UNIVERSIDADE DO CEUMA PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO, PESQUISA E EXTENSÃO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA MESTRADO ACADÊMICO

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1 0 UNIVERSIDADE DO CEUMA PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO, PESQUISA E EXTENSÃO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA MESTRADO ACADÊMICO ERICKA MIRANDA MESQUITA CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA E FUNCIONAL DE CÉLULAS T ATIVADAS E REGULATÓRIAS E SUA CORRELAÇÃO COM O GRAU DE PARASITEMIA DE INDIVÍDUOS INFECTADOS COM Plasmodium vivax São Luís 2012

2 1 ERICKA MIRANDA MESQUITA CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA E FUNCIONAL DE CÉLULAS T ATIVADAS E REGULATÓRIAS E SUA CORRELAÇÃO COM O GRAU DE PARASITEMIA DE INDIVÍDUOS INFECTADOS COM Plasmodium vivax Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Biologia Parasitária da Universidade do CEUMA para obtenção do título de Mestre em Biologia Parasitária. Orientador: Prof. Dr. Marcos Augusto Grigolin Grisotto São Luís 2012

3 2 M479c Mesquita, Ericka Miranda. Caracterização fenotípica e funcional de células T ativadas e regulatórias e sua correlação com o grau de parasitemia de indivíduos infectados com Plasmodium vivax. / Ericka Miranda Mesquita. São Luís: UNICEUMA, p. Dissertação (Pós Graduação) Mestrado em Biologia Parasitária do CEUMA, Malária. 2. Plasmodium vivax. 3. Modulação. 4. Treg I. Grisotto, Dr. Marcos Augusto Grigolin (Orientador) II. Título. CDU:

4 3 ERICKA MIRANDA MESQUITA CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA E FUNCIONAL DE CÉLULAS T ATIVADAS E REGULATÓRIAS E SUA CORRELAÇÃO COM O GRAU DE PARASITEMIA DE INDIVÍDUOS INFECTADOS COM Plasmodium vivax Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Biologia Parasitária da Universidade do CEUMA para obtenção do título de Mestre em Biologia Parasitária. A Comissão julgadora da Defesa do Trabalho Final de Mestrado em Biologia Parasitária, em sessão pública realizada no dia 28/06/2012, considerou o(a) candidato(a): ( ) APROVADO(A) ( ) REPROVADO(A) BANCA EXAMINADORA 1º Examinador: Claudio Romero Farias Marinho 2º Examinadora: Flávia Raquel Fernandes do Nascimento 3º Examinador: Valério Monteiro Neto Orientador: Marcos Augusto Grigolin Grisotto

5 Agradeço a Deus e a meus pais por mais esta realização em minha vida. 4

6 5 AGRADECIMENTOS A Deus Que plantou em mim um sonho que hoje se materializa. Que esteve comigo em toda minha caminhada, me dando força quando em mim já não havia. Que me animou a seguir em frente quando a vontade era de abdicar. E quando chorava em silêncio imaginando está só, Ele enxugou as lágrimas em meu rosto, enquanto cobria minha alma de carinho e consolo. Aquele que me compreende muito mais do que posso entender. Ao criador do céu, da terra e de tudo que há. Ao meu melhor amigo... que sempre esteve e estará a me conduzir, o meu Muito Obrigada. À minha família (Antonio Carlos, Rozenir, David e Leonardo) Por mais que evolua, cresça e me torne adulta, tenho certeza de que nunca serei tão independente e autossuficiente que não precise mais de um carinho, um afago ou conselho... Aos meus pais, irmão e ao meu noivo que estiveram sempre ao meu lado para sorrir comigo ou derramar uma lágrima por mim, sou terna e eternamente grata. Aos Mestres Em especial ao prof. Marcos Augusto Grigolin Grisotto e a profa Flávia Nascimento do Laboratório de Imunofisiologia da UFMA pelos momentos de aprendizagem e principalmente por exercerem a profissão com dedicação e nunca desmotivar seus alunos, mostrando que desistir nunca é a saída. Aos Amigos Gostaria de agradecer a todas as pessoas que de alguma maneira contribuíram para a realização deste trabalho, em especial as minhas amigas Carolina Xavier e

7 6 Thayanne Muniz, que estiveram comigo em todos os momentos, me deram forças e nunca me deixaram desistir (nem mesmo nos momentos mais difíceis). Amigas, muito obrigada mesmo!

8 7 RESUMO A malária causada pelo Plasmodium vivax é considerada doença benigna que raramente agrava, porém pode causar algumas manifestações atípicas, como coagulopatias, comprometimento cerebral, insuficiência renal, complicações pulmonares e icterícia. Esta patologia causa alterações de grande magnitude no sistema imune, como a indução da resposta imune inata contra o parasito, através da ativação de células apresentadoras de antígeno, que vão estimular a resposta imune adaptativa, ativando células T CD4+ e CD8+, bem como, células Natural Killer (NK), produzindo citocinas, que direcionam a resposta imune para um padrão inflamatório do tipo Th1. Existem ainda evidências do aparecimento de células T regulatórias (Treg) que podem atuar como peças importantes para o balanço homeostático e controle da imunopatogenicidade pela supressão da resposta inflamatória excessiva. O presente trabalho teve por objetivo estudar aspectos epidemiológicos e imunológicos de indivíduos com malária causada pelo P. vivax, antes e após o tratamento com antimaláricos. Foi avaliada a expressão de marcadores de ativação em monócitos e linfócitos, a frequência de células Treg durante a malária e a correlação destes parâmetros com o nível de parasitemia. A análise fenotípica foi realizada através da coleta de células de sangue periférico, isoladas com tampão de lise de eritrócitos (ACK), e posteriormente marcadas com anticorpos monoclonais CD4, CD8, CD56, CD161, CD14, HLA-DR, CD25, CD127, em três grupos de indivíduos: agudamente infectados pelo plasmódio (grupo agudo), infectados e tratados por sete dias com antimaláricos (grupo tratado) e indivíduos controles (grupo controle). Os indivíduos infectados eram, em sua maioria, do sexo masculino, com faixa etária entre 20 e 49 anos, procedentes e residentes no interior do Estado. Todos os indivíduos estudados estavam infectados com o P. vivax, e em um único caso, a infecção era mista (P. vivax e P. falciparum). Em relação à carga parasitária, a maioria dos indivíduos avaliados apresentou parasitemia de grau leve (1 cruz) e moderada (2 cruzes). A análise da frequência de células T CD8+ não indicou variação significativa para o grupo agudo, porém verificou-se uma diminuição significante na frequência da subpopulação CD8+CD161 high e um aumento significante das células CD8+CD56+, nesse mesmo grupo. Houve um aumento significante de células T CD4+HLA-DR+ em indivíduos agudos comparados aos controles e tratados. A frequência de células T CD4+CD25+CD127 high (ativadas) e

9 8 CD4+CD25+CD127 low (Treg) apresentou aumento expressivo e significante no grupo agudo em relação aos controles e tratados. Houve uma correlação positiva, porém não significante entre a frequência de células ativadas e o nível de parasitemia, fato não observado em relação às células Treg. Desse modo, os resultados sugerem que durante a infecção pelo Plasmodium vivax ocorre o aumento de células NK e da ativação de linfócitos bem como são ativados mecanismos de regulação que pode ser verificado pelo aumento das células T regulatórias. Estes mecanismos de ativação e regulação podem influenciar no desenvolvimento da doença e no estabelecimento da patogênese. Palavras-chave: Malária, Plasmodium vivax, imunomodulação, Treg

10 9 ABSTRACT The malaria caused by Plasmodium vivax is considered a benign disease that rarely worsens, but in some cases atypical manifestations, such as coagulopathy, cerebral involvement, renal failure, pulmonary complications and jaundice may occour. This disease causes changes of great magnitude in the immune system, such as induction of the innate immune response against the parasite, activation of antigenpresenting cells, which will stimulate the adaptive immune response activating CD4+ and CD8+ T cells, as well as Natural Killer cells (NK) cells, stimulating the production of cytokines, which direct the immune response towards a Th1-type inflammatory pattern. There is also evidence of the emergence of regulatory T cells (Treg) that can act as important tools for balance and homeostatic control of immunopathogenicity by suppression of excessive inflammatory response. The present study analyzed epidemiological and immunological aspects of individuals with malaria caused by P. vivax, before and after treatment with antimalarials. We assessed the expression of activation markers on monocytes and lymphocytes, the frequency of Treg cells during malaria and correlation of these parameters with the level of parasitemia in order to investigate changes in the magnitude of the immune system of infected individuals. The phenotypic analysis was performed by collecting peripheral blood cells, isolated using erythrocyte lysis buffer (ACK), and subsequently stained with monoclonal antibodies CD4, CD8, CD56, CD161, CD14, HLA-DR, CD25, CD127, in three groups of subjects: acutely infected with Plasmodium (acute group), infected and treated with antimalarial drugs for seven days (treated group) and control subjects (control group). The most of infected individuals were male, aged between 20 and 49 years and residents of the country-side of the state. All individuals were infected with P. vivax, and in one case the infection was mixed (P. vivax and P. falciparum). Regarding the parasite load, most infected individuals presented mild (a cross) to moderate (two crosses) parasitemia levels. The analysis of the frequency of CD8+ T cells showed no significant decrease in the acute group, but there was a significant decrease in frequency of CD8+CD161 high subpopulation in acute group and a significant increase of CD8+CD56+ cells in the same group. There was a significant increase in frequency of CD4+HLA-DR+ cells in acutely infected individuals when compared to controls and treated group. The frequency of CD4+

11 10 CD25+CD127high (activated cells) and CD4+ CD25 +CD127low (Treg cells) was significantly increased in the acute group when compared to controls and treated individuals. There was a positive correlation between the frequency of activated cells and the level of parasitemia that was not observed in relation to Treg cells. The results presented indicate that during Plasmodium vivax infection an increase in NK cells numbers occur as well as activation of lymphocytes and regulation of the system by Treg cells. The balance of these mechanisms may influence the outcome and pathogenesis of the disease. Keywords: Malaria, Plasmodium vivax, immunomodulation, Treg

12 11 LISTA DE FIGURAS Figura 1 Geodistribuição das áreas com risco de transmissão de malária no mundo Figura 2 Distribuição dos casos de malária no Brasil de 1960 a 2008, por tipo de plasmódio Figura 3 Distribuição das áreas com risco de transmissão de malária no Brasil em 1999 e em Figura 4 Incidência parasitária anual (IPA) nos Estados da Amazônia Legal em 2005 e Figura 5 Ciclo de vida do Plasmodium vivax Figura 6 Distribuição dos casos de malária causados por Plasmodium vivax de acordo com o sexo Figura 7 Distribuição dos casos de malária causados por Plasmodium vivax de acordo com a procedência dos indivíduos Figura 8 Distribuição dos casos de malária causados por Plasmodium vivax em autóctones e importados Figura 9 Distribuição dos casos de malária em relação ao tipo de plasmódio infectante Figura 10 Distribuição dos indivíduos acometidos pela malária em relação a carga parasitária Figura 11 Expressão dos marcadores CD8 (B), CD56 (C) e CD161 em indivíduo controle (D), agudamente infectado pelo Plasmodium vivax (E) e após o tratamento (F) Figura 12 Frequência de células CD8+ nos grupos agudo, tratado e controle Figura 13 Frequência de células CD8+CD161 high nos grupos agudo, tratado e controle Figura 14 Frequência de células CD8+CD56+ nos grupos agudo, tratado e controle Figura 15 Análise da frequência de células CD8+CD161 high em relação ao nível de carga parasitária de Plasmodium vivax Figura 16 Análise da frequência de células CD8+CD56+ em relação ao nível de carga parasitária de Plasmodium vivax Figura 17 Expressão do marcador HLA-DR em monócitos (CD14+) (C) e linfócitos T CD4+ em indivíduo sadio (D), agudamente infectado pelo Plasmodium vivax (E) e após o tratamento (F) Figura 18 Expressão do marcador HLA-DR em monócitos (CD14+) nos grupos controle, agudo e tratado Figura 19 Frequência de células CD4+HLA-DR+ nos grupos controle, agudo e tratado Figura 20 Expressão dos marcadores CD25 e CD127 por linfócitos T CD4+ em indivíduo sadio (C) e indivíduo agudamente infectado pelo Plasmodium vivax (D) e após o tratamento (E) Figura 21 Frequência de células CD4+CD25+ nos grupos controle, agudo e tratado Figura 22 Frequência de células CD4+CD25+CD127 high (ativadas) nos grupos controle, agudo e tratado Figura 23 Frequência de células CD4+CD25+CD127 low (Treg) nos grupos controle, agudo e tratado... 44

13 12 Figura 24 Análise da frequência de células ativadas CD4+CD25+CD127 high em relação a carga parasitária em indivíduos do grupo agudo Figura 25 Análise da frequência de células T regulatórias CD4+CD25+CD127 low em relação a carga parasitária em indivíduos do grupo agudo Figura 26 Frequência de células T CD8+ em indivíduos na fase aguda e após o tratamento Figura 27 Frequência de células CD8+CD161 High em indivíduos na fase aguda e após o tratamento Figura 28 Frequência de células CD8+CD56+ em indivíduos na fase aguda e após o tratamento Figura 29 Expressão de HLA-DR em CD14+(monócitos) em indivíduos na fase aguda e após o tratamento Figura 30 Frequência de células CD4+HLA-DR+ em indivíduos na fase aguda e após o tratamento Figura 31 Frequência de células CD4+CD25+ em indivíduos na fase aguda e após o tratamento Figura 32 Frequência de células T CD4+CD25+CD127 high (células ativadas) em indivíduos na fase aguda e após o tratamento Figura 33 Frequência de células T reguladoras (CD4+CD25+CD127 low ) em indivíduos na fase aguda e após tratamento... 50

14 13 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ANOVA Análise de variância CD Grupamento de diferenciação CTL Células T citotóxicas DATASUS Sistema de dados do SUS EDTA Etilenodiamino tetracético (anticoagulante) FITC Isotiocianato de fluoresceína FoxP3 Gene envolvido na resposta do sistema imune que funciona como regulador das funções das células T HLA-DR Antígeno leucocitário Humano/ Molécula do Complexo Principal de Histocompatibilidade de classe II IFN- Interferon gama IL Interleucina FACS Separação celular ativada por fluorescência NK Células matadoras profissionais MFI Intensidade média de fluorescência MHC Complexo Principal de Histocompatibilidade OMS Organização Mundial de Saúde PECy5 Ficoeritrina cianina 5 PE Ficoeritrina SIVEP Sistema de Informação de Vigilância Epidemiológica TGF- Fator de crescimento tumoral beta Th Linfócitos T auxiliaries TLR Receptores semelhantes ao Toll TNF- Fator de Necrose Tumoral alfa Treg Células T regulatórias WHO Organização Mundial de Saúde

15 14 SUMÁRIO 1 1 INTRODUÇÃO A malária como problema de saúde pública mundial A malária no Brasil A malária no Maranhão Ciclo de vida do parasito e transmissão da malária Aspectos epidemiológicos da malária O tratamento da malária Resposta imune na malária Células T regulatórias na resposta imune celular Células T regulatórias na malária OBJETIVOS METODOLOGIA Área de estudo e população estudada Critérios de inclusão Avaliação da parasitemia, tratamento e controle de cura Coleta e estocagem de material Isolamento com tampão de lise Fenotipagem por citofluorimetria de fluxo Análises estatísticas RESULTADOS Análise epidemiológica Análise fenotípica Células T CD Marcadores de ativação Dinâmica da expressão de marcadores de ativação e regulação antes e após o tratamento DISCUSSÃO CONCLUSÃO REFERÊNCIAS APÊNDICES ANEXOS... 76

16 15 1 INTRODUÇÃO 1.1 A Malária como problema de saúde pública mundial A malária é uma doença parasitária que tem como agentes etiológicos os protozoários do gênero Plasmodium. Existem mais de 156 espécies de plasmódios, no entanto, somente quatro estão associadas com a doença em seres humanos: Plasmodium vivax, P. falciparum, P. malariae e P. ovale. O P. vivax é uma espécie amplamente distribuída, ocorrendo principalmente nas regiões tropicais e subtropicais, enquanto que o P. falciparum predomina na África e sudoeste da Ásia. Estas duas espécies coexistem em muitas partes do mundo. O P. malariae, hoje, ocorre em menor prevalência e distribui-se pela África, Oeste do Pacífico e na América do Sul, nestes dois últimos ocorre muito raramente. O P. ovale restringe-se à África subsaariana e à Ásia, sendo endêmico apenas na Papua Nova Guiné e Filipinas (CARTER; MENDIS, 2002). Esta endemia mundial constitui um grave entrave ao desenvolvimento econômico de comunidades e nações. Ocorre, principalmente, nas regiões tropicais e subtropicais do globo e tem distribuição heterogênea (LEORATTI, 2004; WHO, 2005). Segundo dados da Organização Mundial de Saúde, em todo o mundo, são 109 países endêmicos para a malária, no qual, 45 destes estão no continente africano. Existem mais de três bilhões de pessoas vivendo em regiões de risco e cerca de um milhão de mortes a cada ano, principalmente entre crianças menores de cinco anos e gestantes (WHO, 2008). A disseminação da doença ocorre no mundo inteiro, embora seja o continente africano a concentrar cerca de 90% dos casos, grande parte deles causados pelo P. falciparum. Essa globalização da doença é um fato atual e preocupa, inclusive, as autoridades de países desenvolvidos (LEORATTI, 2004) (Figura 1). Na América latina, a doença também está amplamente distribuída, sendo o P. vivax, a espécie mais freqüente (PALMER et al., 1998; SHARMA, 1999; SAN SEBASTIAN et al., 2008). Além disso, a malária está se tornando uma doença re-emergente em áreas onde estava controlada ou erradicada, como na Ásia Central e a Coréia (WHO, 2008). O número de casos em áreas não-endêmicas tem aumentado, devido à mobilidade de viajantes, migrantes, tropas e refugiados, ocasionando a chamada

17 16 malária importada (LEORATTI, 2004). De acordo com estudo realizado na União Europeia, no período de 1999 a 2000, ocorreram 1659 casos de malária por P. falciparum importados. Destes, 27 apresentavam infecção mista (11 casos P. falciparum e P. vivax, 10 P. falciparum e P. ovale e 6 P. falciparum e P. malariae). Cinco indivíduos morreram após retornarem de países africanos para a Europa (JELINEK et al., 2002). Figura 1. Geodistribuição das áreas com risco de transmissão de malária no mundo. Fonte: WHO, A malária no Brasil No Brasil, entre os anos de 1980 e 1990, a prevalência das diferentes espécies de plasmódio era de 48,8% para P. falciparum e 50,3% para P. vivax e os anos de 1984 e 1989, apresentaram maior potencial de risco para o P. falciparum, doença grave e resistente ao tratamento. Nos anos 90, a malária continuou em ascensão, porém, agora, com o predomínio do P. vivax, como espécie prevalente, tendência que se mantém até hoje no Brasil (Figura2) (SIQUEIRA-BATISTA, 1999; SILVA, 1999; SIVEP, 2011).

18 17 Figura 2. Distribuição dos casos de malária no Brasil de 1960 a 2008, por tipo de plasmódio. (Fonte: Ministério da Saúde/ Guia de Vigilância Epidemiológica, 2009) Atualmente, a malária encontra-se em declínio em nosso país, porém mesmo com a redução do número de casos, o quadro epidemiológico ainda é preocupante. Em 2008 foram registrados mais de casos da doença em todo o país (BRASIL, 2010), deste total, 99,9% dos casos ocorreu na região da Amazônia Legal, região formada pelos sete Estados da região Norte e pelos Estados do Maranhão e Mato Grosso. Em 90% dessas contaminações, o P. vivax foi a espécie prevalente (BRASIL, 2010). Entre os anos de 2000 e 2002, na Amazônia Legal ocorreu uma redução de 45% na incidência de malária. Neste mesmo período, o número de municípios de alto risco passou de 160 para 76 (Figura 3). As internações reduziram-se para 69,2% e o número de óbitos por malária reduziu em 36,5% (RAMOS, 2006). Segundo o Ministério da Saúde, entre os anos de 2007 e 2008 houve uma redução de 31% dos casos totais de malária ocorridos no Brasil, acompanhados também da redução dos casos por espécie de plasmódio. Em 2007 ocorreram casos de malária por P. vivax e em 2008 esse número caiu para , uma redução na base de 27%. Já em relação ao P. falciparum, a redução foi maior ainda, o número de casos, que em 2007 era de passou para em 2008, uma redução de quase 50% dos casos. Nos seis primeiros meses de 2011, os casos de malária registrados na Amazônia Legal caíram 31% em relação ao mesmo período do ano em Dados

19 18 do Ministério da Saúde indicam que, entre janeiro e junho de 2011, foram notificados, na Amazônia Legal, casos, contra no primeiro semestre de O balanço epidemiológico indica que as internações decorrentes da doença também caíram em aproximadamente 20% de 2010 (2.544 casos) para 2011 (2.030 casos). A redução dos casos foi detectada em todos os Estados da região: 45% no Acre, 19% no Amapá, 41% no Amazonas, 39% no Maranhão, 27% em Mato Grosso, 36% em Rondônia, 29% em Roraima, 30% no Tocantins e 21% no Pará. Segundo o Ministério da Saúde, essa ação positiva contra a malária no Brasil é resultado de uma ação integrada, que inclui a intensificação de ações de rotina para o diagnóstico precoce e tratamento dos indivíduos (BRASIL, 2011). Figura 3. Distribuição das áreas com risco de transmissão de malária no Brasil em 1999 e em (Fonte: SIVEP, 2009) 1.3 A malária no Maranhão No Estado do Maranhão, a malária, ainda hoje, representa uma das principais endemias, sendo responsável por cerca de 10% de todos os casos registrados no país, até meados da década de noventa (SILVA, 1999). Distribui-se em uma área chamada de Pré-Amazônia, que registra cerca de 80% da malária notificada em todo o Estado. É uma área bastante chuvosa, e assim como no restante do país, o plasmódio de maior incidência nesses casos, é o P. vivax, responsável por mais de 70% dos casos.

20 19 A malária no Maranhão atinge mais acentuadamente as populações rurais ou semi-rurais e as recentemente fixadas em áreas de difícil acesso onde desenvolvem atividades na lavoura, na pesca, em desmatamentos para extração da madeira, no plantio de capim, em projetos de reflorestamento e em garimpos. Esse intenso movimento, não só mantém os focos existentes como torna áreas livres do patógeno vulneráveis à infecção (OLIVEIRA-PEREIRA; REBÊLO, 2000). Em 1999, o Maranhão apresentava 30 municípios de alto risco e 13 de médio risco, classificando-se alto risco como a ocorrência de mais de 50 casos por 1000 habitantes e, médio risco, a presença de 10 a 49 casos a cada 1000 habitantes (SIVEP, 2005). Isso pode ser identificado através do Índice Parasitário Anual (IPA) no Estado do Maranhão, que passou de 1,5 a cada 1000 habitantes, em 2005, para 1,2 /1000 habitantes em 2006 (Figura 4) (SIVEP, 2006). Figura 4: Incidência parasitária anual (IPA) da malária nos Estados da Amazônia Legal em 2005 e (Fonte: SIVEP, 2006) Segundo levantamento feito entre os anos de 1999 e 2001, por Ribeiro e colaboradores, em uma área periférica de São Luís, chamada de Residencial Paraíso, foram registrados 26 casos de malária, em 1999, 93, em 2000 e 10, em 2001, com maior incidência durante o período chuvoso (RIBEIRO, 2001). Em 2005, houve redução do número de casos de para , tendose todos os municípios fora da área de alto risco, restando somente 16 em áreas de médio risco (SIVEP, 2005). Em 2008, seguindo-se a tendência dos anos anteriores, o número de casos de malária no Estado decresceu consideravelmente, sendo

21 20 registrados apenas casos positivos, deste total, foram causados por P. vivax (SIVEP, 2008). 1.4 Ciclo de vida do parasito e a transmissão da malária O ciclo do protozoário do gênero Plasmodium compreende duas fases, uma sexuada, que ocorre no interior do mosquito e outra, assexuada, que só ocorre após a inoculação dos esporozoítas na pele do hospedeiro vertebrado. A transmissão inicia-se a partir da picada da fêmea infectada do mosquito do gênero Anopheles, sendo o Anopheles darlingi a espécie mais importante, cujos criadouros preferenciais são áreas de água limpa, quente, sombreada e de baixo fluxo, bastante freqüentes na Amazônia brasileira (BRASIL, 2001; BRASIL, 2010). A partir da picada do mosquito, a fêmea inocula os esporozoítos do parasito na pele do hospedeiro, estes atravessam a pele, caem na corrente sanguínea, invadindo os hepatócitos. A proliferação, dentro dos hepatócitos acontece em 2 a 10 dias, dependendo da espécie de plasmódio. Dentro dessas células, os esporozoítos multiplicam-se e originam milhares de merozoítos (cada esporozoíta pode produzir cerca de merozoítas), que rompem os hepatócitos e vão invadir as hemácias, iniciando ciclo sanguíneo (esquizogonia). É nessa fase que aparecem os sintomas da malária. Nas infecções por P. vivax e P. ovale, alguns parasitos se desenvolvem rapidamente, enquanto outros ficam em Estado de latência no hepatócito, formas conhecidas como hipnozoítos. Estes são responsáveis pelas recaídas da doença, que ocorrem após períodos variáveis de incubação (geralmente dentro de seis meses). Na fase sanguínea do ciclo, os merozoítos formados rompem a hemácia e invadem outras, dando início a ciclos repetitivos de multiplicação eritrocitária, responsável pela patogenia da doença. Os ciclos eritrocitários repetem-se a cada 48 horas nas infecções por P. vivax, P. falciparum e P. ovale (terçã) e a cada 72 horas nas infecções por P. malariae (quartã). Parte desses parasitos transformam-se em gametócitos, formas sexuadas do parasito, que ficam viáveis na corrente sanguínea do hospedeiro infectado, e podem ser ingeridos durante a alimentação do mosquito, iniciando novamente o ciclo sexuado (GOOD e DOOLAN, 1999; GOOD et al., 2005). A fase sexuada inicia-se quando os gametócitos ingeridos vão para o intestino do mosquito, e como a temperatura é mais baixa, os gametas emergem das

22 21 hemácias infectadas, sendo fertilizados, originando os zigotos. Estes vão desenvolver-se em oocistos, iniciando a esporogonia. Ocorre, então, o rompimento do oocisto e as formas infectantes do protozoário, os esporozoítos, são libertados, alojando-se na glândula salivar do mosquito. Durante a alimentação da fêmea, os esporozoítas são inoculados na pele do hospedeiro e todo o ciclo se reinicia (Figura 5) (FREITAS DO ROSÁRIO, 2008). Figura 5. Ciclo de vida do Plasmodium vivax (Fonte: TEIXEIRA, 2011)

23 Aspectos epidemiológicos da malária O período de incubação da malária varia de acordo com a espécie de plasmódio, sendo de cerca de 10 dias para as formas P. falciparum e P. vivax. A fase sintomática inicial caracteriza-se por mal-estar, cefaleia, cansaço e mialgia, quadro que geralmente precede a febre clássica da malária, e é relatado por quase todos os indivíduos acometidos. O paroxismo inicia-se com calafrio que dura de 15 minutos à uma hora, sendo seguido por uma fase febril, com temperatura corpórea podendo atingir 41ºC ou mais. Após um período de duas a seis horas, ocorre o declínio da febre e o paciente apresenta sudorese profusa e fraqueza intensa. Após o período inicial, a febre assume um caráter intermitente, e coincide com a duração dos ciclos eritrocíticos de cada espécie de plasmódio (BRASIL, 2001). Além dos intervalos febris, dependendo da espécie de Plasmodium, os sintomas podem se manifestar na forma não-complicada, evoluindo ou não para a forma complicada. Nas infecções por P. falciparum, manifestações mais graves podem ocorrer, caracterizando a forma complicada da doença, podendo levar o paciente a óbito por causar malária cerebral, anemia grave e acidose metabólica. Nas infecções por P. vivax, P. malariae e P. ovale predomina a forma nãocomplicada, caracterizada por febre intermitente e intensa debilidade física, entre outros sintomas (BRASIL, 2010; MILLER et al., 2002). Na malária não-complicada, os acessos maláricos são acompanhados de intensa debilidade física, náuseas, vômitos e anemia, o paciente apresenta-se pálido e com baço palpável. A anemia é frequente e apresenta-se em graus variáveis. A malária grave e complicada, por sua vez, é verificada a partir do nível de parasitemia do hospedeiro. Considera-se hiperparasitemia quando existem mais de 2% das hemácias parasitadas no indivíduo primoinfectado e mais de 5%, naqueles indivíduos que já tiveram malária em algum momento da vida. Na prática, consideram-se hiperparasitados os indivíduos que apresentam o exame de gota espessa, com positividade igual ou superior a três cruzes ou presença de esquizontes com qualquer nível de parasitemia (BRASIL, 2001). Ainda sob a visão de Brasil (2001) hipoglicemia, convulsões, vômitos repetidos, hiperpirexia, icterícia e distúrbio da consciência, são indicadores de pior prognóstico e podem preceder às seguintes formas clínicas da malária grave e complicada: malária cerebral (ocorre em 2% dos indivíduos não imunes, infectados

24 23 por P. falciparum), insuficiência renal aguda, edema pulmonar agudo, hipoglicemia, disfunção hepática e hemoglobinúria. Alguns casos de P. vivax têm relatado o aparecimento de manifestações atípicas da doença como coagulopatias, comprometimento cerebral, insuficiência renal, complicações pulmonares e icterícia, principalmente em áreas endêmicas, caracterizando a forma grave da doença (WARREL, 1993; SILVA et al., 2000; MYOUNG-DON et al., 2001; MOHAPATRA et al., 2002; ECHEWERI et al., 2003). Para o diagnóstico de malária grave, algumas características clínicas devem ser observadas atentamente: hiperparasitismo, anemia grave, icterícia, hipertermia mantida, distúrbios hidroeletrolíticos e do equilíbrio ácido-base, insuficiência respiratória, insuficiência renal, alteração do nível de consciência, colapso circulatório, distúrbios hemorrágicos e da coagulação, hipoglicemia e coma (BRASIL, 2001). 1.6 O tratamento da malária O tratamento da malária deve levar em consideração alguns parâmetros, como por exemplo, espécie de plasmódio infectante (dada à especificidade dos esquemas terapêuticos preconizados pelo Ministério da Saúde), idade do paciente, levando em consideração que idosos e crianças são mais susceptíveis à toxicidade das drogas utilizadas no tratamento, se a paciente é gestante, histórico do paciente, se já contraiu alguma vez a doença ou não, já que, normalmente, nos indivíduos primoinfectados, a doença tende a ser mais grave. Além disso, deve-se avaliar o grau de parasitemia e se a doença está ou não evoluindo com a sintomatologia mais grave (BRASIL, 2001). O Ministério da Saúde (BRASIL, 2001) possui um esquema terapêutico já préestabelecido, que orienta os profissionais da saúde da seguinte forma: - Infecção causada por P. vivax ou P. ovale, o esquema preconizado é: 3 dias de cloroquina associados a 7 dias de primaquina (esquema curto); - Infecção causada por P. malariae: tratamento deve ser apenas 3 dias de cloroquina; - Infecção por P. falciparum: existem três esquemas terapêuticos, já que esta espécie é considerada a mais grave, já foi responsável por muitas mortes no passado e tem histórico de resistência ao tratamento. Os esquemas são: artemeter e

25 24 lumefantrina, por 3 dias ou artesunato e mefloquina por 3 dias ou quinina (3 dias), doxiciclina (5 dias) e primaquina (1 dia) associadas. - Para infecções mistas de P. falciparum com P. vivax ou P. ovale, deve ser utilizado do 1º ao 3º dias artemeter e lumefantrina ou artesunato e mefloquina, e do 4º ao 10º dias, usar a primaquina. A cloroquina, hoje, é a droga mais utilizada, até porque, no Brasil, bem como no Maranhão, a espécie de maior incidência é o P. vivax. Esta espécie ainda responde bem à cloroquina, além disso, essa droga tem papel central tanto no tratamento, quanto na profilaxia da malária, principalmente nos países em desenvolvimento, pelo seu baixo custo, eficácia e segurança (WHITBY, 1997). Possui ação esquizonticida nos eritrócitos infectados pelos P. vivax, P. ovale e P. malariae, além de exercer efeito gametocida nestas espécies e limitada ação sobre algumas cepas de P. falciparum (WARREL, 1998; BRASIL, 2001). A primaquina, outra droga utilizada no tratamento de escolha contra P. vivax, tem ação contra os gametócitos dos plasmódios e hipnozoítos hepáticos das formas recidivantes do P. vivax e P. ovale. É o único fármaco usado nas formas recidivantes. Os efeitos adversos mais graves da primaquina estão associados aos elementos formados no sangue e na medula óssea, podendo acarretar leucopenia, anemia e metemoglobinemia. Em indivíduos com deficiência da enzima glicose-6- fosfato desidrogenase (G-6-PD), observa-se um aumento da ação hemolítica da primaquina (TEIXEIRA, 2011 ). Um dos aspectos que inviabilizam o sucesso do tratamento é a variação da resposta dos parasitos aos esquemas terapêuticos utilizados (NOEDL; WERNSDORFER; WONGSRICHANALAI, 2003). Além disso, outros fatores, tais como: número de parasitos, no hospedeiro humano, expostos aos antimaláricos, concentração do antimalárico aos quais estes parasitos estão expostos, propriedades farmacodinâmicas dos antimaláricos, grau de resistência resultante das alterações genéticas e nível de defesa do hospedeiro conferido pela imunidade específica e inespecífica interagem no desenvolvimento da resistência pelos plasmódios (WONGSRICHANALAI, 2002; RIGBY; HECHINGER; STEVENS, 2002, WHITE et al., 1998). Segundo a Organização Mundial de Saúde (WHO, 2001), a resistência do plasmódio às drogas antimaláricas é a capacidade que uma determinada cepa tem

26 25 de sobreviver e se multiplicar, mesmo quando da administração correta do antimalárico, em concentrações plasmáticas efetivas. 1.7 A Resposta imune na malária A resposta imune contra o plasmódio pode ser desenvolvida especificamente contra cada um dos estágios do parasito. As formas sanguíneas dos plasmódios são as responsáveis pelas manifestações patológicas da doença. Os sintomas clínicos da malária estão diretamente relacionados com o estágio sanguíneo do parasito (BUENO, 2011). A imunidade à malária envolve tanto uma resposta celular como humoral. As células T são essenciais na estimulação da produção de anticorpos e na indução da imunidade celular. Os mecanismos efetores mediados por células T CD8+ e T CD4+ auxiliares contra o parasito, são responsáveis, respectivamente, pela destruição do hepatócito infectado por ação citotóxica e secreção de citocinas como o IFN- potente ativador de macrófagos e monócitos, aumentando a fagocitose, levando a morte dos parasitos. Outras citocinas, como a IL-1 e a IL-6, tem um papel importante na inibição desenvolvimento intra-hepático dos parasitos (LEORATTI, 2004). Nos estágios eritrocíticos assexuados, a resposta imune tem sido associada a anticorpos e células T CD4+, que tem papel na indução e manutenção de uma resposta do tipo Th1, que produz citocinas pró-inflamatórias como IFN-, TNF- e IL-12, que potencializam a ativação de macrófagos e outras células efetoras (LEORATTI, 2004). Durante o ciclo de vida sanguíneo do parasito ele exporta uma série de proteínas variantes na superfície da hemácia infectada que ficam expostas ao sistema imune do hospedeiro, agindo contra esses antígenos, os anticorpos são as principais moléculas responsáveis pela imunidade adquirida contra os estágios sanguíneos do Plasmodium. Os anticorpos podem ativar vários mecanismos, dentre os quais podemos destacar a opsonização de eritrócitos infectados, bloqueando a invasão do eritrócito pelos merozoítos e interferindo no processo de citoaderência, não permitindo que a forma grave da infecção se desenvolva (GIHA et al., 2000). O curso da infecção depende do equilíbrio entre as citocinas secretadas pelas células ativadas, já que a severidade da doença tem sido associada com altos níveis

27 26 sistêmicos de IFN- e TNF-. A produção de IFN-, como já citado, ativa macrófagos que vão produzir grandes quantidades de TNF-, responsável pelos paroxismos da malária, podendo levar a sintomas mais graves, como anemia grave e malária cerebral. Se por um lado há um aumento da imunopatologia devido à resposta inflamatória excessiva durante o estágio eritrocítico do parasito (SCHOFIELD e GRAU, 2005), há também uma supressão da resposta imune no compartimento linfocitário (GREENWOOD et al., 1972; WILLIAMSON e GREENWOOD, 1978; COOK, 1985; MABEY et al., 1987; GOONEWARDENE et al., 1990). Nesse sentido, pode-se afirmar que, a infecção pelo P. vivax induz, num primeiro momento, a ativação da resposta imune, induzindo e aumentando a expressão de moléculas associados à ativação celular. Uma das moléculas, o CD25 (cadeia alfa do receptor da interleucina 2 - IL-2R ), passa a ser expressa e maior quantidade por linfócitos T e B ativados, monócitos e subpopulações de células dendríticas ativadas durante a malária. A ligação da IL-2 com este receptor promove a ativação, induz a entrada no ciclo celular e estimula a proliferação de linfócitos. O CD25 é um marcador precoce de ativação, podendo ser detectado logo nas primeiras horas durante a infecção (de 2 a 8 horas) e sua expressão pode se manter por alguns dias, porém sua expressão também esta associada ao desenvolvimento de células T regulatórias (WALTHER et al., 2005). Outra molécula indicadora da ativação celular é o HLA-DR, que é uma glicoproteína de superfície que pertence à classe dos antígenos leucocitários humanos (HLA) de classe II. Os principais tipos de proteínas do HLA de classe II são DP, DQ e DR cuja expressão ocorre principalmente em células apresentadoras de antígeno como macrófagos, células dendríticas e linfócitos B. Entretanto, apesar de sua função como molécula apresentadora de antígeno, o HLA-DR foi originalmente descrito como um marcador de ativação de linfócitos T, devido ao aumento em sua expressão nestas células durante a ativação linfocitária. (SALGADO et al., 2002). A expressão de HLA-DR em células T CD4 + ativadas ocorre na maioria das espécies de mamíferos, mas não em camundongos. Em processos infecciosos agudos, como na infecção pelo Plasmodium falciparum também pode ser observado um aumento significativo na expressão de HLA-DR por células T CD4 +.

28 27 A ativação eficiente de células do sistema imune desempenha uma função importante no controle da doença, ativando macrófagos, neutrófilos, células T e NK (natural killer), induzindo a febre e a produção pelo fígado das proteínas de fase aguda. Por outro lado, a evolução da infecção e o surgimento de células que controlem o avanço dessa inflamação são extremamente importantes para que o paciente não progrida com a patologia grave da doença (KARUNAWEERA, 1992 e ZEYREK, 2006). Logo, existem evidências do aparecimento de células T regulatórias (Treg) que podem atuar como peças importantes no balanço homeostático e no controle da imunopatogenicidade através da modulação/supressão da resposta inflamatória excessiva. (WALTHER et al., 2005). Estas células têm necessárias para suprimir as respostas imunes celulares, através do contato direto com as células imunes efetoras e pela produção de citocinas reguladoras, incluindo TGF e IL-10. (BELKAID, 2007). 1.8 Células T regulatórias na resposta imune celular As células Treg constituem 5-10% dos linfócitos T CD4+ periféricos e são vitais para a manutenção da tolerância imunológica, prevenindo a ativação e a proliferação excessiva de linfócitos T autorreativos (SHEVACH et al., 2001; MIYARA e SAKAGUCHI, 2007). Essas células têm como função limitar o grau de respostas imunes efetoras, podendo até tornar o organismo incapaz de controlar adequadamente a infecção. Por meio dessa supressão, essas células limitam danos colaterais que possam ser causados por uma resposta imune vigorosa contra os patógenos (BELKAID; TARBELL, 2009). Com base na sua origem, as células Treg podem ser classificadas em de ocorrência natural e induzidas. As naturais desenvolvem-se no timo e regulam células T auto-reativas na periferia. As induzidas desenvolvem-se a partir de células T CD4+ convencionais, a partir da exposição dessas células à citocinas reguladoras, como IL-10 e TGF- ou à células apresentadoras de antígenos (APCs) (GONÇALVES, 2010). Entre os linfócitos T com função imunorregulatória encontram-se as células T CD4+ que co-expressam o CD25 e o fator de transcrição nuclear Forkhead Box P3 (FoxP3), diretamente responsável pelo seu desenvolvimento e função (FONTENOT

29 28 et al., 2003). Essas células foram descritas, inicialmente, por Sakaguchi e colaboradores (SAKAGUCHI et al., 1995.), e são potencialmente capazes de suprimir a ativação, a proliferação e/ou a função efetora dos linfócitos T CD4+, T CD8+ e, possivelmente, células NK, NK/T, linfócitos B e células dendríticas (VON BOEHMER, 2005). São, também, indispensáveis para a manutenção dos mecanismos de tolerância, o conhecimento da função dessas células, é fundamental para a compreensão da fisiopatogenia das doenças auto-imunes e infecciosas. Além dos marcadores CD25 e FoxP3, essas células também podem expressar outras moléculas, tais como, CTLA-4 (antígeno-4 do linfócito T citotóxico), GITR (membro da superfamília dos receptores TNF), CD 62L, OX40 (CD134) (SHEVACH et al., 2006), CD39 e CD73 (DEAGLIO et al., 2007). Contudo, esses marcadores não são específicos para as células Treg, uma vez que eles também podem ser expressos em outras células T ativadas (BELKAID e TARBELL, 2009). Recentemente, foi demonstrado por Seddiki et al. que a molécula CD127 pode funcionar como opção excelente para obtenção de uma população de Tregs com alto grau de pureza e com alto grau de atividade supressora (SEDDIKI et al., 2006). Liu e colaboradores observaram que a maioria das células CD4+FoxP3+ era do expressavam CD25 high CD127 low. Este estudo demonstrou que a utilização do CD25 em conjunto com o CD127 poderia fornecer resultados fidedignos para análise da população de Tregs, com alto grau de pureza no sangue periférico em um número significativamente maior do que se pensava. Por meio da utilização do CD127, pode-se também distinguir populações de células efetoras recém-ativadas e de células Tregs, pois apenas as Tregs apresentam baixa expressão de CD127, enquanto que as células efetoras recém-ativadas apresentam alta expressão desse marcador (SEDDIKI et al., 2006; LIU et al., 2006). As células imunorregulatórias apresentam como propriedade básica a capacidade de produzir citocinas imunossupressoras, como IL-10 e TGF-β, além disso, têm a capacidade de induzir a supressão da resposta imune através do contato célula-célula. Annunziato e colaboradores (2002) avaliaram as características fenotípicas e funcionais das Tregs e demonstraram que essas células respondem a quimiocinas produzidas por macrófagos e células epiteliais tímicas, expressando CD4, CD25 e CTLA-4 de membrana, além de apresentar baixa

30 29 produção de IL-10 e nenhuma de IL-2, IL-4, IL-5, IL-13 e IFN- (ANNUZIATO et al., 2002; CRUVINEL et al., 2008). 1.9 Células T regulatórias na malária Na malária, os estudos iniciais sobre o papel das células Treg no controle da imunidade contra este patógeno são, em sua grande maioria, realizados em modelos murinos sendo que pouco ainda se sabe sobre a dinâmica das células Treg durante a infecção pelo Plasmodium em humanos. Alguns experimentos realizados em roedores, por Hiseada e colaboradores (2004), Wu e colaboradores (2007), demonstraram que, de fato, essa população de células está envolvida na supressão da resposta imune. Além disso, esses estudos apontaram a IL-10 como o principal fator ativador dos mecanismos supressores pelas Tregs nos animais susceptíveis (HISEADA et al., 2004; WU et al., 2007). Em humanos, ainda existem poucos estudos sobre o papel das Tregs e a imunidade antimalárica, porém alguns trabalhos tem mostrado que ocorre um aumento significativo da população de células Treg nas infecções com P. falciparum e P. vivax (BUENO, 2011). A expansão das células Tregs durante a infecção malárica humana e experimental parece estar relacionada com o aumento da carga parasitária (GONÇALVES, 2010). Segundo Bueno e colaboradores (2010), indivíduos naturalmente infectados pelo P. vivax apresentam um aumento significativo de células Treg circulantes no sangue periférico. A expansão dessas células em indivíduos infectados foi significativamente associada com o aumento/ retardo do crescimento do parasito (HISEADA et al., 2004; AMANTE et al., 2007; NIE et al., 2007; LONG et al., 2003), ao aumento da carga parasitária (WALTER et al., 2005; RILEY et al., 2006; MINIGO et al., 2009) e ao desenvolvimento de malária clínica (TODRYK et al., 2008). Embora o número de células Tregs periféricas aumente com o nível de parasitemia, a relação entre o número de parasitos no hospedeiro e a atividade das células T reguladoras ainda não está totalmente elucidado. No entanto, é possível que o aumento da atividade das Tregs possa desencadear a modulação da resposta imune do hospedeiro e consequentemente, favorecer a sobrevivência do parasita e / ou falha no controle da multiplicação do parasito. Por outro lado, o aumento dessas células pode também contribuir para a limitação da resposta imune exacerbada do

31 30 indivíduo em função da patologia instalada pelo plasmódio, o que seria extremamente benéfico para o hospedeiro (BUENO et al., 2010). Apesar dos estudos iniciais realizados em populações expostas aos plasmódios humanos em áreas endêmicas demonstrarem associação positiva entre expansão de células Tregs e nível de morbidade, muito ainda precisa ser entendido, como por exemplo, se em regiões com perfil de transmissão instável existe alguma relação entre esse tipo de células, a parasitemia do indivíduo e a intensidade clínica da infecção. Além disso, não existem muitos estudos que avaliem as diferenças nos níveis basais entre regiões geograficamente diferentes (como a América do Sul), nem mesmo outros que avaliem o impacto das células Tregs e a evolução clínica da doença na infecção humana por P. vivax em regiões endêmicas para esta patologia, visto que os estudos feitos até aqui, apenas, discorrem acerca de como a relação parasito-hospedeiro contribui para a imunorregulação durante a fase aguda da infecção. Diante disso, este trabalho tem como principal objetivo avaliar os aspectos imunológicos como a ativação celular durante a malária aguda e a dinâmica das células Treg, correlacionando-os com carga parasitária durante infecção causada pelo P. vivax em seres humanos.

32 31 2 OBJETIVOS 2.1 Geral Estudar aspectos epidemiológicos, a dinâmica de células T regulatórias, a ativação de monócitos e linfócitos e sua correlação com a carga parasitária de indivíduos infectados por Plasmodium vivax no Estado do Maranhão. 2.2 Específicos Estudar os aspectos epidemiológicos dos indivíduos acometidos pela malária no Estado do Maranhão entre os anos de 2010 e Investigar a freqüência, indução e o papel de células Treg (CD4+CD25+ CD127 low ) em indivíduos infectados, antes e após o tratamento com antimaláricos; Investigar o estado funcional de linfócitos T CD4+ e monócitos (CD14+) através de marcadores de ativação; Correlacionar o grau de ativação e de regulação do sistema imune com os níveis de parasitemia de indivíduos agudamente infectados por P. vivax;

33 32 3 METODOLOGIA 3.1 Área de estudo e população estudada Os indivíduos deste estudo são provenientes do Estado do Maranhão, dos municípios de Buriticupu, Cedral, São José de Ribamar e São Luís. A faixa etária variou de 0 a 69 anos, para indivíduos de ambos os sexos. Todas as amostras foram submetidas ao exame de gota espessa para identificação da espécie de plasmódio e da parasitemia do paciente. Após os 7 dias de tratamento, novo exame foi realizado para a verificar se houve mesmo a negativação da parasitemia. Foram analisados 41 indivíduos acometidos de malária, sendo 26 analisados na fase aguda da doença e 15, cujo sangue foi coletado após os 7 dias de tratamento com antimaláricos, conforme preconiza o Ministério da Saúde. Deste grupo, 6 indivíduos foram analisados tanto na fase aguda (antes do tratamento) como também após ter sido tratado. Foram também utilizados 15 indivíduos controles, sadios e que nunca contraíram qualquer tipo de malária anteriormente, residentes no município de São Luís. A pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética e Pesquisa da Universidade do Ceuma (protocolo 00879/09, de 17/12/2009 APÊNDICE A), sendo que todos os indivíduos assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (APÊNDICE B). 3.2 Critérios de Inclusão Integraram o estudo indivíduos de ambos os sexos, com idade entre de 0 a 69 anos, com exame da gota espessa (método de Giemsa) positiva para Plasmodium vivax e que aceitaram participar do estudo e que responderam ao questionário clínico-epidemiológico (APÊNDICE C). 3.3 Avaliação da parasitemia, tratamento e controle de cura Para a verificação da parasitemia foram coletadas amostras de sangue dos indivíduos com sintomas suspeitos de malária para realização dos testes de gota espessa. As amostras foram coradas com Giemsa usando-se o método tradicional (Manual de Diagnóstico Laboratorial da Malária, 2005, Ministério da Saúde) e a

34 33 contagem de parasitos foi realizada em microscópio óptico. Para a estimativa dos níveis de parasitemia foi usado o método tradicional semi-quantitativo (método de cruzes) conforme diagrama abaixo: Fonte: Manual de Diagnóstico Laboratorial da Malária, 2005, Ministério da Saúde. Os indivíduos positivos em exame de gota espessa foram submetidos ao esquema terapêutico com cloroquina (durante 3 dias), associada à primáquina (7 dias), seguindo o que preconiza o Manual de Terapêutica da Malária, do Ministério da Saúde. O controle de cura obedeceu parâmetros clínico e parasitológico, considerando-se o resultado negativo da gota espessa, colhida no sétimo dia do tratamento. Os dados relacionados à epidemiologia, clínica e resposta terapêutica foram anotados em ficha específica e correlacionados com aspectos imunológicos. 3.4 Coleta e Estocagem de material As amostras sanguíneas foram colhidas, por punção venosa periférica, em tubos com EDTA, cerca de 4 ml de sangue foi coletado de cada paciente, após a identificação da doença, por meio do exame de gota espessa. As amostras foram encaminhadas para o laboratório de Imunologia das Parasitoses da Universidade do Ceuma para serem então processadas para os experimentos de caracterização fenotípica e funcional através de citometria de fluxo. O material obtido no campo foi devidamente embalado e acondicionado em geladeira por um período máximo de 24 horas.

35 Isolamento com Tampão de lise As amostras recebidas foram centrifugadas, para a retirada do plasma, e as células foram então isoladas por tampão de lise, cuja formulação para 1 litro, foi: 8,3 g NH4Cl, 1g KHCO3, 1,8ml de uma solução de 5% EDTA. 3.6 Fenotipagem por citofluorimetria de fluxo A avaliação fenotípica e funcional foi realizada logo após o isolamento dos leucócitos. As células foram transferidas para uma placa de fundo redondo, marcadas com os anticorpos específicos e incubadas a 4º C por 30 minutos. Para a marcação extracelular foram utilizados os seguintes anticorpos monoclonais: CD56, CD127 e CD14 conjugados a FITC; CD161, CD25 e CD4 conjugados a PE; CD8, CD4, CD25 e HLA-DR conjugados a PECy5, todos adquiridos da ebiosciences. Após a marcação, as células foram lavadas com 200 ul de RPMI, e transferidas para tubos de poliestireno contendo 400 ul de solução salina e 100 ul de Paraformaldeído 2% (PFA 2%) para fixação. As amostras foram captadas em citômetro de fluxo (BD FACSCalibur - BD Biosciences) e os dados foram analisados com o programa FlowJo (TreeStar) Análises Estatísticas Para a comparação entre os grupos estudados, foram utilizados os seguintes testes: na comparação entre três grupos Controle, Agudo e Tratado analisados, utilizou-se o teste de análise de variância (ANOVA), teste paramétrico, seguido pelo teste de comparação de Turkey. Já na comparação entre os mesmos indivíduos na fase aguda e após o tratamento, foi utilizado o t de Student pareado. As diferenças obtidas foram consideradas estatisticamente significativas quando p< 0,05. Para a confecção dos gráficos com as médias dos grupos foi utilizado o programa Prism for Windows 5.0 (GraphPad, Inc).

36 FREQUÊNCIA RELATIVA (%) 35 4 RESULTADOS Esta dissertação foi dividida em duas partes, apresentadas a seguir. Na primeira estão apresentados dados epidemiológicos dos indivíduos acompanhados neste estudo, dados coletados a partir do questionário aplicado. Na segunda parte, estão apresentados dados relativos às variações imunológicas decorrentes da infecção por malária: alterações nas populações celulares, níveis de ativação e dinâmica das células Treg antes e após o tratamento. 4.1 Análise Epidemiológica Estão relatados a seguir os dados epidemiológicos dos 41 indivíduos infectados com Plasmodium, sendo que os mesmos foram classificados em relação aos seguintes aspectos: sexo, faixa etária, procedência dos indivíduos, casos autóctones e importados, tipo de parasito causador e parasitemia. A maior prevalência de malária ocorreu no sexo masculino, 33 (92,7%) casos, enquanto no sexo feminino foram apenas 8 (7,3%) casos (Figura 6) MASCULINO FEMININO Figura 6: Distribuição dos casos de malária causados por Plasmodium vivax de acordo com o sexo. Em relação à faixa etária, foi visto que dentro no intervalo de 20 a 29 anos (32%), ocorreu o maior número de casos, seguido dos intervalos 30 a 39 anos e 40 a 49 anos, com 17% e 20% de incidência, respectivamente. Já os intervalos entre 50

37 FREQUÊNCIA RELATIVA (%) FREQUÊNCIA RELATIVA (%) e anos, somaram apenas 5 indivíduos (4 e 1, respectivamente) (Tabela 1). Tabela 1: Distribuição da frequência relativa e número de casos de malária causada por Plasmodium vivax de acordo com a faixa etária. Faixa etária (anos) Número de indivíduos Frequência (%) Em relação à procedência dos indivíduos, foi detectado que a maioria era do interior do Estado (Buriticupu - 7 casos, Cedral - 21 casos e São José de Ribamar - 1 caso), houve maior incidência de casos pelo interior (29 casos), que na capital (São Luís) (9 casos),(figura 7B). Também foram atendidos e analisados indivíduos que contraíram a malária fora do Estado, com procedência de Rondônia e da Guiana Francesa (4 casos)(figura 7A). Assim, os casos totais foram subdivididos em autóctones e importados. Em relação a este dado, percebe-se que, a maior parte dos casos, ocorreu a partir de infecção de dentro do próprio Estado, ou seja, são autóctones (37 casos) (Figura 8). A 60 B A B C D E F 0 CAPITAL INTERIOR Figura 7: Distribuição dos casos de malária causados por Plasmodium vivax de acordo com procedência dos indivíduos. (A) Procedência dos indivíduos de acordo com o local de infecção. Em A

38 FREQUÊNCIA RELATIVA (%) 37 Guiana Francesa, B Rondônia, C Buriticupu, D Cedral, E São José de Ribamar, F São Luís. (B) Distribuição da procedência de acordo com a classificação do local em capital ou interior IMPORTADOS AUTÓCTONES Figura 8: Distribuição dos casos de malária causados por Plasmodium vivax em autóctones e importados. Em relação ao tipo de plasmódio infectante, observou-se que o Plasmodium vivax foi a principal espécie de parasito causador da malária neste grupo de indivíduos, visto que 40 deles apresentaram infecção apenas por P. vivax (97,5%) e somente um caso foi de infecção mista (P. vivax + P. falciparum) (Figura 9). P. vivax Infecção mista Figura 9: Distribuição dos casos de malária em relação ao tipo de plasmódio infectante. Com relação à parasitemia, a maior parte dos indivíduos tinha infecção malárica com uma (+) e com duas cruzes (++) (11 casos (42,3%) em cada grupo), o que corresponde à observação de 301 a 500, e de 500 a parasitos/mm 3, respectivamente. Apenas quatro (15,4%) indivíduos possuíam carga parasitária igual a meia cruz de vivax (correspondente a visualização de 200 a 300 parasitos/mm 3 ) (Figura 10).

39 FREQUÊNCIA RELATIVA (%) / Figura 10: Distribuição dos indivíduos acometidos pela malária em relação ao nível de carga parasitária. 4.2 Análise Fenotípica Neste trabalho foram avaliadas frequências totais, marcadores de ativação de linfócitos T CD4+, T CD8+ e monócitos além de marcadores de células T CD4+ regulatórias (Treg). Os valores das médias e desvios das frequências encontram-se sumarizados na Tabela 2, que indica também quando houve diferenças significantes entre os grupos controle, agudamente infectado e tratado. Para os demais parâmetros analisados, inclusive os que apresentam diferenças discretas entre os grupos, os dados foram apresentados em forma de gráficos para uma melhor visualização das tendências nas mudanças causadas pela infecção do P. vivax nas células do sistema imune.

40 39 Tabela 2: Distribuição das médias e desvios-padrão (DP) das subpopulações celulares nos grupos controle, agudo e tratado. Subpopulações celulares Grupos Controle Agudo Tratado p (n=16) (n=26) (n=15) Média ± DP Média ± DP Média ± DP CD8+ 6,9±3,3 5,9±2,8 6,4±1,9 0,2359 CD8+CD161 high 12,8±5,5 7,6±4,0 8,9±4,3 0,0042 CD8+CD56+ 7,6±3,9 13,1±8,7 12,1±3,8 0,0023 CD4+HLA-DR+ 9,6±4,8 16,8±6,7 10,6±6,1 0,0002 CD14+ 3,5±1,7 6,2±3,6 3,4±1,1 0,0001 CD4+CD25+ 12,8±2,1 21,7±4,2 15,7±2,9 0,0320 CD4+CD25+CD127 High (ativadas) CD4+CD25+CD127 Low (Treg) 5,5±1,2 11±3,1 8,2±2,0 0,0050 7,2±1,7 10,6±3,4 7,5±2,8 0, Células T CD8+ A população de células T CD8+, importante na resposta contra o parasito durante a fase hepática do ciclo, foi selecionada a partir de uma janela de tamanho (FSC) e granulosidade (SSC) e posteriormente pela positividade do marcador CD8 (Figuras 11A e 11B). Em seguida foi analisada a expressão de CD56 (marcador de uma subpopulação de células NK Figura 11C) e de CD161, presentes em células T citotóxicas efetoras em indivíduos controle (Figura 11D) agudamente infectados (Figura 11D - agudo) e após tratamento (Figura 11F - tratado). Em termos percentuais, observou-se uma pequena diminuição percentual na frequência da população de células CD8+ totais no grupo agudo, porém essa diminuição não foi estatisticamente significante (Figura 12). Em relação à CD161 observou-se uma diminuição na freqüência relativa de células CD8+ CD161 high no grupo agudo em relação ao grupo controle (Figura 13).

41 FREQUÊNCIA RELATIVA (%) 40 Figura 11: Expressão dos marcadores CD8 (B), CD56 (C) e CD161 em indivíduo controle (D), agudamente infectados pelo Plasmodium vivax (E) e após o tratamento (F). Em (C), as linhas representam as médias das frequências das células CD8+CD56+ nos grupos analisados. A linha preta representa a média do grupo controle, a vermelha, o grupo agudo e a azul, média do grupo tratado CONTROLE AGUDO TRATADO Figura 12: Frequência de células T CD8+ nos grupos agudo, tratado e controle. As barras horizontais representam as médias do percentual de células em cada grupo.

42 FREQUÊNCIA RELATIVA (%) FREQUÊNCIA RELATIVA (%) * CONTROLE AGUDO TRATADO Figura 13: Frequência de células CD8+CD161 High nos grupos agudo, tratado e controle. As barras horizontais representam as médias do percentual de células em cada grupo. * p<0,05. (p = 0,042/ F = 6,082) Outra subpopulação de células analisadas foi a de CD8+CD56+, subgrupo de células Natural Killer (NK). O grupo agudo apresentou um aumento significante na freqüência de células CD8+CD56+ (12,6%), em relação aos demais grupos tratado (12,1%) e controle (7,8%) (Figura 14). 40 * 30 * CONTROLE AGUDO TRATADO Figura 14: Frequência de células CD8+CD56+ nos grupos agudo, tratado e controle. As barras horizontais representam as médias do percentual de células em cada grupo. *p<0,05 (F = 6,802/ p = 0,0023)

43 FREQUÊNCIA RELATIVA (%) FREQUÊNCIA RELATIVA (%) 42 Foi feita uma correlação entre as frequências das populações CD8+CD161 High e CD8+CD56+ com a parasitemia dos indivíduos agudos. Observou-se que em relação à CD161, a média das frequências não foi diferente nos 3 níveis de parasitemia (figura 15), visto que esta expressão mostrou-se bastante heterogênea. Já em relação à frequência de células CD8+CD56+, verificou-se um pequeno aumento destas células em função da parasitemia, visto que indivíduos com uma ou duas cruzes apresentaram mais células CD8+CD56+ no sangue periférico, entretanto não foram encontradas diferenças significativas entre os grupos analisados (Figura 16) / Figura 15: Análise da frequência de células CD8+CD161 High em relação ao nível de carga parasitária de Plasmodium vivax / Figura 16: Análise da frequência de células CD8+CD56+ em relação ao nível de carga parasitária de Plasmodium vivax

44 CD4 Granulosidade CD4 # de eventos Marcadores de ativação Análise da expressão de HLA-DR em monócitos e células T CD4+ Os monócitos e linfócitos T CD4+ também foram analisados, em relação à expressão em HLA-DR, que indica o estado de ativação das mesmas. Essas células foram selecionadas a partir de uma janela de tamanho e granulosidade (Figura 17A), da qual foram separadas as populações de CD14+ e CD4+ (Figura 17B). A expressão de HLA-DR em células CD14+ (monócitos) foi analisada pela variação na média de fluorescência (figura 17C) enquanto que o número de linfócitos T CD4+ ativados foi medido através do aumento relativo nas frequências de células CD4+HLA-DR+ em indivíduos controle, agudos e tratados (Figuras 17D, E e F, respectivamente). A B C FL - HLADR Tamanho CD14 HLADR D E F HLADR HLADR HLADR Figura 17: Expressão do marcador HLA-DR em monócitos (CD14+) (C) e linfócitos T CD4 + em indivíduo controle (D), agudamente infectado pelo Plasmodium vivax (E) e após o tratamento (F). Em (C), as linhas representam as médias da intensidade de fluorescência (MIF) do HLA-DR em monócitos, nos grupos analisados. A linha preta representa a média do grupo controle, a vermelha, o grupo agudo e a azul, média do grupo tratado.

45 FREQUÊNCIA RELATIVA (%) MÉDIA DE FLUORESCÊNCIA 44 Em relação à população de monócitos, houve uma tendência de aumento na expressão HLA-DR tanto nos grupos agudo e tratado quando comparados ao controle (Figura 18), porém esta diferença não se mostrou significante. Já em relação à população de T CD4+ ocorreu um aumento significante na freqüência de células CD4+HLADR+ nos indivíduos agudamente infectados em comparação aos controles e tratados (Figura 19) CONTROLE AGUDO TRATADO Figura 18: Expressão do marcador HLA-DR em monócitos (CD14+) nos grupos controle, agudo e tratado. As barras horizontais representam as medianas de fluorescência em cada grupo. 40 * * CONTROLE AGUDO TRATADO Figura 19: Freqüência de células T CD4+HLADR+ nos grupos controle, agudo e tratado. As barras horizontais representam as médias do percentual de células em cada grupo.*p<0,05 (F= 9,681/ p = 0,0002).

46 45 Análise da expressão de CD25 em células T CD4+: Células T ativadas e regulatórias As células T regulatórias (Treg) podem ser identificadas no sangue periférico de indivíduos sadios e infectados. Um exemplo representativo pode ser observado na figura 20, onde a partir de uma janela de leucócitos (A) são selecionadas células T CD4+ (B) que posteriormente são plotadas em função da expressão de CD25 e CD127 em indivíduos controle (C), agudamente infectados (D) e tratados (E). Percebe-se que as células T CD4+ regulatórias são caracterizadas pela alta expressão de CD25+ e baixa expressão de CD127 (CD127 low ) enquanto que células T CD4+ ativadas expressam altas quantidades de CD25+ e de CD127 (Figura 20). Em relação à freqüência de CD4+CD25+ totais, observou-se um aumento significante no grupo agudo, em relação aos tratados e controles (Figura 21) Figura 20: Expressão dos marcadores CD25 e CD127 por linfócitos T CD4 + em indivíduo sadio (C) e indivíduo agudamente infectado pelo Plasmodium vivax (D) e após o tratamento (E).

47 FREQUÊNCIA RELATIVA (%) * * CONTROLE AGUDO TRATADO Figura 21: Frequência de células CD4+CD25+ nos grupos controle, agudo e tratado. As barras horizontais representam as médias do percentual de células em cada grupo. * p<0,05 (F = 33,14/ p = 0,0320). Através da análise da expressão exclusiva de CD25 em células T CD4+ não é possível diferenciar o pool de células ativadas do pool de células Treg. Neste sentido, foi usado o marcador CD127, para que estas subpopulações fossem evidenciadas e separadas. Observou-se uma maior freqüência de células T CD4+ ativadas (CD4+CD25+CD127 High ) no grupo agudo em relação aos tratados e controles, sendo esta diferença significante (Figura 22). Já as células Treg (CD4+CD25+CD127 low ), por sua vez, também foram mais frequentes durante a fase aguda, com grande redução após o tratamento (Figura 23).

48 FREQUÊNCIA RELATIVA (%) FREQUÊNCIA RELATIVA (%) * * * CONTROLE AGUDO TRATADO Figura 22: Freqüência de células CD4+CD25+CD127 High (ativadas) nos grupos controle, agudo e tratado. As barras horizontais representam as médias do percentual de células em cada grupo. *p<0,05 (F = 21,50/ p<0,0001) 25 * * CONTROLE AGUDO TRATADO Figura 23: Freqüência de células CD4+CD25+ CD127 low (Treg) nos grupos controle, agudo e tratado. As barras horizontais representam as médias do percentual de células em cada grupo.*p<0,05 (F = 8,449/ p = 0,0006) Foi realizada uma correlação entre as frequências de células ativadas (CD127 high ) e Treg (CD127 low ) com a parasitemia dos indivíduos do grupo agudo. A análise apontou uma correlação positiva entre o percentual de células ativadas e o grau de parasitemia, indicando que existe um aumento na ativação celular à medida que ocorre aumento da parasitemia (Figura 24), porém apesar do aumento, os dados não foram estatisticamente significantes. Surpreendentemente, em relação às Tregs, não foi observada nenhuma relação do aumento dessas células com o aumento da

49 FREQUÊNCIA RELATIVA (%) FREQUÊNCIA RELATIVA (%) 48 parasitemia, visto que os indivíduos com uma cruz apresentaram frequências menores dessas células em relação aos indivíduos com carga parasitária meia e duas cruzes (Figura 25). Entretanto, a análise estatística não mostrou diferenças significativas entre os grupos, talvez devido à heterogeneidade na frequência destas células em função da parasitemia / Figura 24: Frequência de células ativadas (CD4+CD25+CD12 high ) em relação a carga parasitária dos indivíduos do grupo agudo. As barras horizontais representam as médias do percentual de células em cada grupo / Figura 25: Análise da frequência de células T regulatórias (CD4+CD25+CD127 low ) em relação a carga parasitária dos indivíduos do grupo agudo. As barras horizontais representam as médias do percentual de células em cada grupo.

50 Dinâmica da expressão de marcadores de ativação e regulação antes e após o tratamento Neste estudo, parte dos indivíduos infectados foi analisada antes e após o tratamento antimalárico para verificar a dinâmica da expressão de marcadores de ativação, bem como o surgimento de células T regulatórias ao longo do ciclo da doença. Assim, o sangue foi coletado na fase aguda antes do tratamento e 7 dias após o mesmo. O número de indivíduos de cada grupo variou conforme o parâmetro analisado, de acordo com a marcação de anticorpos utilizada. Assim, para a análise das células CD8+, CD8+CD56+, o n foi de 5 indivíduos; para CD8+CD161 high, n = 4; para a análise da expressão de HLA-DR em CD14+ e CD4+, o n foi de 6 indivíduos, o mesmo n foi utilizado para a análise da ativação e regulação com o uso dos marcadores CD25 e CD127. Os resultados desta etapa do estudo estão sumarizados na Tabela 3. Tabela 3: Distribuição das médias e desvios-padrão das subpopulações celulares em indivíduos analisados na fase aguda e após o tratamento com antimaláricos. Subpopulações celulares Grupos Agudo Tratado p Média ± DP Média ± DP CD8+ 5,7±1,5 5,7±0,8 0,0981 CD8+CD161 high 4,5±1 9,3±4,9 0,0191 CD8+CD56+ 13,0±5,6 11,6±5 0,0054 CD4+HLA-DR+ 14,7±5 7,1±2,4 0,0417 CD14+ 5,6±3,5 3,8±1,5 0,2056 CD4+CD25+ 16,1±5 14,3±1,7 0,0976 CD4+CD25+CD127 High (Ativadas) 9,1±3,1 7,4±1,9 0,0261 CD4+CD25+CD127 Low (Treg) 6,9±2,9 6,8±1,4 0,0459 Em relação à frequência de células T CD8+, em três, dos cinco indivíduos analisados, ocorreu um pequeno aumento dessas células na fase aguda, seguido da diminuição na fase tratada. Apesar disso, os valores encontrados, quando analisados estatisticamente, não apresentaram diferenças significativas (Figura 26).

51 FREQUÊNCIA RELATIVA (%) FREQUÊNCIA RELATIVA (%) AGUDO TRATADO Figura 26: Freqüência de células T CD8+ em indivíduos na fase aguda e após o tratamento. Em relação à frequência de células CD8+CD161 High, apenas quatro indivíduos foram analisados, em três deles, verificou-se uma tendência de aumento desta população após o tratamento antimalárico (Figura 27). A análise estatística desses dados indicou que existem diferenças significantes antes e após o tratamento (p=0,0191). Em relação à frequência de células CD8+CD56+, cinco indivíduos foram avaliados antes e depois do tratamento, em quatro houve uma diminuição na maioria frequência celular, porém esta redução não foi significante (Figura 28). CÉLULAS CD8+CD AGUDO TRATADO Figura 27: Freqüência de células CD8+CD161 high em indivíduos na fase aguda e após o tratamento. (p=0.0191).

52 MÉDIA DE FREQUÊNCIA FREQUÊNCIA RELATIVA (%) AGUDO TRATADO Figura 28: Freqüência de células CD8+CD56+ em indivíduos na fase aguda e após o tratamento. Em relação à expressão de HLA-DR em células CD14+, verificou-se que, nos seis indivíduos analisados, a média de fluorescência esteve mais alta durante a aguda em comparação com o período pós-tratamento, sendo esta redução significante (p=0,0273) AGUDO TRATADO Figura 29: Expressão do marcador HLA-DR em células CD14+ (monócitos) em indivíduos na fase aguda e após o tratamento (p=0,0273). Em relação à frequência de células T CD4+HLA-DR+, nos seis indivíduos estudados, observou-se uma maior freqüência durante a fase aguda com posterior diminuição na fase tratada, em todos os indivíduos analisados (Figura 30) sendo esta redução significante (p=0,0417).

53 FREQUÊNCIA RELATIVA (%) FREQUÊNCIA RELATIVA (%) AGUDO TRATADO Figura 30: Freqüência de células CD4+HLA-DR+ em indivíduos na fase aguda e após o tratamento (p=0,0417). Em relação à frequência de células T CD4+CD25+ totais, houve uma grande variação, em metade dos indivíduos (n = 3) houve queda percentual da fase aguda para a fase tratada, na outra metade (n = 3), ocorreu um aumento de células T CD4+CD25+ celular na fase tratada (Figura 31). Apesar disto, não foram encontradas diferenças estatísticas significantes entre os grupos AGUDO TRATADO Figura 31: Freqüência de células CD4+CD25+ em indivíduos na fase aguda e após o tratamento. Em relação à frequência de células T CD4+CD25+CD127 High (células ativadas), ocorreu um aumento dessas células, em quatro indivíduos, na fase aguda da doença com posterior diminuição na fase tratada. Apenas em dois indivíduos essa tendência não pode ser verificada, visto que houve um aumento na frequência

54 FREQUÊNCIA RELATIVA (%) FREQUÊNCIA RELATIVA (%) 53 dessas células após o tratamento (Figura 32). Apesar disso, foram verificadas diferenças estatísticas antes e após o tratamento (p=0,0261) AGUDO TRATADO Figura 32: Freqüência de células T CD4+CD25+CD127 high (células ativadas) em indivíduos na fase aguda e após o tratamento (p=0,0261). Em relação à frequência de células T reguladoras, o perfil foi bastante heterogêneo, sendo que em alguns indivíduos (n = 2) houve aumento da frequência após o tratamento e em outros houve redução (n = 4) (Figura 33). A análise deste parâmetro não resultou em diferença estatística entre os grupos avaliados AGUDO TRATADO Figura 33: Freqüência de células T regulatórias (CD4+CD25+CD127 low ) em indivíduos na fase aguda e após o tratamento.

55 54 5 DISCUSSÃO Análise epidemiológica No Brasil, a malária continua sendo um grave problema de Saúde Pública, principalmente na região Amazônica. A alta incidência da doença e os efeitos debilitantes causados nas pessoas por ela acometidas são importantes fatores que podem influenciar o próprio desenvolvimento da região. Nos últimos anos, o Ministério da Saúde, em parceria com os Estados e Municípios, tem intensificado as ações de controle da malária em toda Amazônia Legal, alcançando resultados positivos. Apesar desses avanços, a elevada a incidência da malária e a persistência de fatores predisponentes, ambientais e socioeconômicos exigem o permanente aperfeiçoamento dos programas de controle a esta patologia (BRASIL, 2004). O Maranhão é um Estado possuidor de condições ambientais favoráveis à transmissão da doença, com uma realidade desafiadora, ocupação desordenada do ambiente e presença de uma população migrante de garimpeiros, madeireiros e agricultores, vivendo em habitações precárias e em condições favoráveis para o mosquito vetor. Em nosso Estado a transmissão da malária ainda é bastante variável e as medidas de controle devem continuar a ser executadas. A distribuição geográfica dos casos nas áreas de transmissão é o resultado do processo de urbanização recente e desordenado, gerando desequilíbrios no ecossistema natural, o que favorece o incremento do número de criadouros de vetores e maior chance de infecção (SILVA et al., 2009). A análise da distribuição dos casos por sexo acometido, percebemos que a maior parte dos casos ocorreu no sexo masculino com transmissão no próprio Estado (90%). Esse resultado sugere que, como é o sexo masculino que tem maior envolvimento em atividades como o garimpo e extração de madeira, tornam-se mais susceptíveis à infecção pela malária no perímetro extra-domicílio que o sexo feminino. Esse achado corrobora com os dados de um levantamento feito pelo Ministério da Saúde em 2009, onde são comparados os anos de 2003 e 2008, onde verificou-se que o sexo masculino também foi o mais acometido pelo parasita. Ramos (2006), em seu estudo sobre os aspectos epidemiológicos e clínicos da malária caudada por P. vivax na pré-amazônia, também encontrou o sexo masculino (93%) como sendo o mais acometido pela infecção malárica (BRASIL, 2004;

56 55 RAMOS, 2006). Ribeiro e colaboradores (2005), em um estudo realizado no Residencial Paraíso no Estado do Maranhão, encontraram também maior predomínio do sexo masculino sobre o feminino (RIBEIRO et al., 2005). Em relação à procedência desses indivíduos, constatou-se que a maior parte era do interior do Estado. Neste sentido pode-se imaginar que os indivíduos que residem no interior estão em áreas com maior susceptibilidade para a contaminação, ou seja, com maior quantidade de fatores ambientais e econômicos predisponentes à disseminação da doença, tais como a existência de domicílios de pau-à-pique, cujos banheiros e as instalações sanitárias situam-se no quintal das casas e que utilizam a fossa negra como destino final dos dejetos (SILVA et al., 2009). Em relação à origem da contaminação, a maioria dos casos avaliados no nosso estudo foi autóctone, o que também é descrito no relatado do Ministério da Saúde para a área da Amazônia Legal, território o qual o Maranhão faz parte. Ramos (2006) também analisou a procedência dos indivíduos infectados e encontrou apenas 7,8% dos casos como sendo importados de outros Estados ou países, cerca de 92% eram autóctones, corroborando com o nosso achado (RAMOS, 2006). Ribeiro e colaboradores (2005) observaram que, dos 26 casos registrados em 1999, 14 (52,8%) foram autóctones e 12 (46,15%), importados. No ano 2000, houve 85 (91%) casos autóctones e 8 (8,6%) importados. Em 2001, 100% dos casos tiveram origem na localidade (RIBEIRO et al., 2005). Ao investigar-se a espécie de plasmódio contaminante, foi observada a prevalência do Plasmodium vivax, fato que concorda com os achados da literatura para o Estado do Maranhão, que indicam esta espécie como a mais incidente. Este perfil assemelha-se ao observado na região da Amazônia Legal. Segundo o levantamento de 2009, do Ministério da Saúde, esta espécie também foi a responsável, em 2008, por 38% das internações por malária contra 29% por P. falciparum (BRASIL, 2008) Um questionário foi aplicado aos indivíduos infectados, onde se verificou que a faixa etária, com maior número de indivíduos acometidos foi a de 20 a 49 anos (n=28). Neste sentido, este estudo corrobora com os dados do Ministério da Saúde, onde em um levantamento feito em 2004 apontou que a faixa etária de 15 a 49 anos concentrou o maior percentual de casos (59%) (BRASIL, 2004). Ramos (2006) analisou também a faixa etária dos indivíduos infectados por malária e encontrou

57 56 que o grupo etário acima de 20 anos (65%) era o mais parasitado. Por outro lado, Ribeiro e colaboradores (2005), ao analisarem a faixa etária em um grupo de pessoas com malária, encontraram um perfil mais heterogêneo e diferente do encontrado em nosso estudo, pois a faixa etária de 5 a 24 anos concentrou 67 casos, enquanto que a faixa etária de 25 a 44 anos e dos indivíduos acima ou com idade igual a 45 anos, foram apenas 45 e 10 casos, respectivamente. Em relação à parasitemia, encontramos que, dos 26 indivíduos analisados na fase aguda, a maioria possuía parasitemia leve (uma cruz até 500 parasitos/mm 3 ) e moderada (duas cruzes até parasitos/mm 3 ). Apesar deste achado, não foram encontradas relações entre o grau de parasitemia e grau de severidade da doença nos indivíduos, já que a maioria deles referia apenas os sintomas comuns da doença, como febre, náuseas e cefaléia. No estudo de Ramos (2006), a mesma análise foi realizada, e a autora também não encontrou nenhuma correlação entre níveis mais elevados de parasitemia e a gravidade da malária causada pelo P. vivax, sugerindo que os indivíduos com maiores cargas parasitárias teriam como sintomas mais graves somente confusão mental e agitação (RAMOS, 2006). Análise fenotípica e funcional de células do sistema imune No presente trabalho, observou-se que a despeito da redução da frequência de células CD8+CD161 high nos grupos de malária aguda e tratada em relação aos controles, houve uma tendência de aumento nesta subpopulação quando os indivíduos foram analisados na fase aguda e após o tratamento (Figura 27). A análise da expressão de células de CD161 por células T CD8+ (fenótipo CD8+CD161 high ) foi realizada com intuito de verificar o aumento do números de células citotóxicas que apresentam este fenótipo, visto que em algumas patologias causadas, como a hepatite C observou-se uma correlação inversa entre a frequência de células CD8+CD161 high e a resposta virológica sustentada (PEREIRA, 2011). Por outro lado, em outras doenças causadas por patógenos como o Schistossoma mansoni e Entamoeba histolytica foi verificada uma relação positiva entre o número de células CD8+CD161 high e a morte dos mesmos (OYKHMAN e MODY, 2010). As células T CD8+ parecem ter importantes funções efetoras na imunidade préeritrocítica contra o plasmódio, por destruírem hepatócitos infectados, contribuindo

58 57 assim para a redução dos níveis de parasitemia e proteção contra malária grave, porém existem evidências que as mesmas possam também ter outras funções. Assim, foi proposto que estas células também teriam uma função imunossupressora durante a malária aguda, reduzindo assim o grau da resposta inflamatória (PERLMANN e TROYE-BLOMBERG, 2002). Foi analisada também a expressão de células CD56+ por células CD8+, marcador que indica uma subpopulação de células Natural Killer. Essas células são importante fonte de IFN- e estão envolvidas na ativação celular durante o estágio eritrocítico do ciclo evolutivo da malária (STEVENSON e RILEY, 2004). O estudo de Artavanis-Tsakonas e Riley (2002) demonstrou que as células NK são as primeiras a responder, in vitro, ao estímulo com eritrócitos infectados pelo plasmódio. Além disso, nesse mesmo estudo, esses autores verificaram que essas células são também responsáveis pelo estímulo precoce de IFN-, que acontece em média 6h após a infecção pelo parasito. Em nosso estudo, encontramos que tanto o grupo agudo (12,6%) como o tratado (12%) apresentaram frequências significantemente maiores quando comparados aos controles (7,6%). Esse dado se assemelha ao obtido por Roetynch e colaboradores (2006), que também encontraram níveis elevados de células NK circulantes em crianças infectadas por malária. Neste estudo houve uma correlação entre o aumento na frequência com o grau de parasitemia dos indivíduos infectados (ROETYNCH et al., 2006). Com base neste trabalho e nos resultados aqui apresentados, podemos imaginar que quanto maior for o nível de parasitemia dos indivíduos (estímulo) maior será a ativação do sistema com consequente aumento no número de células NK para combater o patógeno. Para que a ativação celular durante a infecção por malária ocorra de modo mais eficaz, linfócitos T CD4+ e CD8+ específicos devem ser ativados para que possam se tornar células efetoras que vão atuar nos estágios sanguíneo e hepático do ciclo do parasito, respectivamente. Assim, essas células são essenciais para a proteção contra esta doença, tanto em modelos humanos como animais, protegendo o indivíduo contra a malária grave (PERLMANN e TROYE-BLOMBERG, 2002). Para medir os níveis de ativação de linfócitos e monócitos foi utilizado o marcador HLA-DR (MHC de classe II). Verificou-se um aumento significante de células T CD4+HLA-DR+ em indivíduos na fase aguda da malária em relação aos indivíduos controle e tratados. Analisando a expressão desse mesmo marcador na população de monócitos (células CD14+), observou-se um aumento na média de

59 58 fluorescência, que reflete a expressão de HLA-DR, nos grupos agudo e tratado, quando comparados aos controles estudados. Bueno e colaboradores (2008), em um estudo sobre a patologia da malária, observaram a diferenciação de células dendríticas de indivíduos agudamente infectados, na presença do antígeno Pv-AMA- 1, apontando para um aumento da expressão de HLA-DR nas células dendríticas. Esse resultado demonstra que a diferenciação dessas células na presença do antígeno de P. vivax, de fato, resulta em uma ativação celular que pode estar diretamente envolvida com o processamento e a apresentação do antígeno, ou seja, com a efetivação da resposta imune (BUENO et al., 2008). Em conjunto, os resultados obtidos sugerem que uma parcela dos monócitos e linfócitos T CD4+ circulantes de indivíduos infectados são ativados durante a resposta imune, o que facilitaria a diferenciação em macrófagos e células dendríticas e linfócitos T CD4+ auxiliares nos tecidos. Outro marcador de ativação celular é a molécula CD25, que é a cadeia alfa do receptor para IL-2, citocina que induz a proliferação celular. Este marcador é expresso em linfócitos T após o estímulo do TCR junto com coestimulação. No nosso estudo, ao analisarmos a expressão de CD25 em linfócitos T CD4+, observamos um aumento significante na frequência desse marcador no grupo agudo, quando comparado aos demais grupos estudados. Estes dados corroboram com os dados da literatura que indicam haver grande ativação do sistema imune em indivíduos infectados pelo plasmódio, juntamente com o aumento da expressão de outros marcadores de ativação como HLA-DR, CD69 e CD71 em células efetoras (ROETYNCK et al., 2006). Porém a expressão exclusiva de CD25 não indica que as células estejam ativadas, visto a subpopulação de células CD4+CD25+ que expressam também o fator nuclear Foxp3 são classificadas como regulatórias e possuem uma função supressora. Neste sentido, fez-se necessária a discriminação das células T CD4+CD25+ em ativadas e regulatórias através da detecção da expressão de CD127. Esta molécula, que é a cadeia alfa do receptor de IL-7, pode ser usado para se distinguir células ativadas e regulatórias. Assim T CD4+CD25+ com alta expressão de CD127 (CD4+CD25+CD127 high ) são células ativadas enquanto que células com baixa expressão de CD127 (CD4+CD25+CD127 low ) possuem um fenótipo regulatório (Treg). A ligação da IL-7 ao seu receptor de alta afinidade, o CD127 resulta em um aumento da regulação de moléculas anti-apoptóticas e no aumento da sinalização

60 59 mediada pelo TCR, ativando novas células T e aumentando a proliferação pela secreção de IL-2 (DUNHAM et al., 2008). Por meio da utilização do CD127, pode-se também distinguir populações de células ativadas (recém-ativadas) e de células Tregs, pois apenas as Tregs apresentam baixa expressão de CD127, enquanto que as células recém-ativadas apresentam alta expressão desse marcador (SEDDIKI et al., 2006; LIU et al., 2006). No presente trabalho observou-se um aumento de células T CD4+CD25+ ativadas (CD127 high ) e regulatórias (CD127 low ) em indivíduos infectados durante a fase aguda da doença em comparação aos controles e aos tratados. As células Treg exercem uma supressão na ativação do sistema imune, quando do aumento excessivo da ativação do mesmo em resposta ao parasito evitando assim uma reposta exagerada que por si só pode provocar patogenia. No estudo realizado por Bueno e colaboradores (2010), comparou-se a frequência de Treg de indivíduos infectados com malária com controles sadios, onde foi encontrado um aumento significante destas células (BUENO et al.,2010). Outro dado analisado em nosso estudo foi a correlação entre a frequência de células ativadas e Treg com a parasitemia instalada no paciente agudamente infectado. Observou-se que quanto maior era a carga parasitária, maior era a ativação do sistema (Figura 24). Indivíduos com carga parasitária de duas cruzes, que corresponde a parasitos/mm 3 de sangue e a uma parasitemia moderada, apresentaram maiores frequências de células ativadas, quando comparados aos grupos meia e uma cruz de parasitemia. O mesmo, porém, não ocorreu com a frequência de células Treg, onde ocorreu um aumento no grupo meia cruz (200 a 300 parasitos/mm 3 ), seguido de uma baixa no grupo uma cruz (301 a 500 parasitos/mm 3 ), com novo aumento, no grupo de duas cruzes de parasitemia. Esta comparação, no entanto, deve ser analisada com cautela pois pode não ser representativa visto que no grupo de indivíduos com meia cruz de parasitemia havia apenas 3 indivíduos, número este muito baixo para uma conclusão. Em outro estudo realizado por Bueno e colaboradores (2010) verificou-se que a frequência de células Treg em indivíduos agudamente infectados pelo P. vivax foi diretamente proporcional ao nível parasitêmico dos indivíduos (BUENO et al., 2010). Neste sentido, outros trabalhos relatam que a expansão das células Treg durante a infecção está diretamente associada a um aumento parasitário, bem como com a demora na manisfestação da clínica da patologia malárica (LONG et al., 2003;

61 60 HISAEDA et al., 2004; AMANTE et al., 2007; NIE et al., 2007). Porém, embora haja essa correlação positiva entre o número de células Treg e carga parasitária, essa relação ainda não está totalmente esclarecida. É possível supor que as células Treg exerçam uma modulação nas células ativadas do sistema imune do hospedeiro, evitando assim maiores danos causados pelo próprio sistema imune, porém permitindo consequentemente, a sobrevivência e a multiplicação dos parasitas (BUENO, 2011). Dinâmica da expressão de marcadores de ativação e regulação antes e após o tratamento Como mostrado nos resultados, um grupo de indivíduos foi analisado tanto na fase aguda como após o tratamento. Idealmente, o estudo deveria ter sido feito desta maneira com todos os indivíduos, porém devido a grande dificuldade na obtenção das amostras de indivíduos infectados isso não foi possível. Em relação às células T CD8+, visto que as mesmas estão relacionadas com a imunidade protetora desenvolvida durante a fase hepática do ciclo do parasito, verificou-se que em relação células CD8+CD161 high ocorre um aumento das frequências na fase após o tratamento, considerando-se que estas células possam contribuir para padrão citotóxico de eliminação de células infectadas. Na análise das células CD8+CD56+, subpopulação de células NK, podemos perceber que, a maior parte dos indivíduos apresentam uma tendência de aumento dessas células na fase aguda com posterior diminuição na fase tratada. Como já visto, essas são as células envolvidas com o padrão de resposta precoce contra o estágio eritrocítico do ciclo do parasito. São elas que vão estimular a produção de uma citocina pró-inflamatória, o IFN-, estimulando a diferenciação, em conjunto com outras células e marcadores, da resposta do tipo Th1 (inflamatória) contra o plasmódio. A expressão do HLA-DR ocorre principalmente em células apresentadoras de antígeno como macrófagos, células dendríticas e linfócitos B, porém esta molécula também é descrita como marcador de ativação de linfócitos T, devido ao aumento em sua expressão nestas células durante a ativação linfocitária. (SALGADO et al., 2002). Em processos infecciosos agudos, como na infecção pelo Plasmodium falciparum também pode ser observado um aumento significativo na expressão de HLA-DR por células T CD4 +. Em relação à infecção por Plasmodium vivax, os

62 61 trabalhos que relacionam esta molécula são bastante escassos. Em nossa análise, verificou-se um aumento da frequência das células T CD4+ e CD14+ que expressam esse marcador de ativação durante a fase aguda da doença, com posterior diminuição na fase tratada, fato que pode ser esperado para este tipo de infecção. Os outros marcadores de ativação/regulação analisados foram o CD25 e o CD127. O CD25 começa a ser expresso em maior quantidade por linfócitos T e B no início da ativação, porém pode também ser expresso por outros tipos celulares como, monócitos e subpopulações de células dendríticas ativadas durante a malária. A ligação da IL-2 com este receptor promove a ativação, induz a entrada no ciclo celular e estimula a proliferação de linfócitos. Além disso, o CD25 é um marcador precoce de ativação, podendo ser detectado logo nas primeiras horas durante a infecção (de 2 a 8 horas) e sua expressão pode se manter por alguns dias, porém sua expressão também esta associada ao desenvolvimento de células T regulatórias (WALTHER et al., 2005). Assim, em relação ao Estado de ativação, o CD25, apresentou perfil bastante heterogêneo entre os indivíduos estudados, alguns indivíduos aumentaram na fase aguda e diminuíram após tratamento, e outros tiveram o perfil oposto com aumento na fase tratada. O mesmo aconteceu com o marcador CD127, porém nesta análise, a maior parte deles apresentou tendência de diminuição da frequência celular após a fase tratada. Os resultados obtidos neste trabalho sugerem que ocorre uma grande ativação nas células do sistema imune durante a infecção pelo Plasmodium vivax e que esta ativação do sistema é acompanhada por um aumento significante de células Treg. Este aumento de Tregs pode estar relacionado com a autoregulação do sistema imune, para que a resposta não seja excessiva, evitando assim uma patogênese causada pela própria resposta imunológica. De nosso conhecimento, este é o primeiro estudo imunofenotípico realizado com indivíduos infectados pelo Plasmodium vivax no Estado no Maranhão, onde foram analisados indivíduos durante a fase aguda da doença bem como após o tratamento. As condições de coleta e transporte das amostras de sangue dificultaram a realização deste estudo, o que permitiu que apenas um número limitado de pacientes fosse acompanhado ao longo da infecção e após o tratamento. Assim, acreditamos que novos estudos são necessários para complementar e estender os achados deste estudo inicial, possibilitando assim avaliar com maior precisão a dinâmica e o papel das células Treg durante a infecção e no

63 62 desenvolvimento patologia da doença. Apesar disso, acreditamos que os resultados aqui discutidos possam trazer informações valiosas para o entendimento desta infecção, que ainda hoje é um grande desafio para o desenvolvimento humano.

64 63 6 CONCLUSÃO Em relação à análise epidemiológica dos indivíduos infectados: A maioria era do sexo masculino na faixa etária de 20 a 49 anos de idade. A maior parte residia no interior do Estado, e o principal tipo de contaminação autóctone; A totalidade das infecções foram causadas pelo Plasmodium vivax e em apenas 1 caso (2,5%) houve infecção mista P.vivax + P. falciparum; Os níveis parasitêmicos de maior ocorrência foram de leve a moderado (uma a duas cruzes); Em relação à análise fenotípica dos indivíduos infectados e controles: Indivíduos tratados e agudos apresentaram menores frequências de células CD8+CD161 high quando comparados aos controles Um aumento na frequência de uma subpopulação de células NK (CD8+CD56+) foi verificada nos grupos agudo e tratado em relação aos controles. Indivíduos agudamente infectados apresentaram uma maior frequência de células T CD4+ ativadas (CD4+CD25+CD127 high ) e T regulatórias (CD4+CD25+CD127 low ) em relação aos tratados e controles. Existe correlação positiva, embora não significante, entre o grau de parasitemia dos indivíduos agudamente infectados com a frequência de células T CD4+ ativadas dos mesmos. Indivíduos do grupo agudo apresentam um aumento significante de células T CD4+CD25+ em relação aos controles e tratados. Ocorre aumento na frequência de células CD4+HLA-DR+ no grupo agudo quando comparados aos tratados e controles..

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74 APÊNDICES 73

75 APÊNDICE A - COMITÊ DE ÉTICA 74

76 75 APÊNDICE A CONTINUAÇÃO COMITÊ DE ÉTICA APÊNDICE B - TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

77 76 Termo de Consentimento Livre e Esclarecido Instituição: Centro de Universitário do Maranhão - UniCeuma Título do projeto: Caracterização fenotípica e funcional de células T regulatórias e sua correlação com aspectos clínico-epidemiológicos na infecção de malária causada por Plasmodium vivax Pesquisador: Ericka Miranda Mesquita Telefone: (098 ) erickamesquita@yahoo.com.br Ao assinar este termo, consinto livremente, após esclarecimentos prévios, em participar da pesquisa intitulada Caracterização fenotípica e funcional de células T regulatórias e sua correlação com aspectos clínico-epidemiológicos na infecção de malária causada por Plasmodium vivax, coordenado pelo professor doutor Marcos Augusto Grigolin Grisotto pela aluna de mestrado Ericka Miranda Mesquita. Estou ciente que o projeto visa caracterizar os aspectos clínicos, laboratoriais e epidemiológicos da malária causada por P. vivax para melhor entender a doença, a sua progressão e a melhor forma de tratamento. Minha participação nesta pesquisa restringe-se à entrevista, à doação de amostra de sangue e à obediência ao protocolo de tratamento que me será dado pelos médicos da equipe. O meu sangue será utilizado para realização de experimentos biológicos para avaliar parâmetros relacionados ao parasito causador da Malária. O sangue que eu doar será estocado para pesquisas futuras. Atesto, portanto, que entendi a proposta do projeto e concordo em participar da pesquisa doando amostras de sangue e cooperando com o tratamento. Atesto ainda que os pesquisadores garantiram que o meu tratamento será garantido mesmo que eu não concorde em responder o questionário ou doar as amostras de sangue para a pesquisa. Nome: Endereço: Assinatura: Pesquisador: Testemunha: Local: Data:

78 APÊNDICE C - QUESTIONÁRIO EPIDEMIOLÓGICO 77

79 ANEXOS 78

80 ANEXO A - Artigo submetido à revista Cadernos de Saúde Pública (B4) em 19/06/