SELEÇÃO DISRUPTIVA EM CITÓTIPOS SIMPÁTRICOS EM ASTYANAX AFF. FASCIATUS (LAMBARI-DO-RABO- VERMELHO)

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1 SELEÇÃO DISRUPTIVA EM CITÓTIPOS SIMPÁTRICOS EM ASTYANAX AFF. FASCIATUS (LAMBARI-DO-RABO- VERMELHO) DISRUPTIVE SELECTION IN SYMPATRIC CYTOTYPE IN ASTYANAX AFF. FASCIATUS (RED-TAILED PIABA) Snaydia Viegas Resende (1) Rosana de Mesquita Alves (2) Renan Rodrigues Rocha (2) Karine Frehner Kavalco (3) Rubens Pazza (3) Resumo Microssatélites são marcadores moleculares que apresentam alto nível de polimorfismo alélico e por isso são amplamente utilizados para resolução de problemas taxonômicos, evolutivos e melhoramento genético. Neste trabalho, foram utilizados para testar se exemplares de Astyanax aff. fasciatus (lambari-do-rabo-vermelho) do rio Mogi-Guaçu são uma única unidade taxonômica evolutiva. Nos dois lóci SSR analisados foi observado número maior de homozigotos que o esperado, enquanto os heterozigotos foram observados em menor número que o esperado. Esse padrão sinaliza a existência de uma pressão contra o heterozigoto nessas populações, característica da seleção disruptiva, que é uma das principais forças que podem levar a especiação de organismos em simpatria. A obtenção e análise de número maior de lóci microssatélites podem consolidar essa observação. Palavras-chave: Astyanax. Microssatélites. Mogi-Guaçu. Abstract Microsatellites are genetic markers with a high level of allelic polymorphism, and are widely used to solve taxonomy problems. In this study, we aimed to test whether Astyanax aff. fasciatus (red-tailed piaba) in the Mogi-Guaçu River are a single-unit, evolutionary taxonomy dilemma. In a simple sequence repeat (SSR) loci-analysis, we observed more homozygous and fewer heterozygous individuals than expected. This pattern indicates selection against heterozygous groups in these populations, characteristic of disruptive selection, and one of the main forces leading to sympatric speciation bodies. Gathering more microsatellite loci-analyses might help to consolidate this observation. Key words: Astyanax. Microsatellites. Mogi-Guaçu. 1 Bióloga pela UFV/Rio Paranaíba, Mestranda do Programa de Pós-Graduação em Manejo e Conservação de Ecossistemas Naturais e Agrários na UFV/Florestal; 2 Bacharéis em Ciências Biológicas pela UFV/RP 3 Professores Doutores orientadores do Laboratório de Genética Ecológica e Evolutiva UFV/CRP.

2 1. Introdução Astyanax fasciatus (lambari-do-rabo-vermelho) é uma espécie de pequeno porte, pertencente à família Characidae, que apresenta distribuição ampla no Brasil, pode ser encontrado em rios das bacias do São Francisco e Paraná (ARTONI et al, 2006; BARBOSA e SOARES, 2009.). Muitas espécies em que são observadas diferenças cariotípicas podem representar complexos de espécies no gênero Astyanax (PAZZA et al., 2007) e em outros gêneros. Em função dessa diversidade, existe uma procura de métodos pelos quais as espécies podem ser facilmente identificadas e delimitadas (HAUSDORF, 2011). O objetivo do presente trabalho é esclarecer se os indivíduos de Astyanax aff. fasciatus do rio Mogi- Guaçu caracterizam de uma unidade taxonômica evolutiva utilizando como marcadores moleculares SSR - Simple Sequence Repeats. 2. Material e Métodos As amostras dos diferentes citótipos de Astyanax aff. fasciatus do rio Mogi- Guaçu, se encontram no Banco de Tecidos do Laboratório de Genética Ecológica e Evolutiva (LaGEEvo), da Universidade Federal de Viçosa, campus Rio Paranaíba. Para extração de DNA total, foram utilizadas partes de órgãos como fígado, coração, músculo e nadadeiras. Para os testes de amplificação cruzada, foram utilizados 12 primers produzidos através de DNA de Astyanax mexicanus e cedidos por Strecker ao LaGEEvo, sendo eles Ast 4, Ast 9, Ast 10, Ast 13, Ast A, Ast C, Ast P, Ast I, Ast J, ASt R, Ast F e Ast K. Foram utilizados 3 μl de tampão da enzima, 1,5μL de MgCl 2, 2 μl de cada primer, 0,4 μl de Taq DNApolimerase, 8,1 μl de água ultra-pura, 2 μl de dntp e 7 μl da solução de uso de DNA extraído, em um volume final de 26 μl. A visualização dos produtos de PCR foram realizadas em gel de agarose 4% utilizando transiluminador UniScience. Os géis foram fotografados e documentados com o software de captura de imagem Lpix STI/Loccus. No software Genepop 4.2 foram realizadas análises de diferenciação gênica entre os citótipos padrão (teste G), com parâmetros da cadeia de Markov; calculado o número de migrantes por geração

3 (Nm), bem como número de homozigotos e heterozigotos observados/esperados, (os esperados calculados pelo software nas condições esperadas de equilíbrio de Hardy- Weinberg). 3. Resultados e discussão Dos 12 primers testados para obtenção de lóci microssatélites, Ast J e Ast K amplificaram satisfatoriamente. Para os indivíduos de citótipo padrão 2n = 48, no lócus Ast K foram obtidos seis alelos, de 140, 160, 180, 190, 200 e 240 pares de bases. O lócus Ast J apresentou menor polimorfismo, com três alelos, de 210, 280 e 380 pares de bases. A tabela 1 mostra a relação entre homozigotos e heterozigotos observados e esperados nos dois loci. TABELA 1 Homozigotos e heterozigotos esperados e observados no citótipo 2n = 48 para dois lóci microssatélites. Ast K Ast J Esperados Observados Esperados Observados Homozigotos 3, , Heterozigotos 14, , Apenas quatro alelos foram identificados no lócus Ast K nos indivíduos do citótipo padrão 2n = 46: , 200 e 240 pares de base e apenas dois alelos foram identificados no lócus Ast J, 210 e 320 pares de base. A tabela 2 mostra a relação entre homozigotos e heterozigotos observados e esperados nos dois loci. TABELA 2 Homozigotos e heterozigotos esperados e observados no citótipo 2n = 46 para dois lóci microssatélites. Ast K Ast J Esperados Observados Esperados Observados Homozigotos 2, , Heterozigotos 7, , A análise de diferenciação gênica não evidenciou divergência significativa entre os citótipos padrão 2n = 46 e 2n = 48. Foi observado o valor de p= para Ast K e p= para Ast J, com intervalo de confiança p menor ou igual a 0,005. O número de migrantes por geração (Nm) obtido a partir dos dados corrigidos de tamanho da amostra foi Isso significa que a cada geração, sete indivíduos de um citótipo padrão (2n = 46 ou 2n = 48) cruzam com um indivíduo do outro.

4 As análises de lóci microssatélites evidenciaram discrepância entre o número de homozigotos e heterozigotos esperados e observados. Exceto nos indivíduos de citótipo 2n = 46 no lócus Ast J, todos os homozigotos apresentaram números maiores que o esperado, enquanto os heterozigotos, o oposto. Considerando principalmente o lócus mais polimórfico, Ast K, pode-se notar que eram esperados 4 homozigotos nos indivíduos 2n = 48 e foram observados 13, contra 14 heterozigotos esperados e 5 observados. Para indivíduos 2n= 46 nesse lócus, eram esperados cerca de 2 homozigotos e número observado foi cinco; o número de heterozigotos foi menor que o esperado, também cinco. A partir desses dados, pode-se inferir que existe uma pressão considerável contra heterozigotos de ambos os citótipos padrão (2n = 46 e 2n = 48) que, ao mesmo tempo, favorece a incidência de homozigotos nas populações. A seleção que favorece os fenótipos extremos, originados geralmente por homozigotos na população, é denominada seleção disruptiva (RUEFFLER et al, 2006). Segundo Rueffler e colaboradores (2006), a seleção disruptiva afeta as distribuições de frequência de alelos e genótipos dentro de uma população, aumenta variação genética por alelos correspondentes que favorecem a fenótipos extremos, resultando em um polimorfismo genético com heterozigotos em desvantagem. Se considerarmos os citótipos padrão 2n = 46 e 2n = 48 como duas características extremas nas populações de Astyanax aff fasciatus do rio Mogi-Guaçu, pode-se acreditar que estão sob seleção e que, em algum momento, ocorra especiação simpátrica entre populações que possuem os diferentes citótipos, efetivamente se surgirem mecanismos reprodutivos que cessem o fluxo gênico ainda alto entre eles, acasalamento preferencial, por exemplo (DIECKMANN e DOEBELI, 1999). 4. Conclusão A análise dos lóci nucleares sinalizou para o processo de separação ainda maior que pode estar ocorrendo entre os dois citótipos por seleção disruptiva. O estudo de maior número de microssatélites pode consolidar essa hipótese.

5 5. Agradecimentos Agradeço à Fundação de Apoio a Pesquisa de Minas Gerais (FAPEMIG) pelo suporte financeiro ao projeto e ao Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Tecnológico (CNPq) pela bolsa de iniciação científica concedida. Referências ARTONI, R.F.; SHIBATTA, O.A.; GROSS, M.C.; SCHNEIDER, C.H.; ALMEIDA, M.C.D.; VICARI, M.R.; BERTOLLO, L.A.C. Astyanax aff. fasciatus Cuvier, 1819 (Teleostei; Characidae): evidences of a species complex in the upper rio Tibagi basin (Paraná, Brazil). Neotropical Ichthyology, v.4, n.2, p , BARBOSA, J.M.; SOARES, E.C. Perfil da ictiofauna da bacia do São Francisco: estudo preliminar. Revista Brasileira de Engenharia de Pesca, v. 4, n. 1, p , DIECKMANN, U.L.F; DOEBELI, M. On the origin of species by sympatric speciation. Nature, v.400, n.6742, p , HAUSDORF B.; WILKENS H.; STRECKER U. Population genetic patterns revealed by microsatellite data challenge the mitochondrial DNA based taxonomy of Astyanax in Mexico (Characidae, Teleostei). Molecular Phylogenetics and Evolution, v.60, p , PAZZA, R.; KAVALCO, K.F.; PRIOLI, S.M.A.P.; PRIOLI, A.J.; BERTOLLO, L.A.C. Chromosome polymorphism in Astyanax fasciatus (Teleostei, Characidae), Part 3: Analysis of the RAPD and ISSR molecular markers. Biochemical Systematics and Ecology, v.35, n.12, p , RUEFFLER, C.; VAN DOOREN, T.J.; LEIMAR, O.; ABRAMS, P.A. Disruptive selection and then what?. Trends in Ecology & Evolution, v.21, n.5, p , 2006.