PAINEL TEMÁTICO. Efeitos da suplementação de metionina protegida frente a resposta imune durante o período de transição

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1 Universidade Federal de Pelotas Faculdade De Veterinária Núcleo de Pesquisa, Ensino e Extensão em Pecuária PAINEL TEMÁTICO Efeitos da suplementação de metionina protegida frente a resposta imune durante o período de transição

2 DINÂMICA DO PAINEL Matheus Lopes M.V. Mestrando em Medicina Veterinária Ritieli dos Santos Teixeira Graduanda em Medicina Veterinária Francieli Dell Osbel Graduanda em Medicina Veterinária

3 INTRODUÇÃO O que é o período de transição? Período Crítico!

4 INTRODUÇÃO Alterações no estado endócrino e de imunossupressão Dimimuição de IMS Balanço energético negativo

5 INTRODUÇÃO Diminuição de IMS Alterações hormonais / Presença do feto Diminuição no aporte de carboidratos Demanda energética comprometida Mobilização de NEFA Principal fonte de energia

6 INTRODUÇÃO No pré-parto... NEFA Mobilização intensa de NEFA BHBA Glicerol + 3 ácidos graxos

7 INTRODUÇÃO No pós-parto... Glicose Vitaminas Cálcio Parto/Contrações/ Hipocalcemia Atividade de células de defesa

8 INTRODUÇÃO Redução da fagocitose Redução do número e da proliferação de linfócitos Maior ocorrência de enfermidades pósparto (Metrite, endometrite, mastite)

9 INTRODUÇÃO Baixos Níveis de Glicose Aumenta Níveis de Glucagon Redução da ingestão de matéria seca Lipólise Imunossupressão NEFA Redução da atividade de neutrófilos Redução da atividade de linfócitos Aumento do risco de mastite, retenção de placenta e metrite.

10 Introdução Deficiência na ingesta de proteína ou aminoácidos. Redução da ingestão de matéria seca Promissores na melhoria da saúde e prevenção de doenças infecciosas

11 ESSENCIAIS Aminoácidos NÃO-ESSENCIAIS ARGININA HISTIDINA ISOLEUCINA LEUCINA LISINA METIONINA FENILALANINA TREONINA TRIPTOFANO VALINA ALANINA ASPÁRTICO ASPARAGINA GLUTÂMICO GLUTAMINA CISTEÍNA GLICINA PROLINA SERINA TIROSINA GONZÁLES E SILVA. 2006

12 INTRODUÇÃO Alternativas Nutricionais Colina Vitamina Complexo B Presente em membranas celulares Sinalização celular Atua na absorção intestinal de lipídeos Estimula o processamento de lipídeos dentro do enterócitos: VLDL Metionina AAcontendo enxofre; Substrato para antioxidantes; Estimula o processamento de lipídeos dentro do enterócitos: VLDL Funções Imunitárias.

13 INTRODUÇÃO Alternativas Nutricionais Smartamina M : revestimento sensível ao ph, o qual é considerado possuir uma biodisponibilidade de Met de 80% ReaShure contém 28,8% de cloreto de colina e é protegido por microencapsulação. Considera-se que o produto tem biodisponibilidade de CHOL de 72%

14 ARTIGO 1 M ET I O N I NA P R OT E G I DA É M E LH O R DO Q U E C O LINA PA RA M O DU LA ÇÃ O DO S TAT U S M E TA B Ó LICO EM VA C A S LE I T E I R A S NO P E R I PA R TO.

15 OBJETIVO EFEITOS Metionina Colina Concentrações de biomarcadores no plasma, tecido hepático e leite Função das células polimorfonucleares

16 MATERIAIS E MÉTODOS Grupo 4 (n=12) CON + MET + CHOL Grupo 3 (n=12) CON + CHOL (60 gr) Grupo 2 (n=12) CON + MET (0,08%) Grupo 1 (n=12) CONTROLE -50 Pré-Parto -21 Inicio dos tratamentos 0 Pós-Parto 30 1,40 Mcal El/Kg MS 1,52 Mcal El/Kg MS 1,71 Mcal/Kg MS

17 MATERIAIS E MÉTODOS Pré-Parto Pós-Parto Dieta fornecida uma vez ao dia, às 6:30. Dieta fornecida uma vez por dia e ordenhadas 3 vezes por dia. Ajuste da dieta ( 10% de recusas).

18 MATERIAIS E MÉTODOS Tratamentos

19 MATERIAIS E MÉTODOS Creatinina; Bilirrubina; Ureia; AST, GGT; Colesterol, PON; Albumina; Ceruloplasmina, Haptoglobina, Mieloperoxidase, ROM Fagocitose de neutrófilos e monócitos e análise de capacidade oxidativa. Analises Estatísticas: Procedimento MIXED de SAS; Glutationa

20 RESULTADOS E DISCUSSÃO

21 RESULTADOS E DISCUSSÃO Metionina Inflamação Albumina Haptoglobina IL-6 IL-1 Estresse oxidativo Função hepática Colesterol Paraoxanase Glutationa Redução de glutationa

22 RESULTADOS E DISCUSSÃO Colina Inflamação Albumina Haptoglobina IL-6 IL-1 Estresse oxidativo Função hepática Colesterol Paraoxanase Glutationa Redução de glutationa

23 RESULTADOS E DISCUSSÃO COLESTEROL (mmol/l) Melhor função hepática; MET agente lotrófico; Com Met Sem Met Biomarcadores da função hepática P= 0.11 Dias em relação ao parto

24 PARAOXANASE )G/L) RESULTADOS E DISCUSSÃO Biomarcadores da função hepática Proteína de fase aguda, melhor função hepática; P=0.07 Vacas suplementadas com MET níveis de colesterol e paraoxanase = função hepática. Com Met Sem Met Dias em relação ao parto

25 HAPTOGLOBINA (G/L) RESULTADOS E DISCUSSÃO Biomarcadores da inflamação Com Met Sem Met Proteína de fase aguda +; P=0.08 Estado inflamatório menos pronunciado. Dias em relação ao parto

26 ALBUMINA (G/L) RESULTADOS E DISCUSSÃO Biomarcadores da inflamação Proteína de fase aguda + (Principal); haptoglobina + Albumina= estado inflamatório mesmo pronunciado P= 0.04 Dias em relação ao parto

27 RESULTADOS E DISCUSSÃO Citocina pró inflamatória, media uma variedade de resposta ao hospedeiro á infecção e inflamação. P=0.14 Dias em relação ao parto

28 RESULTADOS E DISCUSSÃO Importância na resposta inflamatória; A IL-1 a Haptoglobina, bem como a albumina e IL-6= estado inflamatório menos pronunciado P=0.03 Dias em relação ao parto

29 GLUTATIONA TOTAL RESULTADOS E DISCUSSÃO Biomarcadores do estresse oxidativo Antioxidante endógeno; Capacidade de limpar os Mro e radicais livres; Biomarcador de doenças causadas por estresse oxidativos; P=0.01 Dias em relação ao parto

30 GLUTATIONA REDUZIDO RESULTADOS E DISCUSSÃO Essa da glutationa total e reduzida devido esse aumento do MRO e radicais livres, sugerindo que ela exerce um papel protetor contra estresse oxidadativo; P=0.01 Síntese deglutationa Dias em relação ao parto

31 FAGOCITOSE POR NEUTRÓFILOS RESULTADOS E DISCUSSÃO Estado imunológico; Fagocitose e capacidade oxidativa P=0.01 Dias em relação ao parto

32 CAPACIDADE OXIDATIVA RESULTADOS E DISCUSSÃO Fagocitose e capacidade oxidativa IL-6 = reservas de ca²; Glutationa. P=0.03 Dias em relação ao parto

33 CONCLUSÃO Colesterol, paraoxanase, haptoglobina, IL-1β e IL-6 albumina Metionina Função imune inata Não produziu efeito benéfico semelhante a Metionina colina Doadores de metil e relação Metionina X Colina

34 A suplementação com metionina ou colina protegida no rúmen durante o período de transição influenciando a resposta imune do sangue total em vacas leiteiras periparturientes

35 OBJETIVOS Avaliar o efeito da suplementação de metionina ou colina protegidas da degradação ruminal durante o período periparto na resposta imune de sangue total.

36 MATERIAIS E MÉTODOS 81 vacas Holandesas CON n=20 MET n=21 COL n=20 MIX n=21 Sem metionina e colina Metionina (0,08% de MS) Colina (60 g / d) Metionina + Colina

37 MATERIAIS E MÉTODOS Desafio LPS Capacidade de fagocitose e capacidade oxidativa Ex vivo

38 MATERIAIS E MÉTODOS Para este desafio o Comitê de Cuidados e Uso de Animais aprovou somente um subconjunto de 33 vacas multíparas Clinicamente saudáveis e livres de agentes inflamatórios Desafio LPS CON n=11 MET n=11 COL n=11 Sem metionina e colina Metionina (0,08% de MS) Colina (60 g / d)

39 MATERIAIS E MÉTODOS Sangue coletado da veia coccígea antes da alimentação matinal; parto -15 dias - 7 dias 2 dias 7 dias 20 dias

40 MATERIAIS E MÉTODOS Controle Dose Baixa Dose Alta 20 µl de meio Eagle 0 µg de LPS/mL de sangue 980 µl de sangue 20 µl de solução contendo 0,5 µg de LPS/mL Fisiológico 0,01 µg de LPS/mL de sangue 980 µl de sangue 20 µl de solução contendo 250 µg de LPS/mL Capacidade máxima de resposta 5 µg de LPS/mL de sangue 980 µl de sangue

41 MATERIAIS E MÉTODOS Plasma Analisado quanto a IL-1β e IL-6, mieloperoxidase e glicose.

42 MATERIAIS E MÉTODOS Capacidade de Fagocitose e Capacidade Oxidativa parto Desafio com bactérias enteropatogênicas Escherichia coli; Neutrófilos e monócitos 1 dia 4 dias 14 dias 28 dias

43 RESULTADOS Desafio LPS

44 Tabela 1. Efeito da suplementação de metionina e colina protegidas no rúmen sobre citocinas plasmáticas, mieloperoxidase (MPO) após 3,5 h de incubação Dieta LPS (µg/ml) Item 1 Controle Metionina Colina SEM Pré-parto IL-1β (pg/µl) 1,573 1,457 1, a 1,396 b 2,847 c IL-6 (pg/µl) 2,557 2,274 1, ,386 a 2,514 b 2,805 c MPO (U/L) Pós-parto P = 0,07 IL-1β (pg/µl) 1,660 a 1,220 b 1,404 ab a 1,212 b 2,870 c IL-6 (pg/µl) 2,564 2,236 2, ,162 a 2,630 b 3,480 c MPO (U/L) a-c Diferentes letras sobrescritas dentro de uma linha indicam diferença significativa entre os grupos (P < 0.05) 2 SEM = maior erro padrão da média P <0,01 P <0,01

45 Tabela 1. Efeito da suplementação de metionina e colina protegidas no rúmen sobre citocinas plasmáticas, mieloperoxidase (MPO) e glicose após 3,5 h de incubação Valor - p Item 1 Dieta LPS Dia Dieta x LPS Dieta x Dia LPS x Dia Dieta x LPS x Dia Pré-parto IL-1β (pg/µl) 0.80 < IL-6 (pg/µl) 0.46 <0.01 < < MPO (U/L) < Pós-parto IL-1β (pg/µl) 0.07 < < IL-6 (pg/µl) 0.82 <0.01 < <0.01 < MPO (U/L) < a-c Diferentes letras sobrescritas dentro de uma linha indicam diferença significativa entre os grupos (P < 0.05) 2 SEM = maior erro padrão da média

46 Tabela 1. Efeito da suplementação de metionina e colina protegidas no rúmen sobre citocinas plasmáticas, mieloperoxidase (MPO) e glicose após 3,5 h de incubação MATERIAIS E MÉTODOS 200 µl de sangue + 40µL de dihidrorodamina + 40 µl de bactérias marcadas com iodo-propídico Valor - p Item 1 Dieta LPS Dia Dieta x LPS Dieta x Dia LPS x Dia Dieta x LPS x Dia Pré-parto IL-1β (pg/µl) 0.80 < Incubados a 38,5ºC durante 10 minutos; IL-6 (pg/µl) 0.46 <0.01 < < MPO (U/L) < Células vermelhas lisadas com água MiliQ gelada e ressuspensas em solução de PBS; Glicose (m mol/l) 0.79 < Gli (m mol/l) Pós-parto IL-1β (pg/µl) 0.07 < < IL-6 (pg/µl) 0.82 <0.01 < <0.01 < Monócitos e neutrófilos foram marcados e por fim realizada citometria de fluxo. MPO (U/L) < Glicose (m mol/l) 0.19 < Gli (m mol/l) < a-c Diferentes letras sobrescritas dentro de uma linha indicam diferença significativa entre os grupos (P < 0.05) 1 Gli = consumo aparente de glicose 2 SEM = maior erro padrão da média

47 RESULTADOS Desafio LPS mostra a hipótese de que não houve baixa da resposta imune Pré-parto LPS X Dia, P = 0.73 LPS X Dia, P = 0.39 Pós-parto Figura Dias Relativos ao Parto

48 RESULTADOS Pré-parto Dieta x LPS, P=0.85 Dieta x LPS, P < 0.01 Pós-parto CO CON MET COL P = 0,07 Figura LPS (µg/ml de sangue)

49 RESULTADOS Pré-parto LPS x Dia, P < 0.01 LPS x Dia, P < 0.01 Pós-parto Figura 1. Dias Relativos ao Parto

50 RESULTADOS Capacidade de Fagocitose e Capacidade de Atividade Oxidativa

51 Fagocitose (%) RESULTADOS CON MET COL A suplementação com MET levou a maior % de células fagocíticas. Dieta, P=0,07 Dieta, P=0,03 Figura 3. Monócitos Neutrófilos

52 Explosão Oxidativa (%) RESULTADOS CON MET COL Dieta, P < 0,01 Dieta, P < 0,01 Figura 3. Monócitos Neutrófilos

53 Discussão Período de transição Imunossupressão Maior susceptibilidade à doenças infecciosas Estudo realizado em ex vivo

54 Discussão Estresse oxidativo Sistema Imune Inato Hiper-responsivo Gestantes Não lactantes Lactantes Não gestantes Prejudicial aos animais

55 Discussão Taurina Glutationa Resposta imune inata Efeitos prejudiciais ao animal

56 Discussão

57 CONCLUSÃO Período de Transição Imunossupressão Hiper-resposta

58 CONCLUSÃO Age no status oxidativo do animal

59 CONCLUSÃO Resposta sistêmica Age no status oxidativo do animal Funções antimicrobianas das células imunológicas

60 CONSIDERAÇÕES Embora os dois artigos se complementem, faltam informações quanto ao grupo MIX de ambos os estudos, na metodologia

61 Estudos realizados demonstraram que vacas leiteiras suplementadas com Metionina protegida da degradação ruminal, apresentaram aumento na eficiência imunológica. E VACAS DE CORTE? Osório et al., 2013 Peñagaricano et al., 2013 Osório et al., 2014 Wiltbank et al., 2014 Acosta et al., 2016 Zhou et al., 2017 Riboni et al., 2017

62 Resposta imune em novilhas de corte suplementadas com sal mineral Brasão Pampiano e Metionina protegida Smartamine M.

63 Hipótese Animais desafiados com vacinação para BoHV-5, previamente suplementados com Brasão Pampiano e Smartamine M apresentam melhora nos padrões das respostas imunológicas.

64 Variáveis Titulação de Anticorpos Neutralizantes Ex vivo: Expressão Gênica IL-2/IL-6/IL-10/IFN-γ In vitro: Expressão Gênica IL-2/IL-6/IL-10/IFN-γ

65 Etapa 1: Seleção dos Animais RAÇA IDADE PESO ECC COLETA 1: SORO + VERMÍFUGO 60 ANIMAIS BROMATOLOGIA SN BoHV + ELISA BVDV 48 ANIMAIS HOMOGÊNEOS SORONEGATIVOS BoHV/BVDV

66 Etapa 2: Definição dos Grupos GRUPO 1 GRUPO 2 GRUPO 3 GRUPO 4 N = 12 N = 12 N = 12 N = ,25±24,97 267,92±26,67 268,50±24,86 269,08±24,51 CONTROLE CONTROLE + VACINAÇÃO PAMPIANO + VACINAÇÃO PAMPIANO SMARTAMINE M + VACINAÇÃO

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71 Etapa 3: 60 Dias de Adaptação D0 D50 D60 29/11 18/01 31/01 IDENTIFICAÇÃO INDIVIDUAL PESO + ECC PESO + ECC 1ª VACINAÇÃO BoHV COLETA SORO + SANGUE PESO + ECC

72 Etapa 4: Protocolo de Vacinação D0 D21 D42 31/01 21/02 14/03 1ª VACINAÇÃO BoHV COLETA SORO + SANGUE PESO + ECC 2ª VACINAÇÃO BoHV COLETA SORO + SANGUE PESO + ECC 3ª VACINAÇÃO BoHV COLETA SORO + SANGUE PESO + ECC

73 SORO Análises Sorológicas CAPA LEUCOCITÁRIA In Vitro: Cultivo de Leucócitos PLASMA SANGUE TOTAL CAPA LEUCOCITÁRIA Análises Plasmáticas Ex Vivo: Isolamento de Leucócitos

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75 Ex vivo: 500 µl Sangue Total 500 µl Capa Leucocitária 500 µl Capa Granulócitos 500 µl Capa Linfócitos In vitro: Cultivo: Concanavalina A Cultivo: BoHV-5 Vivo Cultivo: BoHV-5 Inativado Cultivo: Controle de Células

76 Titulação de Anticorpos 1,6 Titulação de Anticorpos 1,4 1,2 1 LOG10 0,8 0,6 0,4 0, Grupos

77 Titulação de Anticorpos 120 Frequência Títulos % ,9 8-15, ,9 >32 Títulos CONTROLE PAMPIANO METIONINA

78 Obrigado!