CARACTERIZAÇÃO DE ACESSOS DO BANCO ATIVO DO GERMPOPLASMA DE ALGODÃO DA EPAMIG EMPREGANDO MICROSATÉLITE

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1 CARACTERIZAÇÃO DE ACESSOS DO BANCO ATIVO DO GERMPOPLASMA DE ALGODÃO DA EPAMIG EMPREGANDO MICROSATÉLITE Taciana de Carvalho Coutinho (UFRN), Walter Fabrício Silva Martins (UFPE), Fábia Suelly Lima Pinto (Embrapa Algodão), Wagner Alexandre Lucena (Embrapa Algodão), Marcia Soares Vidal (Embrapa Algodão) RESUMO - Marcadores microsatélites ou SSR (Seqüências simples repetitivas) são seqüências de pequenas repetições em pares de bases distribuídos ao longo do genoma. A identificação genotípica a partir de marcadores pode diagnosticar marcas polimórficas existentes no genoma, que poderão auxiliar na seleção de genes envolvidos com características agronômicas. O presente trabalho teve por objetivo avaliar a diversidade genética entre 32 acessos pertencentes ao banco ativo de germoplasma da EPAMIG através de microsatélites. Dos 17 loci de microsatélite estudados, o número de alelos por locus variou de 2 a 6, com uma média de 3 alelos por locus. A maior taxa de heterozigosidade esperada foi de 0,20 e a observada de 0,41 para o acesso Dendera, enquanto que, a menor taxa foi de heterozigosidade esperada foi de 0,11 e a observada de 0,23 para 24 acessos. A árvore filogenética gerada com dados de microsatélites apresentou sete grupos, enquanto que, para as características morfológicas já estudadas formaram 10 grupos diferentes. Palavras chaves: Gossypium spp., microsatélites, diversidade genética CHARACTERIZATION OF EPAMIG COTTON GERMPLASM COLLECTION ACCESSIONS MICROSSATELLITE ABSTRACT - Microsatelite markers or SSR (Simple Sequence Repeat) are short base pairs repeated sequences spreaded in the entire genome. Genotypic identification using genetic markers can to light out the polymorphism that exists through the genome, which will help to select important genes for specific agronomic characteristics. The objective of this work was to analyse the genetic diversity of 32 accesses from the EPAMIG s GAB using microsatellite. The number of alleles per locus varied between 2 and 6, with a medium of 3 alleles per locus, from a total of 17 loci studied. The expected and observed values of heterozygosity ranged from 0.11 to 0.20 and 0.23 to 0.44, respectively. The dendrogram constructed based on molecular markers demonstrated seven groups, which were compared to another dendrogram constructed based on morphological characters in order to correlate the two markers. Key Words: Gossypium ssp., microsatellite, genetic diversity

2 INTRODUÇÃO O genoma do algodão (Gossypium hirsutum L.) apresenta uma grande quantidade de DNA repetitivo, classificados de acordo com o número de nucleotídeos e complexidade da seqüência que os compõem. Dentro destas regiões repetidas, encontra-se os marcadores moleculares denominados de microsatélites que, segundo Ferreira e Grattapaglia (1998), consistem de pequenas seqüências com 1 a 4 nucleotídeos de comprimento, repetidas em tandem, distribuídos ao acaso o qual constitui um loco genético altamente variável, multialélico e de expressão co-dominante. O melhoramento genético do algodão visa à obtenção de novas variedades que apresentem características que atendam as demandas em termos do aumento do rendimento de fibra, maturação precoce, adaptação à colheita mecanizada, resistência a pragas e doenças e, alto rendimento de fibra. Os trabalhos de melhoramento do algodão estão ligados a várias instituições que conduzem anualmente uma série de ensaios, avaliando linhagens em diversas localidades. Estes estudos avaliam a diversidade genética entre grupos de genitores para a identificação de combinações híbridas de maior heterozigosidade que possam ser utilizados na recuperação de genótipos superiores nas gerações segregantes em espécies cultivadas de algodão (CARVALHO, 2003). A partir do desenvolvimento dos marcadores moleculares, os quais detectam polimorfismo genético, diversos trabalhos têm avaliado a variabilidade genética de indivíduos dentro e entre populações, principalmente para análises de bancos ativos de germoplasma. Os marcadores moleculares nestes programas de melhoramento são utilizados como um sistema diagnóstico onde pode segregar conjuntamente com os genes de interesse agronômico, resultando na seleção indireta do gene. O presente trabalho teve por objetivo avaliar a diversidade genética entre 32 acessos pertencentes ao banco ativo de germoplasma da EPAMIG através de microsatélites. MATERIAL E MÉTODOS O material vegetal em estudo pertence ao Banco ativo de germoplasma da EPAMIG, composto por 221 acessos, dos quais estão classificados em 10 grupos a partir das análises de similaridade morfológica e de fibra. Para o presente estudo, 32 acessos dos 221 foram selecionados com base no agrupamento já realizado. Estes acessos foram plantados em casa de vegetação da Embrapa Algodão em vasos contendo uma mistura de massame, esterco e solo, nas proporções de 30%, 30% e 40% respectivamente. Após quatro a cinco semanas de desenvolvimento folhas jovens foram coletadas em nitrogênio líquido para posterior extrações de DNA, seguindo o protocolo de extração de DNA genômico de Ferreira e Grattapaglia (1999). DNAs obtidos foram quantificados em géis de agarose e espectrofotômetro. As reações de amplificação para os 32 acessos foram realizadas em solução total de 20 µl contendo: 10 ng de DNA genômico de algodão; 1 µl de Taq sintetizada no Laboratório de Biotecnologia da Embrapa Algodão; 10X Tampão da Taq DNA polimerase; 0,2 mm de dntp; 3 e 2 mm de MgCl 2 ; 3 µl de oligonucleotídeo. A ciclagem foi obtida em termocicladores (Eppendorf-Mastercycher Gradient), onde inicialmente o DNA foi desnaturado a 95 C por 12 minutos. Seguiram-se 47 ciclos de desnaturação anelamento - extensão. Nos primeiros 11 ciclos de amplificação, a desnaturação foi feita a 94 C por 15 segundos; a temperatura de anelamento, no primeiro ciclo de 65 C por 30 segundos, e diminuiu um grau a cada ciclo (touch down), chegando a 55 C no décimo primeiro ciclo; a extensão foi de 72 C por 1 minuto. Os trinta e seis ciclos restantes foram de 94 C por 15 segundos; 55 C por 30 segundos e 72 C por 1 minuto. Seguiu-se extensão final a 72 C por 6 minutos. Os

3 fragmentos amplificados foram separados em eletroforese vertical em gel de poliacrilamida desnaturante, corados conforme Creste et al., Para a análise da distância genética foi utilizado o programa Genetix (Belkhir, et al, falta ano), a matriz de distância obtida foi utilizada para a construção do dendograma através do programa MEGA 3 (KUMAR et al., 2004) pelo método da UPGMA (Unweitghted pair-group method with arithmetical averages). RESULTADOS E DISCUSSÃO O trabalho de Carvalho et al (2003) avaliou a diversidade genética entre os acessos do banco ativo de germoplasma da EPAMIG levando-se em consideração as características morfológicas, tais como: Porcentagem de fibra, índice de fibra, comprimento de fibra, resistência de fibra, finura da fibra, índice de uniformidade de fibra, altura da planta, precocidade de maturação, altura do primeiro ramo frutífero, números de ramos frutíferos e número de ramos reprodutivos. Para os 221 acessos analisados obteve-se a formação de 10 grupos dos quais 36 acessos foram utilisados para a construção da árvore filogenêtica com os dados das características morfológicas. Dos 36 acessos utilizados, 32 foram avaliados para marcadores de microsatélites, onde 17 loci foram polimórficos, como mostrado na Tabela 1. Tabela I. Loci de microsatélites analisados para os 32 acessos. Locus Tamanho estimado Nº de Tamanho estimado Nº de Locus do alelos alelos do alelos alelos BNL /153 2 BNL /155 2 BNL /210 3 BNL /200 2 BNL /179 4 BNL /176 3 BNL /212 2 BNL /174 3 BNL /193 2 BNL /190 3 BNL /214 6 BNL /195 3 BNL 3653 _ 3 BNL /206 4 BNL /182 3 BNL /128 2 BNL /108 4 O número de alelos por locus variou de 2 a 6, com média de 3 alelos por locus, distribuídos entre os 32 acessos. A taxa de heterozigosidade esperada e observada foi calculada adotando-se o critério de polimorfismo de 0,95. A maior taxa de polimorfismo observada foi para o acesso Dendera que teve 0,20 de heterozigosidade esperada e 0,41 de heterozigosidade observada. A menor taxa de polimorfismo foi de 0,11 para heterozigosidade esperada e 0,23 de heterozigosidade observada para os acessos em negrito da Tabela 2.

4 Tabela 2. Taxa de heterogosidade esperada e observada entre os 32 acessos gerados pelos 17 loci de microsatélite ACESSOS Hexp. Hobs. ACESSOS Hexp. Hobs. 4S 180 0,08 0,17 T ,11 0,23 ACALA ,11 0,23 TAMCOT 788 0,14 0,29 AUBURN FG 277 0,11 0,23 TAMCOT SP 0,11 0,23 BJ ,11 0,23 THORPE 0,11 0,23 C ,11 0,23 TX CABUCS 0,11 0,23 DENDERA 0,20 0,41 TXCACES ,11 0,23 DES ,11 0,23 TX CDPS 177 0,14 0,29 PEE DEE 6 0,11 0,23 V ,11 0,23 GIZA 80 0,17 0,35 V ,11 0,23 SL ,11 0,23 T-295 0,11 0,23 SL ,23 COKER-310 0,11 0,23 SL 5(3-5600) 0,11 0,23 STONEVILLE 213 0,11 0,23 SU ,11 0,23 STONEVILLE-7 0,11 0,23 T ,11 0,23 EMPIRE GRANDLESS 0,11 0,23 T ,11 0,23 BJ ,14 0,29 T ,14 0,29 T ,12 0,25 A árvore filogenêtica obtida com os dados genéticos gerou 7 grupos para os 32 acessos estudados, onde se verificou que os acessos do grupo 9 do trabalho de Carvalho et al (2003) quando analisados por marcadores de microsatélite formaram dois grupos divergentes localisados nas extremidades da árvore, inferindo que características morfológicas diferentes possam estar separando este grupo, quando analisados por microsatélites. Os acessos pertencentes aos grupos 7, 8 e 10 como classificados no trabalho de Carvalho et al (2003), foram classificados em um único grupo quando gerados com dados de microsatélites, onde a similaridade foi alta. Os 4 grupos restantes da análise genética apresentou acessos pertencentes a vários grupos diferentes da classificação morfológica, onde implica-se que marcas polimorficas não estejam relacionadas a caracteres de interesse agronômico.

5 BJ3129 T SL5(3-5600) C SL T7044 TXCACES1-81 TXCDPS-177 STONEVILLE-213 EMPIREGRANDLESS BJ S180 STONEVILLE-7 TXCABUCS181 AUBURNFG-277 TAMCOT788 PEEDEE695 COKER-310 THORPE TAMCOTSP37 SL T-295 SU T DES24-8 ACALA4-42-A T V V T DENDERA GIZA80 Figura 1. Árvore filogenêtica gerada para os 32 acessos a partir dos 17 loci de microsatélites. CONCLUSÃO Para os 32 acessos analisados por marcadores moleculares SSR foi verificado que o número de loci não foi suficiente para separar os grupos analisados, pois houve uma redução no número de grupos formados quando comparados com a árvore gerada com os dados de características morfológicas. Como perspectivas pretende-se avaliar um maior número de loci de microsatélite para a separação dos grupos availados.

6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BELKHIR K, BORSA P., CHIKHI L. RAUFASTE N. BONHOMNE F. GENETIX 4,02, logiciel sous WindowsTM pour la génétique des populations. Laboratoire Géome, population, interactions: CNRS UMR 5000, Université de Montpellier II, Montpellier, France, CARVALHO, L. P.; LANZA, M. A.; FALLIERI, J.; SANTOS, J. W. Análise da diversidade genética entre acessos de banco ativo de germoplasma de algodão. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v. 38, p , FERREIRA, M. E.; GRATTAPAGLIA, D. Introdução ao uso de marcadores moleculares em análise genética. 3 ed. Brasília: Brasília: Embrapa Cenargem, p. KUMAR, S.; TAMURA, K.; NEI, M. MEGA3: Integrated software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and sequence alignment. Briefings in Bioinformatics, v. 5, p