado de CAMILO et al., 006 [6]. Faz-se necessária a diferenciação entre biomaterial e biocompatibilidade. Em 1987 o termo biocompatibilidade foi redefinido por Williams como sendo a habilidade de um material desempenhar com uma resposta tecidual apropriada em uma aplicação específica. Para que um material seja aceito clinicamente como um material de implante, ele precisa atender a alguns requisitos fundamentais: (1) biocompatibilidade, ou seja, sua presença não deve causar efeitos nocivos no local do implante ou no sistema biológico; () os tecidos não devem causar a degradação do material; (3) o material deve ser biofuncional, ou seja, deve ter as características mecânicas adequadas para cumprir a função desejada e pelo tempo desejado; (4) o material deve ser esterilizável [7]. Os polímeros bioabsorvíveis são representantes de uma classe de poliésteres alifáticos sintéticos, os quais fazem parte, o poli (ácido glicólico) (PGA), poli (ácido láctico) (PLA), poli (ácido láctico-co-ácido glicólico) (PLGA), poli (ε-caprolactona) (PCL), seus copolímeros e outros [8]. O Poli (ácido glicólico) (PGA) é altamente cristalino, hidrofílico, de cadeia linear e sofre degradação hidrolítica tanto in vitro como in vivo. O ácido láctico, gerado pela degradação do poli (L-ácido láctico), é incorporado ao ciclo do ácido carboxílico e eliminado pelos pulmões como dióxido de carbono e água. O poli (ácido glicólico), PGA, é também degradado através de esterases não específicas e carboxil peptidases, que

3 produzem monômeros de ácido glicólico [9-1]. As unidades monoméricas de ácido glicólico podem ser excretadas pela urina ou podem ser convertidas enzimaticamente para glioxalato, que reage com glicina transaminase. A glicina que é gerada pode ser usada na síntese da serina, a qual pode entrar no ciclo do ácido tricarboxílico depois da transformação para piruvato. Os produtos obtidos através da hidrólise da poli (p-dioxanona), PDS, são excretados pela urina e fezes e eliminados como dióxido de carbono [13], como mostra a Figura. PDS Hidrólise Urina Hidrólise PGA Ácido glicólico Glicina CO + O H Serina Hidrólise PLA Ácido láctico Ácido pirúvico Ciclo de Krebs PHB Esterases β - Hidróxi Ácido butírico Acetoacetato Acetil-Coa Figura. Rota metabólica da degradação e excreção de alguns poliésteres [14]. Devido à sua biocompatibilidade e biodegradabilidade, PGA e seus copolímeros têm sido estudados para odontologia, entregas controlada de drogas e aplicações ortopédicas [15]. O objetivo deste trabalho foi sintetizar, caracterizar e avaliar a citotoxicidade in vitro em cultura de células-tronco de linhagem odontoblástica de camundongos (MDPC 3) do poli (ácido glicólico). Experimental Síntese do Poli (ácido glicólico) A síntese do poli (ácido glicólico) foi realizada utilizando-se ácido glicólico 70% (VETEC) em um reator equipado com agitação mecânica e condensador para retirada de água, sob pressão atmosférica (gás N ) a 160 C. Após a retirada de água foi adicionado 0,5 % (em massa) de catalisador acetato de zinco. A reação permaneceu durante 0 horas.

4 Caracterização do Poli (ácido glicólico) Os polímeros foram caracterizados por diferentes técnicas para avaliar a estrutura e propriedades térmicas. Espectroscopia de infravermelho Os espectros de IV foram obtidos em um espectrofotômetro Perkin Helmer-(célula de seleneto de zinco - acessório HATR) em valores de transmitância. Calorimetria Exploratória Diferencial Para a determinação das propriedades térmicas do PGA foi usado um aparelho DSC Q600 TA Instruments com uma taxa de aquecimento de 10ºC/min em atmosfera de nitrogênio (rampa de temperatura -100 até 400 C). A temperatura de transição vítrea (T g ) foi determinada no ponto médio da variação da capacidade calorífica e a temperatura de fusão (T m ) no ponto correspondente ao máximo do pico endotérmico. Análise Termogravimétrica (TGA) A curva termogravimétrica foi obtida com uma balança termogravimétrica-tga SDT 960 da TA Instruments com uma taxa de aquecimento de 10ºC/min (rampa de temperatura 40 to 500ºC) em atmosfera de nitrogênio para a análise da temperatura de degradação. Teste de Citotoxicidade Foi realizado o teste de eluição com 10% PGA utilizando Cultura com Células-tronco de linhagem odontoblástica de camundongos (MDPC-3) seguindo as orientações de extração do eluente da International Standard ISO (Biological Evaluation of Medical Devices, Part 5- Tests for Citotoxicity: in vitro Methods, 199) [16]. Foram realizados os testes de proliferação, viabilidade celular, medida da proteína total e a atividade de fosfatase alcalina.

5 Resultados e Discussão Espectroscopia de Infravermelho Os espectros de infravermelho do monômero ácido glicólico e do polímero PGA são mostrados na Figura 3. a) b) Figura 3. Espectros de IV a) ácido glicólico e b) poli (ácido glicólico). Através da análise do espectro de infravermelho foi possível verificar que uma banda larga em torno 3400 cm -1 atribuído ao estiramento dos grupos OH aparece no espectro do ácido glicólico (Figura 3a). No entanto, esta banda praticamente desaparece no espectro do PGA (Figura 3b), indicando que existe apenas alguma quantidade ainda de monômero residual. Observou-se também um deslocamento da banda referente ao estiramento do C=O no monômero em 179 cm -1 para 1739 cm -1 no polímero, assim como o deslocamento da banda em 1431 cm -1 referente ao estiramento da ligação C-O (monômero) para 1413 cm -1 no éster, indicando que houve a formação do polímero.

6 Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC) A análise de DSC mostrou que o PGA apresentou uma temperatura de transição vítrea (T g ) igual a 46ºC e uma temperatura de fusão (T m ) igual a 181ºC, indicando que o polímero é um poliéster termoplástico semicristalino. Conforme GAUTIER et al [17], a temperatura de transição vítrea do PGA ocorre entre 30 C e 50 C. Neste caso a T g do PGA apresentado neste trabalho apresenta valor dentro desta mesma faixa de temperatura. O valor de entalpia de fusão ( H m ) encontrado de 33 J/g está muito próximo do descrito na literatura por CHUJO et al [18], que achou um valor de H m 0 J/g. Os resultados obtidos para T g e H m do PGA sintetizado mostram que o polímero sintetizado em uma polimerização em massa apresenta características térmicas semelhantes aos PGAs descritos na literatura. Análise Termogravimétrica (TGA) A partir do termograma, Figura 4, observou-se que a temperatura inicial de decomposição do PGA ficou próxima à 150ºC e a temperatura final de decomposição em 34ºC. Esta curva de decomposição obtida refere-se a decomposição do polímero PGA em seus respectivos oligômeros % Massa Temperatura/ºC Figura 4. Termograma do PGA obtido pela técnica de TGA.

7 Teste de Citotoxicidade A viabilidade celular com Células-tronco de linhagem odontoblástica de camundongos foi maior que 85% tanto no grupo controle quanto com o PGA, sugerindo que os componentes deste material não afetam a viabilidade celular, não demonstrando diferença estatística entre eles, como mostra a Figura Viabilidade de células viáveis % C PGA Período ( dias ) Figura 5. Porcentagem de Viabilidade celular de células odontoblásticas em 3, 7, 10 e 14 dias de cultura em contato com poliestireno (grupo controle) e do PGA. Os dados são reportados como média ± DP. Não houve diferença estatística entre os grupos em todos os períodos estudados. No teste de proliferação celular, foi observado que aos três dias de cultura não houve diferença significativa entre o controle e o PGA, após os três dias foi possível verificar que o controle apresentou maior proliferação celular, quando comparado com o PGA, como mostra a Figura 6. Proliferação Número de células poço 10 4 / Período (dias) C PGA Figura 6. Proliferação de células odontoblásticas expresso como número de células 10 4 / poço em 3, 7, 10 e 14 dias de cultura em contato com poliestireno (grupo controle) e do PGA. Os dados são reportados como média ± DP

8 Conforme AKISHIGE et al [19], o número de células tende a crescer na cultura num período de 7 dias com ou sem a incorporação de PGA, porém a proliferação tende a diminuir caso seja incorporado uma grande quantidade de PGA. Esta constatação está de acordo com estudo, pois inicialmente foi adicionada maior quantidade de PGA (0%), que mostrou uma menor proliferação das células odontoblásticas. A avaliação do conteúdo de proteína total mostra que não houve diferença estatística entre o grupo controle e PGA. Após os três dias de cultura houve um aumento do conteúdo de proteína total, como mostra a Figura 7. Proteína Total mg de proteína 10 4 / célula C PGA Período ( dias ) Figura 7. Conteúdo Total protéico de células odontoblásticas a 3, 7, 10 e 14 dias de cultura em contato com poliestireno (grupo controle) e do PGA. Os dados são reportados como média ± DP (n = 5). A atividade de fosfatase alcalina (ALP) foi significativamente maior nos grupos de células em contato com o polímero, quando comparado com o grupo controle. O PGA favoreceu a liberação do ALP nos períodos mostrados na Figura 8. Fosfatase Alcalina mmol timolftaleina/h/mg proteína 0,035 0,030 0,05 0,00 0,015 0,010 C PGA 0,005 0, Período ( dias ) Figura 8. Atividade da fosfatase alcalina em células odontoblásticas em 3, 7, 10 e 14 dias de cultura em contato com poliestireno (grupo controle) e PGA. Os dados são reportados como média ± DP (n = 5).

9 Podemos observar se o material é biocompatível porque este favorece a formação de tecido mineralizado, osso ou dentina. Neste estudo observamos que o PGA induz a produção de proteínas, no caso a fosfatase alcalina, muito importante para a mineralização e formação óssea. Conclusões Os resultados mostrados nos espectros de IV indicaram que a policondensação é uma via sintética limpa e adequada para a obtenção do PGA O polímero obtido apresenta valores de T g e H m compatíveis aos dados descritos na literatura. Os resultados de viabilidade celular do PGA em cultura de células-tronco de linhagem odontoblásticas, sugerem que os componentes deste material não afetam a viabilidade celular. Podemos concluir que o polímero obtido demonstrou ser um biomaterial para uso odontológico. Agradecimentos À PUCRS, USP, UNESP, FAPESP, CNPq e a ASTechnology pelo apoio financeiro. Referências Bibliográficas 1. Medical Acesso: 15/05/009.. V.D. Jahno, Dissertação de Mestrado, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, L.L. Hench. Biomaterials. 1998, 19, M.N. Helmus; K. Tweden, Materials Selection In: Encyclopedic Handbook of Biomaterials and Bioengineering, part A, 1995; Vol.1, D. F. Williams. Progress in Biomedical Engineering. 1987, 4, C.C.Camilo in Anais Congresso Latino Americano De Orgãos Artificiais E Biomateriais, 006, M. Vert; S.M. Li; G. Spenlehauer; P. Guerin. J. Mater. Sci. Mater. Med. 199, 3, S. H. Barbanti; C.A.C. Zavaglia; E.A.R Duek. Polímeros: Ciência e Tecnologia. 005, 15, C.C. Chu; N.D. Campell. J. Biomed. Mater. Res. 198, 16, C.C. Chu. JBiomed. Mater. Res.1981, 15, A.G. Mikos; J.S. Temenoff. Biotechnology of Human Disorders. 000, 3, S.A.Van; K. De Groot; B.C.A. Van. J Mater Sci: Mater. Med. 1993, 4, J.A. Ray; N. Doddi; D. Regula; J.A. Williams; A. Melveger. Surgery,Gynecology & Obstetrics. 1981,153, J.R. Santos; R. Arnaldo; M.L.F. Wada. Polímeros. 007, 17, J.W.Lee; J.A. Gardella. Macromolecules. 001,34, ISO- International Standart Organization 10993/ 1: acesso: 10/05/ E. Gautier; P. Fuertes; P. Cassagnau; J-P. Pascault; E. Fleury. Journal of Polymer Science: Part A: Polymer Chemistry. 009, 47, K. Chujo; H. Kobayashi; J. Suzuki; S. Tokuhara; M. Tanabe. Makromol. Chem. 1967, 100, H. Akishige;T. Takamoto;Y. Tabata. Biomaterials. 006, 7, 61.