Elucigene CF-EU2v1 Guia do software de análise

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1 Elucigene CF-EU2v1 Guia do software de análise Fabricado pela: Gen-Probe Life Sciences Ltd. Heron House Oaks Business Park Crewe Road Wythenshawe Manchester M23 9HZ Para Vendas, Assistência ao Cliente e Assistência Técnica: T: +49 (0) F: +49 (0) E: eucustomerservice@hologic.com E: eutechnicalsupport@hologic.com CF2EUGSPT Rev.10/2013 Página 1 de 35

2 Análise no GeneMapper Introdução A secção que se segue descreve os procedimentos para a análise de amostras dos resultados do Elucigene CF-EU2v1 utilizando os pacotes de software GeneMapper (versão 3.7 ou superior) da Applied Biosystems. Processo de análise O processo de análise de amostras é resumido no fluxograma abaixo. Executar amostras amplificadas no analisador genético Abrir software GeneMapper Adicionar ficheiros de amostras fsa ao projecto Definir método analítico e padrão de tamanho para CF-EU2v1 Seleccionar painéis de mistura adequados Executar análise da amostra Guardar projecto Seleccionar amostra e abrir janela do gráfico Rever dados dos traçados e do genótipo Classificar genótipos da amostra Imprimir traçados das amostras de Elucigene CF-EU2v1 CF2EUGSPT Rev.10/2013 Página 2 de 35

3 GeneMapper Abra o ficheiro do programa GeneMapper e importe os ficheiros fsa necessários clicando no botão add samples to project (adicionar amostras ao projecto) ( ). Navegue para a pasta de execução pretendida utilizando a árvore de pastas no lado esquerdo da janela. Seleccione a pasta e clique no botão Add to List >> (Adicionar à lista>>). A pasta de execução aparece agora na janela Samples to add (Amostras a adicionar). Se fizer duplo clique no ícone da pasta de execução nesta janela mostra todos os ficheiros FSA a importar (Figura 1). Figura 1: As amostras foram adicionadas à lista e estão prontas a adicionar ao projecto. De seguida, as amostras são adicionadas clicando no botão Add (Adicionar) ( ). Importação de definições de análise do CF-EU2v1 pelo GeneMapper no GeneMapper Manager É necessário importar as definições de CF-EU2v1 para o GeneMapper. Este processo é controlado através da interface do GeneMapper Manager. As definições do CF-EU2v1 para o GeneMapper são disponibilizadas no sítio Web da Gen-Probe: Estas devem ser transferidas para uma pasta adequada no sistema do utilizador. CF2EUGSPT Rev.10/2013 Página 3 de 35

4 1. Abra o programa GeneMapper Manager clicando no ícone (Figuras 2 e 3). Figura 2: Abertura do GeneMapper Manager. Figura 3: A interface do GeneMapper Manager. 2. Seleccione o separador Analysis Methods (Métodos analíticos) e clique depois no botão Import (Importar). 3. Navegue para os ficheiros de definição das análises CFEU2 necessários e importeos: 3130 ou 3500 (Figura 4). Figura 4: Importação dos métodos analíticos. CF2EUGSPT Rev.10/2013 Página 4 de 35

5 4. Repita o processo, seleccionando o separador adequado e importando os ficheiros correspondentes para: Table Settings (Definições da tabela) Plot Settings (Definições do gráfico) Size Standards (Padrões de tamanho) Nota: As Cluster Plot Settings (Definições cluster de gráficos), as Matrices (Matrizes), os SNP Sets (Conjuntos de SNP) e as Report Settings (Definições de relatório) não requerem a importação de ficheiros. Importação de definições do painel do CF-EU2v1 no Panel Manager (Gestor do painel) É necessário importar as definições do painel de CF-EU2v1 para o GeneMapper. Este processo é controlado através da interface Panel Manager (Gestor do painel). 1. Abra o programa Panel Manager (Gestor do painel) do GeneMapper clicando no ícone. 2. Clique em Panel Manager (Gestor do painel) na janela de navegação esquerda. O gestor do painel surge agora realçado a azul. 3. Seleccione File /Import Panels (Ficheiro/Importar painéis). Navegue para o ficheiro do painel CFEU2 GeneMapper Panels.txt e importe-o (Figura 5). 4. Clique em CFEU2 panel (Painel CFEU2) na janela de navegação esquerda. O painel CF-EU2v1 surge agora realçado a azul. 5. Seleccione File/Import Bin Set (Ficheiro/Conjunto Bin ). Navegue para o ficheiro Bin CFEU2 GeneMapper Panels.txt e importe-o (Figura 6). 6. Clique em Apply (Aplicar) e depois clique em OK. Figura 5: Importação do ficheiro do painel de CFEU2. CF2EUGSPT Rev.10/2013 Página 5 de 35

6 Figura 6: Importação do ficheiro do conjunto Bin do CFEU2. Modificação do ficheiro de parâmetros analíticos Pode ser necessário modificar os Analysis Ranges (Intervalos de análise) predefinidos nas definições analíticas do CF-EU2v1 para contemplar as suas condições durante a execução. O intervalo de análise mínimo depende do capilar e do polímero utilizados durante a recolha de dados. Para visualizar as suas definições de análise actuais: 1. Abra o GeneMapper Manager. 2. Seleccione o separador Analysis Methods (Métodos analíticos). O ficheiro de CF-EU2v1 importado estará indicado como CFEU2 Analysis Method (Método analítico CFEU2). 3. Clique em CFEU2 Analysis Method (Método analítico CFEU2). A linha fica agora realçada. 4. Clique no botão Open (Abrir) e seleccione o separador Peak Detector (Detector de picos) (Figura 7). Os intervalos analíticos estão predefinidos para começar a 1600 e terminar a Figura 7: Intervalos analíticos (realçados). CF2EUGSPT Rev.10/2013 Página 6 de 35

7 Para encontrar o intervalo analítico correcto para o seu laboratório: 1. Na janela principal do GeneMapper, faça duplo clique na pasta de execução importada para visualizar a lista de ficheiros fsa que contém. 2. Seleccione um ficheiro fsa. 3. Clicando no separador Raw data (Dados não tratados), surge um electroforograma dos dados não tratados. 4. Utilizando como guia o pico GS600v2 LIZ de 100 bp (Laranja), decida um ponto de dados aproximadamente 100 pontos de dados inferior (Figura 8). Figura 8: Determinação do intervalo mínimo utilizando dados não tratados das amostras. 5. Assegure-se de que o intervalo analítico máximo têm em conta aproximadamente 100 pontos de dados após o pico de GS600v2 LIZ de 600 bp. 6. Introduza os novos valores no ficheiro CF-EU2v1 Analysis (acedendo-lhe da forma descrita acima). Pode ser ainda necessário modificar os Peak Amplitude Thresholds (Limiares de amplitude dos picos) de acordo com a concentração da amostra. Amostras muito fortes apresentam um nível elevado de ruído de fundo, que pode interferir na análise. Para o evitar, pode aumentar-se o limiar de amplitude do pico. Por exemplo, o corante verde pode definirse para 100 em vez de 50. Mais uma vez, isto é feito no separador Peak Detector (Detector de picos) do CFEU2 Analysis method (CFEU2 Método analítico) (Figura 7). CF2EUGSPT Rev.10/2013 Página 7 de 35

8 Análise e genotipagem de ficheiros de CF-EU2v1 importados 1. Na janela principal do GeneMapper, seleccione CFEU2 Table Settings (Definições das tabelas) (Figura 9). Figura 9: Utilize o menu pendente para seleccionar as definições da tabela de CFEU2. 2. Na janela principal do GeneMapper, seleccione a primeira célula sob Analysis Method (Método analítico) e seleccione o método analítico adequado do menu pendente: CFEU2_3130 ou CFEU2_3500. Repita o processo para o padrão de tamanho seleccionando CFEU2 size standard (Padrão de tamanho CFEU2) do menu pendente. 3. Seleccione o painel CFEU2 para cada amostra (Figura 10). Para a mistura A seleccione o subpainel contendo a mistura A e para a mistura B seleccione o subpainel que contém a mistura B. 4. Clique em ícone para iniciar a análise da amostra. Figura 10: Selecção das definições do painel para CFEU2. Revisão dos dados dos traçados e do genótipo do CF-EU2v1 1. Seleccione Edit/Sort (Editar/Ordenar). Ordene as amostras por Sample Name (Nome da amostra) e clique em OK. 2. Clique para Display Plots (Apresentar gráficos). CF2EUGSPT Rev.10/2013 Página 8 de 35

9 3. Utilize o menu pendente para seleccionar as definições de gráfico apropriadas para CF-EU2v1: Para visualizar a mistura A com dados de Poli T, seleccione: CFEU2 Plot PT-on (Gráfico CFEU2 PT ligado) Para visualizar a mistura A sem dados de Poli T, seleccione: CFEU2 Plot PT-off (Gráfico CFEU2 PT desligado) Figura 11: Utilize o menu pendente para seleccionar as definições de gráfico para CFEU2. 4. A janela do gráfico mostra os dados dos traçados da amostra (Figura 12). 5. Recomendamos que a função Single click editing (Edição clique único) esteja activada na janela do gráfico. Para tal, seleccione Alleles/set click editing (Alelos/definir edição clique) e assegure-se de que esta opção está marcada. Figura 12: Janela do gráfico da amostra com representação dos dados dos traçados marcados. Elucigene CF-EU2v1 Mistura A Elucigene CF-EU2v1 Mistura B CF2EUGSPT Rev.10/2013 Página 9 de 35

10 Classificação dos picos de diagnóstico Cada indivíduo possui duas cópias do gene CFTR. Quando um determinado alelo possui a mesma sequência em ambas as cópias, diz-se que o indivíduo é homozigótico relativamente a este local. Se um determinado alelo possuir sequências diferentes em cada cópia, o indivíduo é considerado heterozigótico (Figura 13). A mistura A (mutante) determina se um indivíduo é portador de alguma mutação, o que é mostrado pela presença de um pico azul. A mistura mutante contém também iniciadores do alelo normal F508del, pelo que esta mistura consegue determinar se um indivíduo apresenta F508del normal (apenas pico verde), se é homozigótico para F508del (apenas pico azul) ou se é heterozigótico para este alelo (pico azul e pico verde). Se for observada qualquer outra mutação, a amostra pode ser amplificada com a mistura B (WT) para determinar se é homozigótica ou heterozigótica. A presença de um pico verde para um determinado alelo na mistura WT indica que o indivíduo é heterozigótico e a ausência de um pico verde indica que é homozigótico para aquela mutação em particular. Figura 13: Exemplos de a) indivíduo normal, b) indivíduo heterozigótico e c) indivíduo homozigótico para o alelo 711+1G>T A B C Indivíduos portadores de duas mutações diferentes são denominados heterozigóticos compostos (Figura 14). CF2EUGSPT Rev.10/2013 Página 10 de 35

11 A Figura 14: Exemplos de amostras heterozigóticas compostas. A) G85E/D1152H B) F508del/E60X B São incluídos dois marcadores STR hipervariáveis (vermelhos) em ambas as misturas. Isto permite a comparação entre a amostra amplificada com a mistura mutante e a amostra amplificada com a mistura WT para reduzir a probabilidade de as amostras serem confundidas (Figura 15). A ausência destes marcadores STR indica que a amostra falhou. A presença de marcadores STR com RFU muito baixas indica uma amostra fraca, que deve ser analisada com cautela. Figura 15: Gráficos da mistura A e da mistura B onde estão representados os dois marcadores STR para um indivíduo. CF2EUGSPT Rev.10/2013 Página 11 de 35

12 Os marcadores STR hipervariáveis podem ser ocultados desligando os dados relativos ao corante vermelho na janela do gráfico. A desactivação dos dados dos corantes azul e verde facilita a visualização dos marcadores STR. Designação dos marcadores no GeneMapper Quando se visualizam dados dos traçados analisados no GeneMapper, os picos de diagnóstico da mistura A são rotulados com o nome e o número do marcador. Os picos de diagnóstico da mistura B são rotulados apenas com o número do marcador. Os dados dos picos de um marcador detectado rotulado podem ser examinados de forma ainda mais profunda passando o cursor do rato sobre o rótulo do marcador pretendido, surgindo o nome do marcador, o tamanho do pico e a altura do pico no fundo da janela do gráfico das amostras. CF2EUGSPT Rev.10/2013 Página 12 de 35

13 A correlação entre os números dos marcadores e os marcadores é mostrada abaixo. Marcadores detectados N.º Marcador Marcador Intervalo de tamanho em bp do produto (dados 3130/POP7) 01 R347H R347P G>A G>A G>T R334W I507del F508del kb C>T delTA delT V520F L206W W1282X R560T delG Q890X R553X G551D S549R(T>G) S549N M1101K G542X insT Y1092X(C>A) S1251N delA kb A>G G>A R117H R117C N1303K Y122X delTT G85E R1066C G>A W846X delA D1152H CFTRdel2_ P67L delT E60X delC G A455E R1162X R1158X T* IVS8-5T T IVS8-7T T IVS8-9T CF2EUGSPT Rev.10/2013 Página 13 de 35

14 * Tamanhos de alelos 5T Marcador Intervalo de tamanho em bp do produto POP7/3130 5T (9) 117,25 118,75 5T (10) 119,25 120,75 5T (11) 121,25 122,75 5T (12) 123,25 124,75 5T (13) 125,25 126,75 Nota: Os intervalos de tamanho de cada marcador podem variar consoante o aparelho e o polímero utilizados. Marcador CF-EU2v1 di507del Devido à localização da deleção em I507 no gene CFTR, é possível detectar a presença deste marcador através de um desvio de 3 bp no tamanho do pico de F508del, assim como um pico específico da mutação I507del. Caso esteja presente um só alelo mutante I507del, o pico mutante que lhe corresponde será observado sob a forma de um pico azul a aproximadamente 159 bp. Será observado como presente um pico de estirpe selvagem para F508del, mas a altura do pico será cerca de metade da normalmente associada a um genótipo de estirpe selvagem homozigótico; este é observado sob a forma de um pico verde a cerca de 167 bp. Observar-se-á ainda um outro pico verde a cerca de 164 bp (Figura 16). Figura 16: Amostra heterozigótica para I507del. Uma amostra I507del/F508del produz um pico de estirpe selvagem verde para F508del desviado, a aproximadamente 164 bp (menos 3 bp que o normal), um pico mutante F508del azul a 166 bp e um pico mutante I507del azul a cerca de 159 bp. Uma amostra I507del/I507del resulta num pico azul a aproximadamente 159 bp e num pico verde único a cerca de 164 bp (3 bp inferior ao pico para F508del normal observado quando I507del não está presente). Há que notar que a presença de uma mutação F508del impede o iniciador de estirpe selvagem I507 de funcionar. Por conseguinte, indivíduos homozigóticos para F508del não possuirão um pico de estirpe selvagem I507 na mistura de estirpe selvagem e indivíduos heterozigóticos para F508del apresentarão um pico de estirpe selvagem I507 de altura reduzida na mistura de estirpe selvagem. Marcadores de Poli-T O Elucigene CF-EU2v1 contém iniciadores ARMS fluorescentes marcados com NED (amarelo) para a detecção de variantes IVS8-5T, IVS8-7T e IVS8-9T. A informação sobre CF2EUGSPT Rev.10/2013 Página 14 de 35

15 Poli-T de uma amostra pode ser determinada activando a visualização dos dados do corante amarelo nas definições de CF-EU2v1 do GeneMapper. Por conseguinte, o operador pode optar por visualizar estes dados se considerar que são necessários no âmbito do procedimento de análise do laboratório. Nota: Não existem iniciadores de Poli-T na mistura B, pelo que os produtos só serão visualizados em amostras de mistura A. Análise de Poli-T Os exemplos GeneMapper que se seguem exibem morfologias de picos características das regiões variantes de IVS8 testadas. Exemplo 1: Amostra IVS8-5T / IVS8-9T O exemplo que se segue mostra o resultado da mistura A observado utilizando as definições do gráfico CFEU2 Plot PT-on (Gráfico CFEU2 PT ligado). A remoção da informação sobre as cores verde e azul nas definições do gráfico para a mesma amostra revela claramente o marcador de Poli-T, que é mostrado abaixo. Exemplo 2: Amostra IVS8-7T / IVS8-7T CF2EUGSPT Rev.10/2013 Página 15 de 35

16 Exemplo 3: Amostra IVS8-7T / IVS8-7T (variabilidade da repetição de TG) Os dois picos devem-se à heterozigosidade da região de repetição de TG que se encontra no nosso produto da amplificação. Este efeito pode também ser observado em amostra homozigóticas com 5T e 9T. Por conseguinte, é possível determinar o número de repetições de TG dentro de cada variante de politimidina de IVS8. Exemplo 4: Amostra IVS8-9T / IVS8-9T Aviso importante Em certas condições de ensaio, é possível que artefactos observáveis de corantes interfiram com as análises de rotina. É importante que o utilizador tenha noção da possibilidade de interferência para garantir que analisa correctamente os dados. Os artefactos de corantes marcados podem ser observados sob a forma de pequenos picos azuis ou verdes. Estes artefactos dos corantes são geralmente de dimensão inferior a 100 bp e não costumam interferir com a análise de dados. Em condições normais, estes picos de artefacto são insignificantes relativamente aos verdadeiros picos do produto da amplificação e não causam problemas de análise. No entanto, quando a quantidade de produto da amplificação carregada é pequena, talvez devido a um ADN genómico limitante, os picos dos artefactos dos corantes surgem com uma dimensão relativamente maior, havendo a possibilidade de serem analisados como verdadeiros picos do produto da amplificação. CF2EUGSPT Rev.10/2013 Página 16 de 35

17 Análise no GeneMarker Introdução A secção que se segue descreve os procedimentos para a análise de amostras dos resultados do Elucigene CF-EU2v1 utilizando o pacote de software GeneMarker, versão 1.95, da SoftGenetics. Processo de análise O processo de análise de amostras é resumido no fluxograma abaixo. Executar amostras amplificadas no analisador genético Abrir software GeneMarker Adicionar ficheiros de amostras fsa ao projecto Seleccione devidamente o painel CF-EU2v1 e as definições de análise Executar análise da amostra Seleccione a aplicação: ARMS/Comparative Analysis (ARMS/Análise comparativa) Seleccione Mutant + Wild-type (Mutante + Estirpe selvagem) ou Mutant Only (Apenas mutante) Seleccione Print (Imprimir) Seleccione Preview (Pré-visualizar) CF2EUGSPT Rev.10/2013 Página 17 de 35

18 Adição de ficheiros de amostras ao GeneMarker Abra o ficheiro do programa GeneMarker e, quando lhe for solicitado, seleccione Open Data (Abrir dados). Surge a caixa Open Data Files (Abrir ficheiros de dados). Clique no botão Add. Surge a caixa de diálogo Open (Abrir). Navegue para o directório que contém os ficheiros dos dados não tratados Seleccione todos os ficheiros premindo as teclas CTRL+A ou use as teclas CTRL e/ou SHIFT para seleccionar amostras individuais. Clique no botão Open (Abrir) da caixa de diálogo Open Os ficheiros seleccionados surgem no campo Data File List (Lista de ficheiros de dados) (Figura 1). Clique no botão OK da caixa Open Data Files (Abrir ficheiros de dados) e as amostras são carregadas no GeneMarker. Em seguida, o software abre automaticamente a janela Raw Data Analysis (Análise de dados não tratados) (Figura 2). Figura 1: Amostras adicionadas à Data File List (Lista de ficheiros de dados). CF2EUGSPT Rev.10/2013 Página 18 de 35

19 Figura 2: Janela Raw Data Analysis (Análise de dados não tratados). Árvore de amostras Imagem do gel sintética Traçado dos dados não tratados Processamento de dados Depois de os ficheiros dos dados não tratados serem carregados no GeneMarker, estão prontos a ser processados. A etapa de processamento inclui a aplicação de um padrão de tamanho, da filtragem de picos de ruído e, caso se pretenda, a comparação com um painel alélico conhecido. O GeneMarker combina todas estas etapas numa ferramenta simples denominada Run Wizard (Assistente de execução) (Figura 3). Para aceder ao Run Wizard (Assistente de execução), basta clicar no ícone Run Project (Projecto de execução) na barra de ferramentas principal. Figura 3: Run Wizard (Assistente de execução) Janela Template Selection (Selecção de modelo). CF2EUGSPT Rev.10/2013 Página 19 de 35

20 Run Wizard (Assistente de execução) Janela Template Selection (Selecção de modelo) Crie um modelo CF-EU2v1 e seleccione o padrão de tamanho, a cor do padrão e as definições do tipo de análise adequados (conforme mostra a Figura 3). Seleccione o painel apropriado consoante a plataforma utilizado, por exemplo, CF- EU2v1_POP7. Estes são disponibilizados no sítio Web da Gen-Probe: Estas devem ser transferidas para uma pasta adequada no sistema do utilizador. Clique em Next (Seguinte) para continuar Run Wizard (Assistente de execução) Data Process (Processamento de dados) A janela Data Process (Processamento de dados) do Run Wizard (Assistente de execução) permite ao utilizador seleccionar os parâmetros de filtragem dos picos. Assegure-se de que as definições são seleccionadas da forma indicada na Figura 4 abaixo. Clique em Next (Seguinte) para continuar Figura 4: Run Wizard (Assistente de execução) Janela Data Process (Processamento de dados). NOTA: Para dados de 3500, aumente a intensidade mínima para 300. Run Wizard (Assistente de execução) Additional settings (Definições adicionais) Não são necessárias definições adicionais quando se efectua a análise CF-EU2v1. Clique em OK para continuar CF2EUGSPT Rev.10/2013 Página 20 de 35

21 Figura 5: Run Wizard (Assistente de execução) Additional settings (Definições adicionais). Caixa Data Processing (Processamento de dados) Depois de clicar em Ok na caixa Additional Settings (Definições adicionais) do Run Wizard (Assistente de execução), surge a caixa Data Processing (Processamento de dados) (Figura 6). Os dados não tratados estão a ser processados e medidos, depois são aplicados os parâmetros de filtragem e o painel CF-EU2v1 seleccionado é aplicado. Clique em OK na caixa Data Processing (Processamento de dados) quando a análise estiver concluída. Figura 6: Caixa Data Processing (Processamento de dados). CF2EUGSPT Rev.10/2013 Página 21 de 35

22 Janela de análise principal A janela de análise principal (Figura 7) do GeneMarker tem um esquema fácil de utilizar. Este esquema inclui: A lista de ficheiros das amostras apresentada no lado esquerdo da janela. A imagem do gel sintético apresentada no topo da janela. Electroforogramas dos dados por baixo da imagem do gel. Uma tabela de relatório apresentada no lado direito da janela. Nesta janela, é importante verificar se todos os picos apropriados de cada perfil foram chamados correctamente. Sequencialmente, faça duplo clique em cada amostra na árvore de ficheiros de amostras do lado esquerdo do ecrã. Clique com o botão direito do rato em todos os picos em causa e, escolhendo de entre as opções da caixa de diálogo, p. ex. editar ou eliminar alelo, confirme ou cancele consoante necessário. Quando um pico não tiver sido chamado por estar abaixo do limiar, pode atribuir-se manualmente um alelo. Seleccione o Marker (Marcador) apropriado da caixa pendente, mantendo a tecla Shift premida clique com o botão direito do rato no pico em questão, clique em Insert Allele (Inserir alelo) e depois clique em OK. Quando se analisam dados das misturas A e B em conjunto, é importante assegurar que todos os picos STR foram chamados. Concluído este processo para todas as amostras, pode passar-se à etapa seguinte da análise. Figura 7: Janela de análise principal. Árvore de ficheiros de amostras Imagem do gel sintética Electroforograma Tabela de relatório CF2EUGSPT Rev.10/2013 Página 22 de 35

23 Análise apenas de mutantes (mistura A) Na janela de análise principal, seleccione a opção de menu pendente Applications (Aplicações) no topo do ecrã. Seleccione ARMS/Comparative Analysis (ARMS/Análise comparativa) e, em seguida, Mutant Only (Apenas mutantes). Na caixa de diálogo ARMS/Comparative Print Settings (ARMS/Definições de impressão comparativa), seleccione Poly-T Analysis (Análise Poli-T) caso pretenda esta análise (Figura 8). Clique em Preview (Prever) na caixa de diálogo ARMS/Comparative Print Settings (ARMS/Definições de impressão comparativa) para visualizar o relatório Elucigene CF-EU2v1 Apenas Mutantes (Mistura A) (Figura 11). Nesta janela, o operador pode rever e imprimir cada um dos relatórios de amostras. Clique em OK na caixa de diálogo ARMS/Comparative Print Settings (ARMS/Definições de impressão comparativa) para imprimir o relatório Elucigene CF-EU2v1 Apenas Mutantes (Mistura A) (Figura 11) sem o rever. Figura 8: Caixa de definições ARMS/Comparative Print Settings (ARMS/Definições de impressão comparativa. Revisão do relatório Elucigene CF-EU2v1 Relatório apenas mutantes (Mistura A) Clique em Preview (Prever) na caixa de diálogo ARMS/Comparative Print Settings (ARMS/Definições de impressão comparativa) para visualizar o relatório Elucigene CF-EU2v1 Mistura A (Figura 11). Nesta janela, o operador pode rever e imprimir cada um dos relatórios de amostras. CF2EUGSPT Rev.10/2013 Página 23 de 35

24 Figura 11: Janela do relatório CF-EU2v1 apenas mutantes (Mistura A). O relatório Elucigene CF-EU2v1 inclui as seguintes características: Report Header (Cabeçalho do relatório): Contém informações acerca da análise, do projecto, da amostra e dos parâmetros. Signature Box (Caixa de assinatura): Data e espaço inicial para revisores do relatório. Electropherogram (Electroforograma): Semelhante à janela de ARMS/Comparative analysis (ARMS/Análise comparativa), apresenta todas as cores dos corantes do traçado da amostra. Report Table (Tabela de relatório): A tabela principal apresenta todas as mutações testadas por este kit. A presença ou ausência de uma mutação é indicada por um 1 ou um 0. Note-se que só é possível obter um relatório do estado de zigosidade completo para o locus F508 quando se analisa apenas a mistura A. A segunda tabela mostra o estado de Poli-T da amostra se esta função tiver sido seleccionada. Análise da mistura de mutantes + estirpe selvagem (A e B) Na janela de análise principal, seleccione a opção de menu pendente Tools (Ferramentas) no topo do ecrã e, de seguida, File Name Group Tool (Ferramenta de grupo de nomes de ficheiros). Isto abre o ecrã File Name Group Editor (Editor do grupo de nomes de ficheiros). Na caixa Compare by Section (Comparar por secção), escreva o número da coluna em que o nome da amostra aparece. Na caixa Match to Identifier by Section (Corresponder com identificador por secção), escreva o número da coluna em que o tipo de mistura A ou B aparece. Na caixa Control Identifier (Identificador de controlo), escreva A. Clique no botão Match (Corresponder) e as amostras com correspondência surgem no lado direito da caixa de diálogo (Figura 9). CF2EUGSPT Rev.10/2013 Página 24 de 35

25 Figura 9: Ecrã File Name Group Editor (Editor do grupo de nomes de ficheiros). Guarde o grupo de correspondências numa pasta adequada clicando no ícone situado no topo da secção Matched Groups (Grupos com correspondência). Na janela de análise principal, seleccione a opção de menu pendente Applications (Aplicações) no topo do ecrã. Seleccione ARMS/Comparative Analysis (ARMS/Análise comparativa) e, em seguida, Mutant + Wildtype (Mutante + estirpe selvagem). Na caixa de diálogo ARMS/Comparative Analysis (ARMS/Análise comparativa), seleccione o Group File (Ficheiro de grupo) relevante e depois seleccione Poly-T Analysis (Análise de Poli-T) caso pretenda esta análise e/ou STR Check (Verificação STR) (Figura 10a). Em seguida, clique em OK para visualizar a janela ARMS/Comparative Analysis (ARMS/Análise comparativa) (Figura 10b). Figura 10a: Caixa de definições ARMS/Comparative Analysis (ARMS/Análise comparativa). CF2EUGSPT Rev.10/2013 Página 25 de 35

26 Figura 10b: Janela ARMS/Comparative Analysis (ARMS/Análise comparativa). Ficheiros agrupados Electroforogramas Histograma da diferença Tabela de relatório Revisão do relatório Elucigene CF-EU2v1 Relatório mutantes + estirpe selvagem (mistura A + B) Clique no ícone de impressão da janela ARMS/ComparativeAnalysis (ARMS/Análise comparativa). Seleccione Poly-T Analysis (Análise de Poli-T) caso pretenda esta análise e/ou STR Check (Verificação STR) (Figura 12a). Clique em Preview (Previsão) para visualizar o relatório Elucigene CF-EU2v1 A + B (Figura 12b). Nesta janela, o operador pode rever e imprimir cada um dos relatórios de amostras. Figura 12a: Caixa ARMS/Comparative Print Settings (ARMS/Definições de impressão comparativa). CF2EUGSPT Rev.10/2013 Página 26 de 35

27 Figura 12b: Janela do relatório CF-EU2v1 mutantes + estirpe selvagem (misturas A + B) O relatório Elucigene CF-EU2v1 inclui as seguintes características: Report Header (Cabeçalho do relatório): Contém informações acerca da análise, do projecto, da amostra e dos parâmetros. Signature Box (Caixa de assinatura): Data e espaço inicial para revisores do relatório. É fornecida uma coluna de verificação adicional para as iniciais do revisor. Electropherogram (Electroforograma): Semelhante à janela de ARMS/ Comparative analysis (ARMS/Análise comparativa), apresenta todas as cores dos corantes do traçado da amostra. Report Tables (Tabelas de relatório): A tabela principal apresenta todas as mutações testadas por este kit. O estado de homozigosidade ou heterozigosidade é indicado pelo número de alelos de estirpe selvagem ou mutantes relatados para cada locus. A segunda tabela mostra o estado de Poli-T da amostra se esta função tiver sido seleccionada. Trace Comparison Histogram (Histograma de comparação de traçados): O GeneMarker calcula as diferenças alélicas entre os traçados das misturas A e B e apresenta-as num histograma localizado abaixo dos electroforogramas das amostras. Rótulos dos picos Os rótulos dos picos são codificados por cores segundo a qualidade da correspondência entre o pico detectado e os bins dos painéis observados. No electroforograma, os marcadores são barras cinzentas horizontais e o centro dos picos é marcado por uma barra cinzenta vertical. Os picos que não recaem nos marcadores ou nos bins do painel são marcados a vermelho como Off Ladder (Fora do padrão) (OL). CF2EUGSPT Rev.10/2013 Página 27 de 35

28 Nota: As variações no tipo de polímeros e padrões de tamanho do aparelho podem requerer a optimização dos bins dos marcadores para adaptar o software às condições de execução em uso. Pode encontrar mais informações sobre a modificação de bins dos painéis no manual do GeneMarker fornecido com o software. Classificação dos picos de diagnóstico Cada indivíduo possui duas cópias do gene CFTR. Quando um determinado alelo possui a mesma sequência em ambas as cópias, diz-se que o indivíduo é homozigótico relativamente a este local. Se um determinado alelo possuir sequências diferentes em cada cópia, o indivíduo é considerado heterozigótico (Figura 13). A mistura A (mutante) determina se um indivíduo é portador de alguma mutação, o que é mostrado pela presença de um pico azul. A mistura mutante contém também iniciadores do alelo normal F508del, pelo que esta mistura consegue determinar se um indivíduo apresenta F508del normal (apenas pico verde), se é homozigótico para F508del (apenas pico azul) ou se é heterozigótico para este alelo (pico azul e pico verde). Se for observada qualquer outra mutação, a amostra pode ser amplificada com a mistura B (WT) para determinar se é homozigótica ou hete rozigótica. A presença de um pico verde para um determinado alelo na mistura WT indica que o indivíduo é heterozigótico e a ausência de um pico verde indica que é homozigótico para aquela mutação em particular. Figura 13: Exemplos de a) indivíduo normal, b) indivíduo heterozigótico e c) indivíduo homozigótico para o alelo 711+1G>T. A B C CF2EUGSPT Rev.10/2013 Página 28 de 35

29 Indivíduos portadores de duas mutações diferentes são denominados heterozigóticos compostos (Figura 14). A Figura 14: Exemplos de amostras heterozigóticas compostas. A) W1282X/S1251N B) F508del/R560T. B São incluídos dois marcadores STR hipervariáveis (vermelhos) em ambas as misturas. Isto permite a comparação entre a amostra amplificada com a mistura mutante e a amostra amplificada com a mistura WT para reduzir a probabilidade de as amostras CF2EUGSPT Rev.10/2013 Página 29 de 35

30 serem confundidas (Figura 15). A ausência destes marcadores STR indica que a amostra falhou. A presença de marcadores STR com RFU muito baixas indica uma amostra fraca, que deve ser analisada com cautela. Figura 15: Gráficos da mistura A e da mistura B onde estão representados os dois marcadores STR para um indivíduo. Os marcadores STR hipervariáveis podem ser ocultados anulando a selecção de STR Check (Verificação STR) na caixa ARMS/Comparative Print Settings (ARMS/Definições de impressão comparativa) se estiver apenas a analisar a mistura A ou na caixa ARMS/Comparative Analysis (ARMS/Análise comparativa) se estiver a analisar as misturas A e B. A apresentação apenas dos dados do corante vermelho na janela ARMS/Comparative Analysis (ARMS/Análise comparativa) permite uma visualização mais fácil dos marcadores STR. Designação dos marcadores no GeneMarker Quando se visualizam dados dos traçados analisados no GeneMarker, os picos de diagnóstico na mistura A são rotulados com o nome do marcador. Os picos de diagnóstico da mistura B apenas são rotulados com o número do marcador, apresentando o sufixo WT quando visualizados quando apenas o corante verde está seleccionado. CF2EUGSPT Rev.10/2013 Página 30 de 35

31 A correlação entre os números dos marcadores e os marcadores é mostrada abaixo. Marcadores detectados N.º Marcador Marcador Intervalo de tamanho em bp do produto (dados 3130/POP7) 01 R347H R347P G>A G>A G>T R334W I507del F508del kb C>T delTA delT V520F L206W W1282X R560T delG Q890X R553X G551D S549R(T>G) S549N M1101K G542X insT Y1092X(C>A) S1251N delA kb A>G G>A R117H R117C N1303K Y122X delTT G85E R1066C G>A W846X delA D1152H CFTRdel2_ P67L delT E60X delC G A455E R1162X R1158X T* IVS8-5T T IVS8-7T T IVS8-9T CF2EUGSPT Rev.10/2013 Página 31 de 35

32 * Tamanhos de alelos 5T Marcador Intervalo de tamanho em bp do produto POP7/3130 Intervalo POP7/3130 5T (9) T (10) T (11) T (12) T (13) Nota: Os intervalos de tamanho de cada marcador podem variar consoante o aparelho e o polímero utilizados. Marcador CF-EU2v1 di507del Devido à localização da deleção em I507 no gene CFTR, é possível detectar a presença deste marcador através de um desvio de 3 bp no tamanho do pico de F508del, assim como um pico específico da mutação I507del. Caso esteja presente um só alelo mutante I507del, o pico mutante que lhe corresponde será observado sob a forma de um pico azul a aproximadamente 159 bp. Será observado como presente um pico de estirpe selvagem para F508del, mas a altura do pico será cerca de metade da normalmente associada a um genótipo de estirpe selvagem homozigótico; este é observado sob a forma de um pico verde a cerca de 167 bp. Observar-se-á ainda um outro pico verde a cerca de 164 bp (Figura 16). Figura 16: Amostra heterozigótica para I507del. Uma amostra I507del/F508del produz um pico de estirpe selvagem verde para F508del desviado, a aproximadamente 164 bp (menos 3 bp que o normal), um pico mutante F508del azul a 166 bp e um pico mutante I507del azul a cerca de 159 bp. Uma amostra I507del/I507del resulta num pico azul a aproximadamente 159 bp e num pico verde único a cerca de 164 bp (3 bp inferior ao pico para F508del normal observado quando I507del não está presente). CF2EUGSPT Rev.10/2013 Página 32 de 35

33 Há que notar que a presença de uma mutação F508del impede o iniciador de estirpe selvagem I507 de funcionar. Por conseguinte, indivíduos homozigóticos para F508del não possuirão um pico de estirpe selvagem I507 na mistura de estirpe selvagem e indivíduos heterozigóticos para F508del apresentarão um pico de estirpe selvagem I507 de altura reduzida na mistura de estirpe selvagem. Marcadores de Poli-T O Elucigene CF-EU2v1 contém iniciadores ARMS fluorescentes marcados com NED (amarelo) para a detecção das variantes IVS8-5T, IVS8-7T e IVS8-9T. A informação de Poli-T para uma amostra pode ser determinada activando a visualização dos dados do corante amarelo na janela de análise principal do GeneMarker (Figura 7). Os marcadores de Poli-T podem ser ocultados anulando a selecção de Poly-T Analysis (Análise de Poli-T) na caixa ARMS/Comparative Print Settings (ARMS/Definições de impressão comparativa) se estiver apenas a analisar a mistura A ou na caixa ARMS/Comparative Analysis (ARMS/Análise comparativa) se estiver a analisar as misturas A e B. Por conseguinte, o operador pode optar por visualizar estes dados se considerar que são necessários no âmbito do procedimento de análise do laboratório. Nota: Não existem iniciadores Poli-T na mistura B, pelo que os produtos só serão visualizados em amostras de mistura A. Análise de Poli-T Os exemplos GeneMarker que se seguem exibem morfologias de picos características das regiões variantes de IVS8 testadas. Os exemplos abaixo mostram o resultado da mistura A observados quando se selecciona Poly-T Analysis (Análise de Poli-T) na caixa de diálogo ARMS/Comparative Print Settings (ARMS/Definições de impressão comparativa) quando se analisa apenas a mistura A. Exemplo 1: Amostra IVS8-5T / IVS8-7T CF2EUGSPT Rev.10/2013 Página 33 de 35

34 Exemplo 2: Amostra IVS8-7T / IVS8-7T Exemplo 3: Amostra IVS8-7T / IVS8-7T (variabilidade da repetição de TG) Os dois picos devem-se à heterozigosidade da região de repetição de TG que se encontra no nosso produto da amplificação. Este efeito pode também ser observado em amostra homozigóticas com 5T e 9T. Por conseguinte, é possível determinar o número de repetições de TG dentro de cada variante de politimidina de IVS8. CF2EUGSPT Rev.10/2013 Página 34 de 35

35 Exemplo 4: Amostra IVS8-9T / IVS8-9T Aviso importante Em certas condições de ensaio, é possível que artefactos observáveis de corantes interfiram com as análises de rotina. É importante que o utilizador tenha noção da possibilidade de interferência para garantir que analisa correctamente os dados. Os artefactos de corantes marcados podem ser observados sob a forma de pequenos picos azuis ou verdes. Estes artefactos dos corantes são geralmente de dimensão inferior a 100 bp e não costumam interferir com a análise de dados. Em condições normais, estes picos de artefacto são insignificantes relativamente aos verdadeiros picos do produto da amplificação e não causam problemas de análise. No entanto, quando a quantidade de produto da amplificação carregada é pequena, talvez devido a um ADN genómico limitante, os picos dos artefactos dos corantes surgem com uma dimensão relativamente maior, havendo a possibilidade de serem analisados como verdadeiros picos do produto da amplificação. ELUCIGENE é uma marca comercial registada da Gen-Probe Life Sciences Ltd. ARMS é uma marca comercial registada da AstraZeneca UK Ltd. QIAAMP é uma marca comercial registada da Qiagen GmbH. GENEMARKER é uma marca comercial registada da SoftGenetics Corporation. GENEMAPPER, VIC, NED, POP-7, HI-DI e PET são marcas comerciais registadas da Life Technologies Corporation. AVISO AO COMPRADOR: LICENÇA LIMITADA Os polinucleóticos marcados com corantes VIC, NED e PET e/ou a sua utilização podem estar abrangidos por uma ou mais patentes detidas pela Applied Biosystems, LLC. O preço de aquisição deste produto inclui os direitos limitados e não transmissíveis ao abrigo de determinadas reivindicações de certas patentes detidas pela Applied Biosystems, LLC, para a utilização pelo comprador apenas desta quantidade do produto e exclusivamente em actividades de detecção de alvo(s) no domínio do diagnóstico humano. Não são transmitidos outros direitos. Podem obter-se mais informações acerca da aquisição de licenças relacionadas com os corantes atrás mencionados contactando o Director de Licenciamento da Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, EUA. Copyright 2013 Gen-Probe Life Sciences Ltd. CF2EUGSPT Rev.10/2013 Página 35 de 35