CONSERVAÇÃO, DIVERSIDADE E ESTRUTURA GENÉTICA DE POPULAÇÕES NATURAIS DE Gossypium mustelinum PRESENTE NO SEMI-ÁRIDO NORDESTINO (*)

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1 CONSERVAÇÃO, DIVERSIDADE E ESTRUTURA GENÉTICA DE POPULAÇÕES NATURAIS DE Gossypium mustelinum PRESENTE NO SEMI-ÁRIDO NORDESTINO (*) Carlos Eduardo de Araújo Batista (UEPB), A. Y. Ciampi (Embrapa Cenargen), Lúcia Vieira Hoffmann (Embrapa Algodão), Paulo Augusto Vianna Barroso (Embrapa Algodão / pbarroso@cnpa.embrapa.br) RESUMO - Gossypium mustelinum é uma espécie de algodoeiro endêmica do bioma semi-árido da região nordeste do Brasil. São conhecidas apenas três populações da espécie e o número de indivíduos presentes nas três populações não é superior a 200. Trata-se, portanto de uma espécie cujo risco de extinção é elevado. A adequada conservação desta espécie depende de parâmetros genéticos populacionais. Este trabalho foi realizado para determinar a estrutura populacional de G. mustelinum estimar e a diversidade presente nas populações conhecidas. Indivíduos das três populações foram genotipados com 22 marcadores SSR e verificou-se que as populações endogamia elevada, baixa diversidade genética e a maior parte da variabilidade existente encontra-se entre as populações. Os resultados obtidos indicam que a população apresenta grande vulnerabilidade genética, necessitando de medidas especiais para a preservação das populações in situ. Palavras-chaves: Gossypium mustelinum, genética de populações, algodão nativo CONSERVATION, DIVERSITY AND GENETIC STRUCTURE OF NATURAL POPULATIONS OF GOSSYPIUM MUSTELINUM NORTHEAST SEMIARID REGION ABSTRACT - Gossypium mustelinum is an endemic tetraploid cotton species occurring at semiarid biome from Brazilian Northeast region. Just three populations are known and the plant number is no more than 200. Therefore the risk of extinction is real. Suitable conservation actions to protect the species are depending from information about populations structure. The goal of this study was estimate Gossypium mustelinum genetic populational parameters for three Gossypium mustelinum populations using SSR markers. The analysis demonstrate that inbreeding is high (F IS =0,74), genetic diversity is low (H E = 0,154) and the variability is distributed mainly among populations (F ST =0,54). Results showed that Gossypium mustelinum has high genetic vulnerability and special procedures to preserve the species are necessary. Key words: Gossypium mustelinum, cotton, genetic of population INTRODUÇÃO G. mustelinum é uma espécie de algodoeiro selvagem, alotetraploíde, arbórea, endêmica do nordeste do Brasil, mais precisamente do Semi-árido e ainda pouco estudada. Esta espécie apresenta particularidades com relação às outras espécies encontradas no Brasil, como capulhos pequenos, fibra curta e marrom, semente pequena, pilosidade acentuada nos caules e nas folhas. As três populações conhecidas da espécie ocorrem junto a fontes de água que persistem durante parte do período seco. Durante algum tempo a espécie foi tida como extinta até que na década de 60, pesquisadores do Instituto Agronômico de Campinas reencontraram uma nova população. Eles a descreveram como sendo de uma nova espécie G. caicoense (NEVES et al., 1968). O desaparecimento de tipos silvestres das espécies cultivadas é um fenômeno documentado desde a aceleração na modernização da agricultura, especialmente evidente após a metade do século

2 passado. A substituição das variedades crioulas por cultivares melhoradas também tem causado preocupação entre os curadores de germoplasma. É importante que tanto os tipos silvestres quanto às variedades crioulas sejam preservadas como reservatório de variabilidade (FREIRE et al., 2002). Este trabalho teve como objetivo avaliar a diversidade e a estrutura genética de populações de Gossypium mustelinum, utilizando marcadores do SSR (simple sequence repeat). MATERIAL E MÉTODOS Para estudo da diversidade foram realizadas expedições e coletados algodoeiros da espécie Gossypium mustelinum em dois estados nordestino. Uma coleta foi realizada no estado do Rio Grande do Norte e duas no estado da Bahia. Foram coletados 51 genótipos de Gossypium mustelinum. Os tecidos foliares de todos os genótipos coletados foram armazenados seguindo método desenvolvido por Barroso et al. (dados não publicados). Brevemente, fragmentos de folha foram colocados em tubos de 50 ml contendo tampão TE (Tris-HCl e EDTA ph 8,0), armazenados durante o transporte para o laboratório em caixa de isopor com gelo e mantidos a -20 C até a extração do DNA. As extrações de DNA dos genótipos foram realizadas seguindo o protocolo CTAB. As reações de amplificação para obtenção dos marcadores SSR foram realizadas em solução contendo tampão PCR (10 mm de Tris-HCl ph 8,3 e 50 mm KCl); 4 mm de cloreto de magnésio, 0,2 µm de oligonucleotídeo direito e revers;1,0 unidade de Taq DNA polimerase; 0,2 mm de dntp e DNA genômico dos genótipos coletados. Os genótipos foram amplificados com oligonucleotídeos BNL (LIU et al., 2000) em programa do tipo Touch Down, constando uma desnaturação inicial a 94 C por 12 minutos, seguida por dez ciclos de 94 C por 15 segundos, 65 C por 30 segundos para o anelamento do oligonucleotídeo reduzindo um grau por cada ciclo até 55 C, a 72 C por um minuto para amplificação do DNA. Posteriormente, foram realizados mais 35 ciclos com desnaturação a 94 C por 15 segundos, anelamento do primer a 55 C por 30 segundos e amplificação do DNA a 72 C por um minuto. Os produtos da amplificação foram separados por eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida 6% e corado com nitrato de prata seguindo metodologia desenvolvida por Creste et al. (2001). Os marcadores gerados foram usados para obter estimativas das estatísticas F para locos individuais segundo Weir e Cockerham (1984). A significância de cada estimativa foi obtida pela avaliação do intervalo de confiança bootstrap. Também foram estimados F ST entre pares de amostras. Estas análises foram realizadas no programa FSTA (GOUDET, 2001). A diferenciação das freqüências alélicas das populações foi verificada utilizando o programa GENEPOP versão 3.4 (RAYMOND e ROUSSET, 1995). Para cada loco, uma estimativa não enviesada do valor P foi obtida pelo teste exato de Fisher foi realizada, conforme descrito por Raymond e Rousset (1995). A distância genética entre as populações foi estimada segundo Nei (1972).

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO Os 21 oligonucleotídeos usados amplificaram 22 locos, dos quais 17 foram polimórficos considerando todas as populações (Tab. 1). Todas as populações apresentaram alelos exclusivos, só encontrados em indivíduos de uma população. A endogamia intrapopulacional média foi muito elevada, 0,74, sendo o menor valor encontrado para a população de Caicó, 0,47 e o maior para Jaguarari, 0,94 (Tab. 1). Estes valores indicam que a espécie se propaga, em grande parte, por autofecundações e a sua significância (P<0,05) mostra que as populações não são panmíticas. Tabela 1. Resumo dos resultados obtidos com a análise das populações com marcadores SSR. H o heterozigosidade observada; H s heterozigosidade esperada; F IS coeficiente de endogamia intrapopulacional População % de Locos polimórficos por loco polimórficos por loco exclusivos Ho H E F IS Macururé 40,9 1,64 2, ,0289 0,137 0,79* Jaguarari 40,9 1,45 2,11 6 0,0068 0,121 0,94* Caicó 59,1 1,68 2,15 9 0,1103 0,205 0,47* Média 49,97 1,59 2,27 8,7 0,0487 0,154 0,74** 1 Todas 77,3 2,50 2,94-0,0376 0,88** FIS 2 - FIT A heterozigosidade esperada foi baixa (Tab. 1), tanto quanto considerados os valores para cada população quanto para o valor médio. Portanto, como este parâmetro pode ser interpretado como uma medida de diversidade genética, as populações conhecidas da espécie apresentam baixa diversidade. A proporção da variabilidade presente entre as populações foi bastante elevada, com valor de F ST igual a 0,54. Este valor expressa que 54% da variabilidade genética total observada se deve às diferenças entre as populações. Quando as populações são avaliadas duas a duas quando ao F ST (Tab. 2), a população de Macururé é a que apresenta maior diferença em relação entre as demais populações. Resultado similar foi obtido em relação à distância genética de Nei (Tab. 2), em que Macururé foi novamente à população geneticamente mais distante. Tabela 2. F ST entre populações (abaixo da diagonal) e distância genética segundo Nei (1972) (acima da diagonal) População Macururé Jaguarari Caicó Macururé - 0,22 0,30 Jaguarari 0,56-0,21 Caicó 0,56 0,50 -

4 As populações, em média, não se apresentam em equilíbrio de Hardy-Weinberg. Em nenhum dos locos avaliados houve excesso de heterozigotos em relação à freqüência esperada se as populações estivessem em equilíbro. O conjunto dos dados obtidos indica que as populações de G. mustelinum se reproduzem mesclando autofecundações e fecundações cruzadas. Embora este comportamento reprodutivo seja o mesmo observado nas espécies cultivadas do gênero, populações ferais do algodoeiro mocó (G. hirsutum var. marie galante) apresentaram valores muito mais baixos de endogamia (Barroso, dados não publicados) e a estrutura floral de G. mustelinum parece favorecer mais a polinização cruzada do que a encontrada em algodoeiros mocó. A população com menor número de indivíduos adultos, cerca de 11, foi localizada em Caicó (RN). Porém, ela apresentou maior diversidade e menor coeficiente de endogamia do que as demais. Este resultado, a princípio inesperado, pode ser explicado pelo bom nível de conservação e isolamento observados in situ. Ela está situada em local muito ermo e os efeitos da agricultura e pecuária foram menos intensos do que nas outras populações. A população de Jaguarari é a que apresentava o maior número de indivíduos adultos e a única em que grande quantidade de plântulas estava presente. Porém, ela é a que apresenta menores níveis de diversidade. A provável causa da menor diversidade deve ter sido um grande gargalo que esta população deve ter passado no passado recente. Esta população estava muito depauperada devido à criação extensiva de caprinos e o atual número de indivíduos deve-se à cerca construída pela Mineração Caraíba, proprietária das terras em que a população foi localizada, para proteger sua bacia de rejeitos. Após a construção da cerca, os caprinos foram mantidos fora da área e o número de indivíduos da população aumentou. Mas, este aumento deve ter sido realizado a partir de poucas plantas e por isso a população possui diversidade mais baixa que as demais. A população de Macururé apresentou níveis intermediários de variabilidade e o número de plantas existentes in situ também é intermediário. Durante as visitas realizadas à população pôde-se perceber que esta população está em decadência devido a presença de grande quantidade de caprinos. Os animais se alimentam de plantas jovens e adultas. No caso das plantas jovens, eles ingerem toda a planta, dificultam a renovação da população. Parte das plantas adultas também foi morta devido à alimentação dos caprinos, que no auge do período seco estavam comendo a casca dos caules, interrompendo o fluxo de fotoassimilados entre a parte aérea e o sistema radicular. Sob o ponto de vista de conservação in situ, esta é população que necessita de ações mais urgentes. A pequena diversidade existente nas populações de G. mustelinum conhecidas, associado ao pequeno número de indivíduos existente em cada uma das populações torna a espécie muito vulnerável. A manutenção in situ das populações depende de atitudes relativamente simples e que devem ser implementadas o mais rapidamente possível. CONCLUSÕES Gossypium mustelinum apresenta baixa diversidade genética e níveis elevados de endogamia. (*) Atividades desenvolvidas com recurso da FINEPE e Embrapa

5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS NEVES, O. S.; GRIDI-PAPP, I. L.; CAVALERI, P. A.; FERRAZ, C. A. M.; FUZATTO, M. G.; SILVA, N. M.; SCHMIDT, W.; CORRÊA, D. M. Distribuição geográfica atual dos algodoeiros perenes no Brasil. Primeiro Levantamento Parcial. Bragantia, v. 27, n. 35, p , CRESTE, S.; TULMANN NETO, A.; FIGUEIRA, A. Detection of Single Sequence Repeat Polymorphisms in Denaturing Polyacrylamide Sequencing Gels by Silver Staining. Plant Molecular Biology Repórter, v. 19, p , FREIRE, E. C.; BARROSO, P. A. V.; PENNA, J. C. V.; BORÉM, A. Fluxo gênico: Análise do caso algodão no Brasil. Biotecnologia, Ciência e Desenvolvimento, v. 29, p , GOUDET, J. FSTAT, a program to estimate and test gene diversities and fixation indices (version 2.9.3) Disponível em < LIU, S.; CANTRELL, R. G.; MCCARTY, J. C.; STEWART, J. McD. Simple Sequence Repeat Based Assessment of Genetic Diversity in Cotton Race Stock Accessions. Crop Science, v. 40, p , NEI, M. Molecular Evolutionary Genetics. New York: Columbia University Press, RAYMOND, M.; ROUSSET, F. GENEPOP (version 1.2): population genetics software for exact tests and ecumenicism. Journal of Heredity, v. 86, p , WEIR, B. S.; COCKERHAM, C. C. Estimating F-statistics for the analysis of population structure. Evolution, v. 38, p , 1984.