XII CURSO DE INVERNO DE GENÉTICA FCAV/UNESP

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1 ESTRUTURAÇÃO DE POPULAÇÕES DE LAMBARI NA BACIA DO ALTO PARANAÍBA INFERIDAS PELO GENE CITOCROMO b. POPULATION STRUCTURE OF LAMBARI FISHS FROM UPPER PARANAÍBA RIVER BASIN INFERRED BY CYTOCHROME b GENE. Rosana de Mesquita Alves (1) Renan Rodrigues Rocha (2) Snaydia Viegas Resende (3) Karine Frehner Kavalco (4) Rubens Pazza (4) Resumo Astyanax paranae (Characidae), espécie endêmica da Bacia do Paraná, habita regiões de cabeceiras de cursos d água, intensificando o grau de endemismo presente nas populações e, futuramente, causando uma especiação alopátrica. Suposições apontam que a espécie não representa uma unidade monofilética, fazendo-se necessários estudos filogeográficos e filogenéticos da mesma. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a estruturação genética de cinco populações de Astyanax paranae e demonstrar as relações evolutivas intraespecíficas, levando em conta os resultados obtidos por sequenciamento do gene mitocondrial citocromo b. Os resultados demonstram a estruturação de duas populações, explicada pelo isolamento geográfico e adaptação local das mesmas. As outras três se apresentaram diversificadas, principalmente devido ao fato das migrações realizadas durante o período reprodutivo. Palavras-chave: Citocromo b. Peixe. Reprodução. Abstract Astyanax paranae (Characidae), an endemic species of the Paraná Basin, inhabits the headwater regions of waterways, increasing the degree of endemism present in the population, and in the future, causing an allopatric speciation. Assumptions indicate that the species does not represent a monophyletic unit, making phylogeographic and phylogenetic studies of it necessary. This study aimed to evaluate the genetic structure of five populations of A. paranae and demonstrate intraspecific evolutionary relationships, taking into account the results obtained by sequencing the mitochondrial cytochrome b gene. The results show the structure of two populations, explained by geographical isolation and local adaptation. The other three presented diverse sequences, mainly because of migration during the reproductive period. Keywords: Cytochrome b. Fish. Reproduction. (1) Bacharela em Ciências Biológicas pela UFV/CRP. (2) Bacharel em Ciências Biológicas pela UFV/CRP. (3) Bióloga pela UFV/CRP, Mestranda do Programa de Pós-Graduação em Manejo e Conservação de Ecossistemas Naturais e Agrários na UFV/Florestal. (4) Professores doutores orientadores do Laboratório de Genética Ecológica e Evolutiva da UFV/CRP.

2 1. Introdução O gênero Astyanax (Baird e Girard, 1854) é representado por cerca de 155 espécies (Eschmeyer, 2015) e se encontra amplamente distribuído nos cursos d água da região Neotropical (Eschmeyer e Fong, 2013). Pertencente ao gênero, a espécie Astyanax paranae, popularmente chamado lambari, é um peixe de pequeno porte habitante de cabeceiras de rios e riachos da Bacia do Paraná, na qual é considerada endêmica. Além disso, possui hábitos alimentares diversos e período reprodutivo de agosto à fevereiro, no qual realiza curtas migrações (Suzuki et. al., 2004). Análises citogenéticas já realizados demonstram variação no número diploide da espécie, sugerindo que Astyanax paranae forme um complexo de espécies na bacia (Moreira- Filho et al., 1991). Diante disso, vê-se a necessidade de estudos filogeográficos que possibilitem a compreensão da estruturação genética das populações. Estes podem ser feitos através de ferramentas moleculares, tal como o uso de genes mitocondriais, como por exemplo o gene citocromo b. Sua utilidade se deve ao fato de que sua região pode ser amplificada em inúmeras espécies de animais, utilizando apenas de um par de iniciadores universais na Reação em cadeia da Polimerase (PCR) (Bartlett, 1992; Branicki, et. al., 2003; Kocher, 1989), e por ser um dos mais conservados entre os organismos (Sacoone, 1994). O trabalho tem como objetivo avaliar a estruturação genética de cinco populações distintas de Astyanax paranae e demonstrar as relações evolutivas e diversidade dentro da espécie, levando em conta os resultados obtidos por sequenciamento do gene mitocondrial citocromo b. 2. Material e Métodos Foram utilizados indivíduos, pertencentes à coleção do Laboratório de Genética Ecológica e Evolutiva da UFV/CRP, de cinco diferentes populações de Astyanax paranae, coletados na Bacia do Rio Paranaíba, para extração de DNA e posterior utilização em Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) segundo Perdices (2002), com alterações necessárias na

3 receita. Para amplificação do gene foram utilizados os primers H CGAYCTTCGGATTACAAGAC3 e GluDG.L - 5 TGACCTGAARAACCAYCGTT3 (Perdices, 2002). Para análise e visualização das sequências obtidas e posterior alinhamento utilizando o algoritmo ClustalW v1.6 (Thompson et al., 1994) foi utilizado software MEGA v6.06 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) (Tamura et al., 2011), aplicando-se penalidades para os alinhamentos par-a-par e múltiplos, para abertura (20) e extensão de gaps (6,66). O modelo aplicado, o qual foi calculado pelo software MEGA v6.06, foi o HKY+I (Tamura et al., 2011), a partir do qual gerou-se um filograma de Máxima Verossimilhança (MV). 3. Resultados e Discussão A análise de Máxima Verossimilhança do gene Cyt b estruturou as 29 sequências em dois agrupamentos principais e consistentes de acordo com os elevados valores de bootstrap (94 e 99%), sendo um deles composto apenas por uma das populações (Parque de Exposições), e o outro pelas demais, no qual formou-se quatro subgrupos. Desses subgrupos, um foi formado apenas pela população do rio São João, enquanto indivíduos das demais populações se mantiveram com distribuição variada ao longo dos outros três (Figura 1). Os indivíduos do Rio Paranaíba se mantiveram em sua maioria estruturados. O isolamento entre populações causado por barreiras geográficas faz com que cada população, restrita ao seu espaço, desenvolva ao longo do tempo, e em seu próprio sistema, características próprias e distintivas (Lowe-McConnell, 1969). Tais barreiras também impedem/diminuem o fluxo gênico entre populações, reforçando ainda mais o isolamento e estruturação das mesmas. A adaptação local de cada população pode ser a responsável pela estruturação de algumas das populações (Sidlauskas, 2008), como aconteceu com a do Parque de Exposições. Enquanto isso, a migração realizada durantes períodos de reprodução da espécie, por exemplo, podem ser responsáveis pela estruturação mais sutil observada nas demais.

4 FIGURA 1- Árvore construída pelo método de Máxima Verossimilhança, demonstrando as relações evolutivas e agrupamentos entre populações de Astyanax paranae. Legenda: RP1: Rio Paranaíba ponto 1; AG5: Água Grande ponto 5; ZAR: córrego Parque do Zarico; SJ2: São João ponto 2; EXPO: Parque de Exposição, cada um referente ao local de coleta dos indivíduos. Os valores dos ramos representam os valores de bootstrap, que servem de suporte para os clados RP RP RP RP RP RP RP AG ZAR 3071 ZAR 3153 AG RP AG RP ZAR 3250 RP SJ SJ SJ SJ SJ SJ EXPO 2998 EXPO 3000 EXPO 3001 EXPO 3002 EXPO 3003 EXPO 2999 EXPO 4. Conclusão A técnica molecular baseada no gene mitocondrial Citocromo b se mostrou eficiente para demonstrar a estruturação das cinco populações de Astyanax paranae estudadas. Os resultados permitem inferir relações evolutivas entre as mesmas, reforçando, assim, sua utilização em estudos filogeográficos. Apoio financeiro: Fapemig. CNPQ.

5 Referências BAIRD, SPENCER, F., E CHARLES GIRARD. Descriptions of new species of fishes collected by Mr. John H. Clark, on the U. S. and Mexican Boundary Survey, under Lt. Col. Jas. D. Graham. 6 (1852, 1853):390, Phila., Proc. Acad. Nat. Sei., BARTLETT SE, DAVIDSON WS. FINS. Forensically Informative Nucleotide Sequencing: procedure for identifying the animal origin of biological specimens. Biotechniques 12: BRANICKI, W., KUPIEC, T., E PAWLOWSKI, R. Validation of cytochrome b sequence analysis as a method of species identification. Journal of forensic sciences 48(1), ESCHMEYER WN, FONG JD. Catalog of Fishes. Disponível em: ESCHMEYER, W.N. (ed.). Catalog of fishes. Updated internet version of 05 March KOCHER, T. D., THOMAS, W. K., MEYER, A., EDWARDS, S. V., PAABO, S., VILLABLANCA, F. X., E WILSON, A. C. Dynamics of mitochondrial DNA evolution in animals: amplification and sequencing with conserved primers. Proceedings of the National Academy of Sciences 86(16), LOWE-MCCONNELL R. H. Speciation in tropical freshwater fishes. Biological Journal of the Linnean Society 1: MOREIRA-FILHO, O. E BERTOLLO, L. A. C. Astyanax scabripinnis (Pisces, Characidae) a species complex. Rev Brasil Genet 142: PERDICES, A, BERMINGHAM, E, MONTILLA, A, DOADRIO, I. Evolutionary history of the genus Rhamdia (Teleostei: Pimelodidae) in central America. Molecular Phylogenetics and Evolution 25(1): SACCONE, C. The evolution of mitochondrial DNA. Current Opinion in Genetic and Development 4: SIDLAUSKAS B.Continuous and arrested morphological diversification in sister clades of Characiform fishes: A phylomorphospace approach. Evolution 62: SUZUKI, H. I.; VAZZOLER, A. E. A. M.; MARQUES, E. E.; LIZAMA, M. A. P.; INADA, P. Reproductive ecology of the fish assemblage. The Upper Paraná River and its floodplain: physical aspects, ecology and conservation. Leiden: Backhuys Publishers p In: Thomaz, S. M.; Agostinho, A. A.; Hanh, N. S. (Ed.) TAMURA K., PETERSON D., PETERSON N, STECHER G., NEI M., KUMAR S. MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods. Molecular Biology and Evolution 28:

6 THOMPSON J. D., HIGGINS D. G., GIBSON T. J. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research 22: