Genômica Aplicada à Conservação de Recursos Genéticos. Genomics Applied to Genetic Resources Conservation

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1 Genômica Aplicada à Conservação de Recursos Genéticos Genomics Applied to Genetic Resources Conservation Fabyano Fonseca e Silva 1, José Lindenberg Rocha Sarmento 2, Daniel Biagiotti 3, Bruna Lima Barbosa 4, Fabio Barros Britto 5 RESUMO: A utilização de marcadores SNPs em estudos de conservação de recursos genéticos pode esclarecer a existência de gargalos populacionais, deriva genética e assinaturas de seleção, informar sobre eventos de domesticação tal como endogamia e introgressão, e sub-estruturação populacional, além de auxiliar na tomada de decisões acerca da manutenção e manejo de populações. Tal abordagem é denominada de Genômica de Populações, e pode ser caracterizada pelo uso de uma ampla varredura do genoma para identificar e separar locos sob efeitos específicos (seleção, mutação, acasalamentos preferenciais e recombinação) de locos sob efeitos amplos (deriva genética, fluxo gênico e endogamia) com o objetivo de aumentar o entendimento sobre eventos evolutivos que possam estar de alguma forma relacionados com a conservação das espécies. Além disso, a Genômica de Populações possibilita acessar estimativas da variação entre populações e testes de hipóteses para heterozigosidade. Palavras-chave: Diversidade genética, SNP, Genômica de Populações ABSTRACT: The use of SNP markers in genetic resources conservation studies can clarify the existence of population bottlenecks, genetic drift and signature selection, to point out for domestication events such as inbreeding and gene introgression, and population sub-structuring, as well as to assist in making decisions about population genetic management. This approach is denominated Population Genomics, and can be characterized by using whole scanning of the genome aiming to identify and separate loci under specific effects (selection, mutation, preferential mating and recombination) from loci under wide effects (genetic drift, gene flow and inbreeding). It allows increasing the understanding of evolutionary events that may be somehow related to the species conservation. Furthermore, the Population Genomics provide estimates for variation among populations and heterozygosity hypothesis tests. Key words: Genetic diversity, SNP, Population Genomics. 1 Professor Associado DZO/UFV, Viçosa, MG. Bolsista CNPq. fabyanofonseca@ufv.br 2 Professor Adjunto DZO/CCA/UFPI, Teresina, PI. Bolsista CNPq. sarmento@ufpi.edu.br 3 Doutorando em Ciência Animal, CCA/UFPI, Teresina, PI. 4 Mestranda Genética e Melhoramento CCA/UFPI, Teresina, PI. 5 Professor Adjunto CCN/UFPI, Teresina, PI.

2 1. Introdução A partir do início do século XXI os avanços biotecnológicos na área de automação do processo genotipagem permitiram o desenvolvimento de novas classes de marcadores, dentre os quais se destacam os SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms). Considerando que polimorfismos do DNA ao nível de uma única base nitrogenada constituem a mais abundante e representativa fonte de variação genética, marcadores SNPs em desequilíbrio de ligação com QTL (Quantitative Trait Loci) podem ser utilizados como critério extra para identificação de indivíduos candidatos à seleção, o que aumentaria a acurácia na avaliação genética. Tal aplicação direcionada para identificação de indivíduos geneticamente superiores recebeu o nome de seleção genômica ampla (Meuwissen et al., 2001). Embora os marcadores SNPs tenham sido primeiramente propostos para a predição do mérito genômico de animais sob seleção, sua utilização foi ampliada para a identificação de material genético ainda pouco explorado, de forma que a conservação desses recursos vem ganhando destaque no cenário atual da área de Genética Animal. Neste contexto, na busca por informações mais apuradas do genótipo dos animais, pesquisadores estão utilizando tais marcadores em conjunto com o desenvolvimento de técnicas capazes de detectar polimorfismos de genes que possibilitam ampliar a capacidade de caracterizar a variação genética dentro e entre raças (Toro et al., 2008). De forma geral, esta abordagem via marcadores pode esclarecer a existência de gargalos populacionais, deriva genética e assinaturas de seleção, informar sobre eventos de domesticação, endogamia, introgressão e subestruturação populacional, além de auxiliar na tomada de decisões acerca da manutenção e manejo de populações (Meadows et al., 2005; Tapio et al., 2006). Tal abordagem é denominada de Genômica de Populações, e pode ser caracterizada pelo uso de uma ampla varredura do genoma para identificar e separar locos sob efeitos específicos (seleção, mutação, acasalamentos preferenciais e recombinação) de locos sob efeitos amplos (deriva genética, fluxo gênico e endogamia) com o objetivo de aumentar o entendimento sobre eventos evolutivos que possam estar de alguma forma relacionados com a conservação das espécies (Black et al., 2001). Além disso, a Genômica de Populações possibilita acessar estimativas da variação entre populações (FST) e testes de heterozigosidade (Hohenlohe et al., 2010). 2. Marcadores moleculares utilizados em estudos de diversidade genética e conservação Os marcadores de polimorfismos de comprimento de fragmentos de restrição ou RFLP foram os primeiros (início dos anos 80) a serem utilizados em estudos de interesse zootécnico (Caetano, 2009). São codominantes e baseiam-se na utilização de uma ou mais enzimas de restrição para o corte em pontos específicos da sequência de DNA gerando fragmentos de tamanhos diferentes, representando a 115

3 presença e ausência de sítios de reconhecimento de enzimas de restrição em indivíduos distintos (Caixeta et al., 2013). Outro marcador codominante utilizado em pesquisas genéticas são os microssatélites, também chamados de SSR (Simple Sequence Repeats) ou STR (Short Tandem Repeats) que são definidos como regiões dispersas do genoma compostas de números variáveis de repetições. Caracterizam-se por serem altamente polimórficos, com sequências flanqueadoras da mesma espécie sendo geralmente conservadas, com alta taxa de mutação e geralmente multialélicos, sendo bastante abundantes e distribuídos nos genomas de eucariotos, com alta reprodutividade e simplicidade via uso de PCR (Caixeta et al. 2013). Os primeiros mapas genéticos de interesse zootécnico foram construídos com microssatélites (Coutinho et al., 2010). Contudo, esses marcadores requerem a construção de uma biblioteca genômica, sequenciamento e desenho de primers, o que torna o trabalho oneroso e algumas vezes inviável sob o ponto de vista econômico. Tais marcadores possuem aplicação em estudos de identidade genética, variabilidade dentro de espécie e em testes de paternidade, bem como na identificação de QTLs, análises de bancos de germoplasma e na Seleção Assistida por (Faleiro, 2007; Caixeta et al., 2013). Os avanços tecnológicos e o desenvolvimento do sequenciamento automatizado possibilitaram o advento de uma classe de marcador molecular de alto desempenho e eficiência, os SNPs. Juntamente com as pequenas mutações (inserções e deleções), os SNPs representam a forma mais frequente de variação genética natural (Caixeta et al., 2013). Os SNPs estão distribuídos de forma abundante por todo o genoma, ou seja, com alta variabilidade genética. Possuem a vantagem de serem mais estáveis que os outros marcadores, porém pouco informativos por serem geralmente bialélicos (dois alelos por locus), o que requer a utilização de uma grande quantidade desse marcador para o seu estudo em análises genéticas. Outra vantagem é a possibilidade de automação, que permite análise de uma grande quantidade de indivíduos e de marcadores (Regitano e Veneroni, 2009; Caixeta et al., 2013). 3. Marcadores SNPs Os SNPs aplicam-se a estudos de filogenia e mapeamento genético de características de interesse, de haplótipos e associação com base no desequilíbrio de ligação de alta resolução (Lee et al., 2006), além da análise de estrutura populacional, e seleção assistida por marcadores. Tais marcadores possuem grande aplicação na análise genética de características complexas, sendo também utilizados para definir parentesco em animais domésticos, além de estudos de associação e seleção genômica ampla (Heaton et al., 2014; Oliveira, 2014). Com o surgimento de novas técnicas de sequenciamento, promoveu-se a utilização de plataformas de genotipagem de SNPs capazes de gerar informações, em um único ensaio, de milhões de pares de bases, além de apresentarem maior vantagem quanto a custo por base e economia de tempo em relação às outras classes de marcadores (Caixeta et al., 2013). As plataformas mais 116

4 utilizadas atualmente para a genotipagem de SNPs são: SNPstream (Beckman Coulter), GeneChip (Affymetrix), Perlegen Wafers, Molecular Inversion Probe MIP (Affymetrix) e GoDLenGate e Infinium da Illumina. A SNPstream utiliza extensão de primers com minisequenciamento e arranjo disposto em lâmina, processando grande quantidade de genótipos (4.600 a ) por dia, porém com número de SNPs menor comparado a outras plataformas de genotipagem. Perlegen Wafers e GeneChip são baseadas em processos de hibridização de oligonocleotídeos. A Molecular Inversion Probe analisa SNPs por ensaio em arranjo de lâmina e extensão de primer por meio de minisequenciamento. As plataformas GoldenGate e Infinium baseiam-se no emprego de microarranjos e extensão de primers alelo-específicos, no entanto, a primeira utiliza PCR no passo de amplificação e pode genotipar apenas 1536 loci simultaneamente, enquanto a segunda dispensa amplificação via Reação da Cadeia de Polimerase e genotipa de centenas a milhares de polimorfismos de base única de forma simultânea (Caixeta et al., 2013; Illumina, 2006). Os painéis de SNPs possibilitam o desenvolvimento de estudos de diversidade genética entre e dentro de populações, estrutura populacional e estimação de endogamia. Além disso, detectam assinaturas de seleção, o que possibilita a identificação de regiões genômicas de interesse relacionadas a características quantitativas. Isto aumenta as perspectivas para estudos de genética animal, bem com de conservação dessa diversidade (FAO, 2013). 4. Genômica na diversidade genética Em programas voltados para a conservação genética de espécies é fundamental o conhecimento da variabilidade genética, de forma que a caracterização genética pode ser utilizada no estudo de relações entre espécies buscando informações através de suas características fenotípicas, morfológicas e fisiológicas, origem, hábitat, distribuição geográfica, produção e parâmetros genéticos (Hernandez et al., 1997). O conhecimento de tais aspectos é de fundamental importância para a conservação de recursos genéticos animais, pois irá direcionar os acasalamentos que possam favorecer a manutenção da máxima variabilidade genética e evita esforços na manutenção de amostras geneticamente similares (Egito et al., 2001). Com a utilização dos marcadores SNPs foi possível realizar estudos relacionados à estrutura de população até então não realizados devido a ausência de informações genéticas a nível de locus. Predições entre-raças a partir de painéis de alta densidade através do desequilíbrio de ligação (DL) pode refletir a habilidade dos alelos de um locus predizer os alelos de outro locus. Trabalhos envolvendo estudo de diversidade utilizando marcadores moleculares estão sendo realizados. Oliveira (2014) observou que com exceção dos SNPs que estavam fixados na população, foi possível observar, por meio das frequências alélicas e genotípicas dos demais SNPs avaliados, que existe variabilidade genética considerável capaz de responder de maneira eficiente à seleção quando associados à expressão das características de prolificidade e resistência a parasitose em ovinos. 117

5 Estudos envolvendo ovinos no Estado do Piauí na área de diversidade genética entre populações de diferentes municípios foram realizadas com microssatélites (Marques et al., 2015) e com SNPs (Barbosa, 2015), e foram evidenciadas vantagens em cada método, como menor custo utilizando microssatélites e maior cobertura do genoma utilizando SNPs. Os microssatélites são polimórficos e com alta capacidade para identificar a variabilidade e a diversidade genética em caprinos, podem ser utilizados para caracterização genética de raças caprinas brasileiras, auxiliando em programas de conservação e melhoramento dos recursos genéticos do país (Menezes et al., 2006). Comparações entre raças bovinas utilizando diferentes marcadores vêm sendo empregadas na investigação da domesticação, migração, história evolutiva e estrutura populacional (Loftus et al., 1994; Egito et al., 2007; Mckay et al., 2008). O uso da genômica através de marcadores moleculares na avicultura encontra-se em fase experimental, o que a qualquer momento poderá ser incorporado nos respectivos programas das empresas de genética de aves (Ledur et al., 2003). Na suinocultura. Sollero (2006) avaliaram a diversidade genética existente em três raças naturalizadas de suínos (Piau, Monteiro e Moura) uma raça comercial (Landrace) e o composto MS60, além de testar a existência de estruturação genética dentro das populações analisadas, a partir de marcadores microssatélite, que obteve como resultado a conclusão que o painel de 24 marcadores microssatélites foi capaz de estimar elevadas probabilidades de exclusão de paternidade para cada grupo genético analisado. 5. Referências BARBOSA, B. L. Diversidade Genética de Populações de Ovinos Santa Inês no Meio-Norte do Brasil com Marcadores de Base Única (SNPs). Teresina: UFPI, f. Dissertação (Mestrado em Genética e Melhoramento). BLACK, W. C.; BAER, C. F.; ANTOLIN, M. F. et al. Population genomics: genome-wide sampling of insect populations. Annual Review of Entomology, v.46, p , CAETANO, A. R. Marcadores SNP: conceitos básicos, aplicações no manejo e no melhoramento animal e perspectivas para o futuro. Revista Brasileira de Zootecnia, v.38, p.64-74, CAIXETA, E. T.; FERRÃO, L. F. V.; MACIEL-ZAMBOLIM, E. Marcadores moleculares. In: BORÉM, A.; FRITSCHE-NETO, R. Biotecnologia Aplicada ao Melhoramento de Plantas. Viçosa, MG: UFV, p COUTINHO, L. L.; ROSÁRIO, M. F.; JORGE, E. C. Biotecnologia animal. Estudos Avançados, v.24, n.70, p , EGITO, A. A.; ALBUQUERQUE, M. S. M.; MARIANTE, A. S. Caracterização genética de raças naturalizadas. In: SIMPÓSIO DE RECURSOS GENÉTICOS PARA AMÉRICA LATINA E CARIBE, 3., Londrina, Anais... Londrina: Instituto Agronômico do Paraná, p EGITO, A. A.; PAIVA, S. R.; ALBUQUERQUE, M. S. M. Microsatellite based genetic diversity and relationships among ten Creole and commercial cattle breeds raised in Brazil. BMC Genetics, v.8, p.83, FALEIRO, F.G. Marcadores Genético-moleculares Aplicados a Programas de Conservação e Uso de Recursos Genéticos. Planaltina, DF: EMBRAPA CERRADOS, p. 118

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