O USO DE RFLP NA FILOGEOGRAFIA DE CAROLLIA PERSPICILLATA, LINNAEUS 1758 (CHIROPTERA: PHYLLOSTOMIDAE).

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1 O USO DE RFLP NA FILOGEOGRAFIA DE CAROLLIA PERSPICILLATA, LINNAEUS 1758 (CHIROPTERA: PHYLLOSTOMIDAE). Ana Carolina Pavan1 * & Albert David Ditchfield 2 1,2 Universidade Federal do Espírito Santo, Departamento de Biologia. 1 Atualmente na Universidade de São Paulo, Instituto de Biociências. *anacarolinapavan@hotmail.com Abstract. Molecular data has been used succesfully in evolutionary biology, allowing accurate estimates for genetic diversity within and between populations in a species, identify clades and test biogeographic hypothesis. The short-tailed fruit bat Carollia perspicillata belongs to the subfamily Carollinae (Chiroptera: Phyllostomidae) and is distributed from Mexico to Brazil, Paraguay and Argentina. In a previous study using mtdna cytochrome b gene sequences, two haplotype groups were identified in Latin America for C. perspicillata. One of these groups, identified as Clade B, was distributed along the Brazlian Atlantic Forest, while the other group, Clade A, occurred from Central America and the Guyanas to Northeastern Brazil, where it co-occurred in full sympatry for some locaties in the Northern portion of the Atlantic Forest. The objective of this study was to determine if RFLP identifies the same clades previously identified from cytochrome b sequences, and if the individuals from the Amazon region, which had not been sampled in the previous study, would fit within one of these clades. The results show that Amazonian samples belong to both clades and suggests that the Amazon region might be a gradient or cline with a transition from Clade A (Northern) and Clade B (Coastal and Southern), that developed perhaps due to a break in gene flow due to geographic isolation. Keywords: Filogeografia, citocromo b, RFLP, Carollia perspicillata, Mata Atlântica INTRODUÇÃO A Filogeografia, ou estudo da distribuição geográfica das linhagens de genes dentro de uma espécie, ou em espécies próximas (Avise, 1994), têm sido usada com sucesso na biologia evolutiva, permitindo a determinação de clados intraespecíficos e o teste de hipóteses biogeográficas, entre outras coisas. Os estudos filogeográficos são baseados nos dois maiores aspectos da variabilidade intraespecífica do mtdna: sua estrutura hierárquica, ou seja, magnitude e padrão de divergência filogenética do mtdna; e sua partição geográfica, ou grau de subdivisão geográfica dos agrupamentos filogenéticos, ou clados (Ditchfield & Burns, 1998). A espécie frugívora Carollia perspicillata distribuise do México até Brasil, Paraguai e Argentina, sendo um morcego de pequeno a médio porte, caracterizado por possuir pêlos tricolores em seu dorso, claros no meio e escuros na base e à medida que terminam (Cloutier & Thomas, 1992). É freqüentemente o morcego mais comum em regiões baixas e são encontrados na maioria das florestas sazonais, sendo mais abundantes em florestas secundárias. São especialistas no sub-dossel, alimentando-se de frutas de arbustos e árvores de pequeno porte, especialmente do gênero Piper. Carollia perspicillata complementa sua dieta com néctar e pólen durante a estação seca, quando as frutas são escassas, contribuindo também para a polinização de várias espécies vegetais (Fleming, 1988). Dessa maneira, esses morcegos têm se apresentado como importante instrumento no processo de regeneração florestal através da dispersão de sementes por clareiras nas florestas, principalmente quando se considera também a sua abundância (Fleming, 1988). Através do seqüenciamento de um gene do mtdna, o citocromo b, Ditchfield (2000), foi demonstrado que C. perspicillata apresenta uma estrutura evidente de distribuição geográfica da diversidade molecular, possuindo dois grupos de haplótipos diferentes na América Latina. Um deles encontra-se disperso pelo litoral brasileiro, abrangendo localidades das regiões Sul, Sudeste e Nordeste, enquanto o outro foi verificado em indivíduos da região das Guianas e na América Central. No Nordeste brasileiro, os dois haplótipos são encontrados em simpatria plena. Em complementação, foi realizado um estudo de filogeografia comparativa abrangendo as cinco espécies do gênero Carollia (Hoffmann & Baker, 2003) e os dados encontrados para C. perspicillata corroboram aqueles de Ditchfield (2000). O padrão filogeográfico até agora evidenciado para C. Page 244

2 perspicillata no litoral da América do Sul poderia ser generalizado, além de ser testada uma hipótese biogeográfica através da análise de indivíduos provenientes da Amazônia. Potencialmente, os indivíduos da Região Amazônica poderiam apresentar quatro padrões filogeográficos distintos: primeiro, eles pertenceriam ao grupo que inclui a América Central e a Guiana Francesa, ocorrendo até o Nordeste do país (Fig. 1.1); segundo, os haplótipos poderiam ser mistos, indicando uma zona de contato secundária ampla, se estendendo numa faixa do Nordeste até a Bacia Amazônica (Fig. 1.2); terceiro, o padrão apresentado seria do tipo do Sul, sugerindo que os haplótipos do Norte ocorrem ao longo do litoral da Guiana ao Nordeste, não estando presentes dentro da bacia Amazônica (Fig. 1.3); finalmente, a quarta alternativa seria que o(s) haplótipo(s) da Bacia Amazônica comporiam um novo clado, com pouca ou nenhuma contribuição dos haplótipos Norte e Sul (Fig. 1.4). Com a utilização da técnica de RFLP (polimorfismos de cumprimento de fragmento de restrição) foi testado se indivíduos de uma população amazônica se enquadram ou não em um dos dois clados já estabelecidos anteriormente para C. perspicillata. Assim, o presente estudo teve por objetivos testar se a técnica de RFLP identifica os mesmos clados obtidos através do seqüenciamento de citocromo b de algumas amostras litorâneas, e ampliar o padrão filogeográfico da espécie a partir da determinação dos haplótipos presentes em amostras obtidas na região Amazônica. ÁREA DE ESTUDO E METODOLOGIA Foram analisadas amostras de 29 indivíduos coletados no Município de Santa Isabel do Rio Negro, na Região Amazônica, provenientes de localidades da margem direita (Mandiquié, Ecunawi e Aiuanã) e da margem esquerda (Santa Isabel do Rio Negro e Marauiá) do Rio Negro. Além disto, 36 exemplares provenientes de localidades da Mata Atlântica, desde o Nordeste até o Paraná, também foram amostrados por RFLP. Destas amostras, 23 foram seqüenciadas anteriormente por Ditchfield (2000) e, a partir das análises com RFLP, podese estabelecer os parâmetros de comparação entre as amostras amazônicas e as de Mata Atlântica ainda não seqüenciadas. A extração de DNA foi realizada a partir de pequenos fragmentos de tecido hepático, seguindo o protocolo padrão de extração de DNA total (SDS/NaCl/ Proteinase K) descrito por Bruford et al. (1992). Em seguida, foi amplificada a região do mtdna que codifica a enzima citocromo b, através da clonagem in vitro pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), utilizando os primers BAT 05A (5 -CGA CTA ATG ACA TGA AAA ATC ACC GTT G-3 ) e BAT14A (5 -TAT TCC CTT TGC CGG TTT ACA AGA CC-3 ), que foram modificados dos primers criados no Museum of Vertebrate Zoology (Berkeley, CA, USA) e originam um fragmento de, aproximadamente, pares de bases. O perfil da PCR consistiu em 36 ciclos, cada qual envolvendo um período de denaturação de 92ºC por 60 segundos, um período de anelamento a 46ºC por 60 segundos e um período de elongação da fita de DNA de 72ºC por 90 segundos. Foram realizadas digestões com cinco endonucleases de restrição: Hae III, Mbo I, Mse I, Taq I e Alu I. Os produtos das digestões foram verificados em géis eletroforéticos de agarose 2,0% e poliacrilamida 7,0%, nos quais foram aplicados, paralelamente, um DNA padrão (DNA Ladder 1KB, Invitrogen Inc, CA, USA), a fim de que fosse possível estimar o tamanho dos fragmentos gerados pela enzima de restrição. Para cada conjunto de bandas distinto obtido pela digestão do produto de PCR com uma enzima, uma letra do alfabeto foi atribuída. Conseqüentemente, quanto mais padrões gerados pela mesma enzima, mais letras a representavam. Enzimas que exibiram apenas um padrão dentre todas as amostras (não-indicadoras de polimorfismos) só foram representadas por uma letra. Cada conjunto de letras gerado pela combinação de todas as enzimas de restrição polimórficas utilizadas foi considerado um haplótipo, que caracterizou cada uma das amostras. Foi confeccionada uma matriz de dados indicando presença e ausência de fragmentos de restrição nas amostras, contendo os haplótipos encontrados em todas as localidades estudadas, além de um representante de Carollia castanea e um de Rhinophylla pumilio, para compor o grupo externo da matriz. A partir dela foi realizada uma busca exaustiva no software PAUP* (Swofford, 2003), e o critério escolhido para a geração da filogenia foi o método de análise por parcimônia. A topologia encontrada foi utilizada para uma melhor interpretação dos resultados já obtidos, facilitando a seleção de umas das hipóteses filogeográficas propostas para a espécie Carollia perspicillata. RESULTADOS E DISCUSSÃO Foram analisados 65 indivíduos por meio de cinco enzimas de restrição (Hae III, Mbo I, Mse I, Taq I e Alu I), das quais apenas duas - Hae III e Mbo I - foram capazes de distinguir os dois clados observados no seqüenciamento. As outras três enzimas não apresentaram polimorfismo entre as amostras de C. perspicillata analisadas. Os padrões de digestão encontrados para as cinco enzimas podem ser visualizados pela Tabela 1. Na digestão das amostras litorâneas com a enzima Hae III foram distinguidos dois padrões A e B. O padrão A foi característico de amostras provenientes da região Page 245

3 Clado Norte Clado Sul Co-ocorrência de clados Novo clado Figura 1. Esquema dos quatro possíveis padrões filogeográficos existentes na Região Amazônica. Nordeste brasileira, enquanto o padrão de digestão B foi encontrado em duas amostras da região Nordeste e nas amostras das regiões Sudeste e Sul do Brasil, o que correspondeu exatamente aos Clados Norte e Sul, respectivamente, determinados pelo seqüenciamento. Com a enzima Mbo I, as amostras do litoral também foram separadas em dois grupos, correspondentes aos mesmos dois clados determinados anteriormente. Entretanto, três amostras do estado de São Paulo foram exceção para a enzima Mbo I, pois exibiram padrão de restrição equivalente às amostras pertencentes ao Clado Norte, conforme pode ser visualizado na Tabela 2. Para as amostras amazônicas, houve variação nos padrões obtidos pelas duas enzimas indicadoras de polimorfismos. Com a enzima Hae III, ambos padrões identificados no litoral foram encontrados com igual freqüência na população amazônica, enquanto para a enzima Mbo I praticamente todas as amostras de Santa Isabel do Rio Negro exibiram padrão idêntico àquelas da Região Nordeste. Adicionalmente, existiu um terceiro padrão (padrão C) dentre as amostras analisadas na clivagem com ambas as enzimas, sendo Page 246

4 tal padrão encontrado em uma amostra de São Paulo para a enzima Hae III, e uma amostra de Santa Isabel do Rio Negro para a enzima Mbo I (Tabela 2). Com relação às demais enzimas utilizadas (Mse I, Taq I e Alu I) pode-se afirmar que não apontam diferenças na restrição de amostras de Carollia perspicillata de regiões geográficas distintas. Entretanto, a enzima Alu I foi eficaz no reconhecimento de duas amostras correspondentes a espécimes de Carollia brevicauda, apontando uma distinção nos padrões de restrição das amostras apenas inter, e não intraespecífico como as anteriores (Tabela 2). Com a determinação dos padrões de restrição das cinco enzimas para todas as amostras do estudo, foi identificado um total de cinco haplótipos para os indivíduos de Carollia perspicillata, além de um sexto haplótipo, característico de C. brevicauda (Tabela 2). A partir disto, foi elaborada uma matriz de dados indicando presença e ausência dos fragmentos encontrados em cada padrão. Ela foi composta por nove táxons, cada qual correspondendo a um haplótipo distinto encontrado no trabalho, incluindo os grupos externos. Assim, a busca exaustiva realizada no software PAUP* (Swofford, 2003) encontrou sete árvores pelo método de análise por parcimônia, a partir das quais foi feito o consenso (Fig. 2). A baixa resolução encontrada na árvore, com a ocorrência de politomia entre três haplótipos de C. perspicillata e o clado de C. brevicauda, provavelmente se deve ao número reduzido de caracteres analisados, pois segundo as filogenias recentes (Hoffmann & Baker, 2003) existem fortes indícios que constatam a monofilia da espécie. A Figura 2 destaca-se pela presença de um clado formado pelos haplótipos 1 e 2 (Tab. 2), evidenciando uma maior proximidade filogenética entre indivíduos da Região Nordeste e Amazônica em detrimento ao Sudeste brasileiro. Como foram identificados dois haplótipos predominantes para a Mata Atlântica, correspondentes a regiões geográficas distintas, pode-se concluir que a técnica de RFLP é útil na determinação do padrão filogeográfico desta espécie. Para as amostras amazônicas, constatou-se que os haplótipos presentes no município de Santa Isabel do Rio Negro são comuns aos dois grandes clados encontrados no litoral. Com a presença nesta localidade amazônica de haplótipos que ocorrem no Sudeste (2 e 3), assim como daquele observado no Nordeste (1), em freqüências equivalentes, conclui-se que a zona de contato entre os haplótipos do Norte e do Sul deve ser ampla, talvez se estendendo numa faixa desde o Nordeste até a Bacia Amazônica. R. pumilio C.castanea 96 C. brevicauda C. brevicauda 72 Haplótipo 1 - Norte 83 Haplótipo 2 - Novo Haplótipo 3 - Sul Haplótipo 4 - Novo Haplótipo 5 - Novo Figura 2. Valores de bootstrap encontrados para a árvore gerada a partir da matriz de dados de ausência e presença de fragmentos de restrição pelo método de análise por parcimônia. Haplótipo 1 equivale ao padrão das amostras identificadas por Ditchfield (2000) como Clado Norte. Haplótipo 2 corresponde às três amostras de Mata Atlântica com padrão intermediário. Haplótipo 3 equivale ao padrão das amostras identificadas por Ditchfield (2000) como Clado Sul. Haplótipos 4 e 5 representam, respectivamente, um indívíduo de São Paulo e um do Amazonas com padrões diferenciados. Page 247

5 Tabela 1. Padrões de restrição encontrados em Carollia perspicillata para o fragmento de 1240 pb amplificado a partir da região do mtdna codificadora da enzima citocromo b. Enzima Sequência de reconhecimento Padrão de digestão Tamanho dos fragmentos Mbo I 5 GATC 3 A 340, 900 B 300, 340, 600 C 120, 180, 340, 600 Hae III 5 GG CC 3 A 350, 890 B 140, 350, 750 C 140, 280, 350, 470 Alu I 5 AG CT 3 A 180, 340, 720 Taq I 5 T CGA 3 A 12, 215, 500, 515 Mse I 5 T TAA 3 A 270, 970 Tabela 2. Haplótipos obtidos pela digestão do fragmento de 1240pb amplificado a partir do gene do mtdna citocromo b e relação das localidades onde eles ocorrem. Padrões obtidos com enzimas restrição No. de ind. presentes em cada um dos haplótipos nas populações analisadas Mbo Hae Alu Taq Mse Haplótipo PB RN PE SE BA ES RJ SP PR AM Total I III I I I (N=7) (N=1) (N=4) (N=1) (N=1) (N-8) (N=2) (N=11)(N=1) (N=29) (N=65) A A A A A A B A A A B B A A A B C A A A C B A A A B B B A A * 2 Outro resultado conseqüente da análise da população amazônica, no caso com a enzima Hae III, foi o fato da distribuição dos indivíduos dentro dos clados não obedecer à origem dos mesmos. Aqueles provenientes da margem esquerda do Rio Negro não compartilham um único padrão de bandas (haplótipo) ao passo que os originários da margem direita também apresentam ambos os padrões. Isso demonstra que o Rio Negro não serve como barreira geográfica para esta espécie, podendo, portanto, realizar a troca de genes entre indivíduos de ambos os lados do rio. Estes resultados confirmam os dados de vagilidade disponíveis na literatura, que colocam Carollia perspicillata como sendo um migrante de curtas distâncias, deslocandose por mais de 200 km quando necessário (Kunz e Fenton, 2003). Retornando aos quatro possíveis padrões filogeográficos esperados para a população amazônica analisada, observa-se a segunda hipótese como única que não pode ser rejeitada com os dados obtidos. Dessa maneira, acredita-se que os haplótipos presentes na Região Amazônica podem ser mistos, indicando que a zona de contato secundária entre os dois clados é ampla, se estendendo numa faixa desde a Região Nordeste até a Bacia Amazônica. O padrão filogeográfico observado pode ser resultante tanto de um isolamento por distância, quanto por vicariância e subseqüente expansão das populações antes isoladas, com posterior colonização da Amazônia por indivíduos oriundos de refúgios distintos portando haplótipos diferenciados. Para que seja esclarecida qual dessas duas alternativas é a ideal será necessário amostrar novas localidades no Brasil Central e Amazônia. AGRADECIMENTOS Agradecemos ao Conselho Nacional de Page 248

6 Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq pelo auxílio financeiro, ao coordenador do projeto Biodiversidade da Mata Atlântica no Estado do Espírito Santo, Dr. Sérgio Lucena Mendes, a Msc. Caroline Cotrim Aires, pelas críticas e sugestões e, em especial, ao Msc. Felipe Martins, pela inestimável ajuda e paciência durante a confecção dos mapas. REFERÊNCIAS Avise, J.C Molecular markers, natural history and evolution. New York, Chapman & Hall. 511p. Bruford, M. W.; Hanotte, O.; Brookfield, J.F.Y.; Burke, T Single-locus and multilocus DNA fingerprinting. p In: A.R. Hoelzel (ed.). Molecular genetic analyses of populations: A Practical Approach. Oxford: IRL Press. 468p. Cloutier, D. and Thomas, D. W Carollia perspicillata. Mammalian Species, n. 417, p Ditchfield, A. D. & Burns, K DNA Sequences Reveal Phylogeographic Similarities of Neotropical Bats and Birds. J. Comparative Biology, v. 3, n. 2, p Ditchfield, A. D The comparative phylogeography of Neotropical mammals: patterns of intraspecific mitochondrial DNA variation among bats contrasted to non-volant small mammals. Molecular Ecology, v. 9, p Fleming, T. H The short-tailed fruit bat: a study in plant-animal interactions. Chicago: University of Chicago Press. 380p. Hoffmann, F.G. and Baker, R.J Comparative phylogeography of short-tailed bats (Carollia: Phyllostomidae). Molecular Ecology, v. 12, p Kunz, T.H. and Fenton, M.B Bat Ecology. Chicago: University of Chicago Press. 779p. Swofford, D.L PAUP*. Phylogenetic Analysis Using Parsimony (*and other metods). Version 4. Sunderland: Sinauer Associates. Page 249