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1 Supplementary Tables Table S1A. Sampling localities and sample sizes. The abbreviations for the collecting localities used in the main text are given in parenthesis. Locality/Population Reserva Biológica Augusto Ruschi (01-AR) Sampling sites (SS) Coordinates Longitude Latitude SS code n (COI) n (ITS-1) a Current Forest region AR (7) CAF AR (0) CAF Parque Estadual do Desengano (04-ED) Parque Nacional da Serra dos Órgãos (07-SO) Parque Nacional da Serra da Bocaina (10-SB) AR.3-1 (1) CAF ED (1) N-SAF ED (20) N-SAF SO (10) N-SAF SB (6) N-SAF SB (1) N-SAF Campos do Jordão (11-CJ) Parque Estadual da Serra da Cantareira (13-EC) Estação Biológica de Boraceia (16-BB) b b SB (2) N-SAF CJ C-SAF EC C-SAF EC (10) C-SAF BB (22) C-SAF 1

2 Praia de Cambury (19-PC) Parque Estadual de Intervales (22-PI) Parque Nacional de Saint-Hilaire Lange (25-SL) PC (11) C-SAF PI (12) C-SAF SL S-SAF SL (0) S-SAF SL S-SAF SL S-SAF SL (0) S-SAF SL (2) S-SAF Parque Nacional da Serra de Itajaí (28-SI) SI (11) S-SAF SI S-SAF Parque Estadual da Serra do Tabuleiro (31-ST) ST (2) S-SAF ST (3) S-SAF Floresta Nacional de São Francisco de Paula (34-FN) Total FN S-SAF (121) a Number of sequences used in the phylogenetic and in the population genetics (in parenthesis) analyses. b error < 5 km. NAF, North Atlantic Forest; CAF, Central Atlantic Forest; SAF, South Atlantic Forest (based on Cabanne et al. 2008); N-SAF, northern South Atlantic Forest; C-SAF, central South Atlantic Forest; S-SAF, southern South Atlantic Forest 2

3 Table S1B. Cephaloflexa bergi and outgroup specimens used in this study with their GenBank accession numbers. The abbreviations for the collecting localities used in the main text are given in parenthesis. Collecting locality Molecular SS code code N. MZUSP a COI ITS-1 Reserva Biológica. Augusto Ruschi / Espírito F2261 b AR.1 MZUSP PL 1106 KF KF Santo (01-AR) F2263 b AR.1 MZUSP PL 355 KF F2270 b AR.1 MZUSP PL 1107 KF KF F2288 b AR.1 MZUSP PL 356 KF F2328 b AR.1 MZUSP PL 1110 KF KF F2331 AR.1 MZUSP PL 1111 KF KF F2345 AR.1 MZUSP PL KF F2380 b AR.1 MZUSP PL 357 KF F2395 AR.1 MZUSP PL 1114 KF KF F2401 AR.1 MZUSP PL 1115 KF KF F2408 b AR.1 MZUSP PL 1116 KF F2449 b AR.2 MZUSP PL 1117 KF KF F2486 b AR.3 MZUSP PL KF Parque Estadual do Desengano / Rio de Janeiro F2159 b ED.1 MZUSP PL 339 KF (04-ED) F2160 ED.1 MZUSP PL 340 KF F2161 ED.1 MZUSP PL 341 KF F2162 ED.1 MZUSP PL 342 KF F2163 ED.1 MZUSP PL 343 KF KF F2164 ED.1 MZUSP PL 344 KF F2165 b ED.1 MZUSP PL 345 KF F2166 ED.1 MZUSP PL 346 KF F2186 ED.2 MZUSP PL 347 KF KF F2203 ED.1 MZUSP PL 352 KF F2220 ED.2 MZUSP PL 353 KF KF F2222 ED.2 MZUSP PL 354 KF F3987 ED.2 MZUSP PL 620 KF KF F4003 ED.2 MZUSP PL 621 KF KF F4009 ED.2 MZUSP PL 622 KF KF F4010 ED.2 MZUSP PL 623 KF F4013 ED.2 MZUSP PL 624 KF KF F4015 ED.2 MZUSP PL 625 KF F4021 ED.2 MZUSP PL 626 KF KF F4023 ED.2 MZUSP PL 627 KF KF F4025 ED.2 MZUSP PL 628 KF KF F4028 ED.2 MZUSP PL 629 KF KF F4033 ED.2 MZUSP PL 630 KF KF F4034 ED.2 MZUSP PL 631 KF KF F4037 ED.2 MZUSP PL 632 KF KF F4040 ED.2 MZUSP PL 633 KF KF F4046 ED.2 MZUSP PL 634 KF F4058 ED.2 MZUSP PL 635 KF KF F4064 ED.2 MZUSP PL 637 KF F4066 ED.2 MZUSP PL 638 KF F4069 ED.2 MZUSP PL 639 KF KF F4075 ED.2 MZUSP PL 640 KF KF F4077 ED.2 MZUSP PL 641 KF KF F4086 ED.2 MZUSP PL 642 KF KF F4091 ED.2 MZUSP PL 643 KF KF F4093 ED.2 MZUSP PL 644 KF KF Parque Nacional da Serra dos Órgãos / RJ (07- F2573 SO.1 MZUSP PL 360 KF KF SO) F2603 b SO.1 MZUSP PL 363 KF F4184 SO.1 MZUSP PL 854 KF F4191 SO.1 MZUSP PL 855 KF F4192 SO.1 MZUSP PL 856 KF F4193 SO.1 MZUSP PL 857 KF F4196 SO.1 MZUSP PL 858 KF

4 F4198 SO.1 MZUSP PL 859 KF F4199 SO.1 MZUSP PL 860 KF KF F4201 SO.1 MZUSP PL 861 KF F4204 SO.1 MZUSP PL 863 KF F4205 SO.1 MZUSP PL 864 KF KF F4206 SO.1 MZUSP PL 865 KF KF F4207 SO.1 MZUSP PL 866 KF KF F4208 SO.1 MZUSP PL 867 KF F4209 SO.1 MZUSP PL 868 KF KF F4211 SO.1 MZUSP PL 869 KF F4213 SO.1 MZUSP PL 870 KF F4214 SO.1 MZUSP PL 871 KF F4258 SO.1 MZUSP PL 897 KF F4260 SO.1 MZUSP PL 899 KF F4265 SO.1 MZUSP PL 900 KF F4267 SO.1 MZUSP PL 901 KF KF F4274 SO.1 MZUSP PL 905 KF KF F4286 SO.1 MZUSP PL 910 KF KF F4290 SO.1 MZUSP PL 913 KF KF F4298 SO.1 MZUSP PL 915 KF F4299 SO.1 MZUSP PL 916 KF F4300 SO.1 MZUSP PL 917 KF F4302 SO.1 MZUSP PL 919 KF F4303 SO.1 MZUSP PL 920 KF KF F4304 SO.1 MZUSP PL 921 KF F4305 SO.1 MZUSP PL 922 KF F4306 SO.1 MZUSP PL 923 KF F4307 SO.1 MZUSP PL 924 KF KF F4308 SO.1 MZUSP PL 925 KF F4309 SO.1 MZUSP PL 926 KF F4315 SO.1 MZUSP PL 928 KF F4316 SO.1 MZUSP PL 929 KF F4318 SO.1 MZUSP PL 930 KF F4320 SO.1 MZUSP PL 931 KF F4324 SO.1 MZUSP PL 932 KF F4325 SO.1 MZUSP PL 933 KF F4326 SO.1 MZUSP PL 934 KF KF Parque Nacional Serra da Bocaina / São Paulo F2109 b SB.1 MZUSP PL 328 HQ HQ (10-SB) F2794 SB.1 MZUSP PL 397 HQ HQ F2800 b SB.3 MZUSP PL 398 HQ HQ F2801 b SB.3 MZUSP PL 399 HQ HQ F2804 b SB.1 MZUSP PL 400 HQ HQ F2805 b SB.1 MZUSP PL 401 HQ HQ F2811 b SB.2 MZUSP PL 402 HQ HQ F2837 b SB.2 MZUSP PL 405 HQ F2845 b SB.1 MZUSP PL 407 HQ HQ F2846 b SB.1 MZUSP PL 408 HQ HQ Parque Estadual Serra da Cantareira / São Paulo F2935 EC.2 MZUSP PL 422 KF KF (13-EC) F2986 EC.2 MZUSP PL 472 KF KF F2995 EC.2 MZUSP PL 473 KF KF F3008 EC.2 MZUSP PL 475 KF KF F3061 EC.2 MZUSP PL 479 KF KF F3066 EC.2 MZUSP PL 545 KF KF F3522 EC.2 MZUSP PL 548 KF KF F3524 EC.2 MZUSP PL 549 KF F3530 EC.2 MZUSP PL 550 KF KF F3534 b EC.2 MZUSP PL 551 KF KF F3546 EC.2 MZUSP PL 552 KF F3703 EC.1 MZUSP PL 567 KF F3742 EC.2 MZUSP PL 569 KF KF Estação Biológica da Boraceia / São Paulo (16- F2138 b BB.1 MZUSP PL 337 HQ HQ

5 BB) F2149 BB.1 MZUSP PL 338 HQ HQ F4103 BB.1 MZUSP PL 811 KF KF F4110 BB.1 MZUSP PL 813 KF KF F4111 BB.1 MZUSP PL 814 KF KF F4118 BB.1 MZUSP PL 815 KF KF F4120 BB.1 MZUSP PL 816 KF KF F4121 BB.1 MZUSP PL 817 KF F4122 BB.1 MZUSP PL 818 KF KF F4123 BB.1 MZUSP PL 819 KF F4124 BB.1 MZUSP PL 820 KF F4126 BB.1 MZUSP PL 822 KF KF F4127 BB.1 MZUSP PL 823 KF KF F4147 BB.1 MZUSP PL 830 KF KF F4148 BB.1 MZUSP PL 831 KF KF F4149 BB.1 MZUSP PL 832 KF KF F4150 BB.1 MZUSP PL 833 KF KF F4164 BB.1 MZUSP PL 846 KF KF F4165 BB.1 MZUSP PL 847 KF KF F4166 BB.1 MZUSP PL 848 KF KF F4167 BB.1 MZUSP PL 849 KF KF F4168 BB.1 MZUSP PL 850 KF KF F4174 BB.1 MZUSP PL 851 KF KF F4175 BB.1 MZUSP PL 852 KF KF F4176 BB.1 MZUSP PL 853 KF KF Cambury / São Paulo (19-PC) F1034 PC.1 MZUSP PL 303 KC F1035 PC.1 MZUSP PL 304 KF KF F1038 PC.1 MZUSP PL 305 KC F1045 PC.1 MZUSP PL 306 KF F1048 PC.1 MZUSP PL 307 KF KF F4337 PC.1 MZUSP PL 939 KF KF F4338 b PC.1 MZUSP PL 940 KF KF F4339 PC.1 MZUSP PL 941 KF KF F4350 b PC.1 MZUSP PL 951 KF KF F4352 PC.1 MZUSP PL 952 KF F4355 PC.1 MZUSP PL 953 KF KF F4356 PC.1 MZUSP PL 954 KF F4378 PC.1 MZUSP PL 974 KF F4380 PC.1 MZUSP PL 975 KF F4401 PC.1 MZUSP PL 991 KF KF F4403 PC.1 MZUSP PL 992 KF KF F4404 PC.1 MZUSP PL 993 KF F4407 PC.1 MZUSP PL 994 KF KF F4408 PC.1 MZUSP PL 995 KF F4410 PC.1 MZUSP PL 996 KF KF Parque Estadual Intervales / São Paulo (22-PI) F2644 b PI.1 MZUSP PL 370 KF KF F2697 PI.1 MZUSP PL 377 KF KF F2698 PI.1 MZUSP PL 378 KF F2702 PI.1 MZUSP PL 379 KF KF F2769 PI.1 MZUSP PL 389 KF KF F2785 PI.1 MZUSP PL 392 KF KF F3081 PI.1 MZUSP PL 480 HQ F3082 PI.1 MZUSP PL 481 KF F3088 PI.1 MZUSP PL 483 KF F3089 PI.1 MZUSP PL 484 KF KF F3091 PI.1 MZUSP PL 485 KF KF F3095 PI.1 MZUSP PL 486 KF KF F3097 PI.1 MZUSP PL 487 KF KF F3100 PI.1 MZUSP PL 489 KF F3101 PI.1 MZUSP PL 490 KF KF F3104 PI.1 MZUSP PL 491 KF F3105 PI.1 MZUSP PL 492 KF

6 F3109 b PI.1 MZUSP PL 494 HQ HQ F3111 PI.1 MZUSP PL 496 KF KF F3146 PI.1 MZUSP PL 500 KF KF F3798 PI.1 MZUSP PL 615 KF KF F3805 PI.1 MZUSP PL 616 KF Parque Nacional Saint Hilaire / Paraná (25-SL) F1606 SL.1 MZUSP PL 321 KF F1610 b SL.6 MZUSP PL 322 KF KF F1616 b SL.6 MZUSP PL 323 KF KF F1628 b SL.2 MZUSP PL 324 KF KF F1664 b SL.3 MZUSP PL 326 HQ F3583 SL.4 MZUSP PL 558 KF F3584 SL.4 MZUSP PL559 KF F3585 SL.4 MZUSP PL 560 KF F3611 b SL.5 MZUSP PL 565 HQ HQ Parque Nacional Serra de Itajaí / Santa Catarina F1528 SI.1 MZUSP PL 308 KF (28-SI) F1532 SI.1 MZUSP PL 309 KF KF F1555 SI.2 MZUSP PL 310 KF F1570 SI.1 MZUSP PL 311 KF F1572 b SI.1 MZUSP PL 312 KF KF F1576 SI.1 MZUSP PL KF F1580 SI.1 MZUSP PL 314 KF KF F1582 SI.1 MZUSP PL 315 KF KF F1583 SI.1 MZUSP PL 316 KF F1584 SI.1 MZUSP PL 317 KF KF F1585 b SI.1 MZUSP PL 318 KF F1596 SI.1 MZUSP PL 319 KF KF F1598 SI.1 MZUSP PL 320 KF KF F4610 SI.1 MZUSP PL 1103 KF KF F4635 SI.1 MZUSP PL 1104 KF KF F4636 SI.1 MZUSP PL 1105 KF KF Parque Estadual Serra do Tabuleiro / Santa F3230 ST.2 MZUSP PL 501 KF Catarina (31-ST) F3236 b ST.2 MZUSP PL 502 KF KF F3257 ST.2 MZUSP PL 504 KF KF F3295 ST.2 MZUSP PL 506 KF KF F3306 ST.1 MZUSP PL 507 KF KF F3313 b ST.2 MZUSP PL 510 KF F3906 ST.1 MZUSP PL 617 KF KF F3913 ST.1 MZUSP PL 618 KF Outgroup Choeradoplana banga (13-EC) F3011 b MZUSP PL 477 KC Choeradoplana iheringi (31-ST) F3315 MZUSP PL 511 HQ (34-FN) F3400 b FN.1 MZUSP PL 521 HQ Cephaloflexa sp. (01-AR) F2473 AR.2 MZUSP PL KF F2474 AR.2 MZUSP PL KF F2477 AR.2 MZUSP PL KF a Vouchers are deposited in the Museu de Zoologia da Universidade de São Paulo (MZUSP) b Individuals whose internal anatomy has been analyzed morphologically? GenBank accession number not available yet Sequence not obtained 6

7 Table S2A. Results of the neutrality tests for the COI gene Neutrality test Population Tajima sd Fu sf S Ramos-Onsins & Rozas R 2 n D 95% CI F S 95% CI R 2 95% CI 01-AR (-1.733, 1.631) (-1.950, 4.848) 0.245** (0.097, 0.219) 04-ED (-1.691, 1.817) (-5.213, 5.928) (0.061, 0.186) 07-SO (-1.700, 1.920) (-5.197, 5.943) (0.055, 0.180) 10-SB (-1.739, 0.167) (-3.713, 4.738) (0.104, 0.235) 13-EC (-1.685, 1.872) (-2.443, 3.733) (0.111, 0.266) 16-BB (-1.686, 1.941) * (-2.550, 3.960) (0.077, 0.242) 19-PC * (-1.746, 1.638) (-4.504, 5.190) 0.228** (0.080, 0.191) 22-PI (-1.678, 1.917) (-2.756, 4.043) (0.084, 0.242) 25-SL (-1.669, 1.612) (-1.580, 5.057) (0.101, 0.235) 28-SI ** (-1.772, 1.697) (-4.548, 5.229) 0.232** (0.089, 0.209) 31-ST ** (-1.605, 1.577) 6.335* (-1.494, 5.080) 0.279** (0.106, 0.251) *P< 0.05 **P< 0.01(two-tailed test) Population Linkage Disequilibrium n Z ns 95% CI Wall s Q 95% CI 01-AR (0.168, 0.649) (0.102, 0.597) 04-ED (0.046, 0.502) (0, 0.518) 07-SO (0.038, 0.489) (0, 0.5) 10-SB (0.142, 0.717) (0, 0.692) 13-EC (0.011, 1) (0, 1) 16-BB (0.003, 1) 0 (0, 1) 19-PC ** (0.113, 0.543) 0.595* (0.063, 0.482) 22-PI (0.004, 1) 0 (0, 1) 25-SL (0.187, 0.695) (0.115, 0.641) 28-SI ** (0.116, 0.625) 0.877** (0, 0.580) 31-ST ** (0.201, 0.726) 0.851** (0.119, 0.679) *P< 0.05 **P< 0.01(two-tailed test) 7

8 Table S2B. Results of the neutrality tests for the ITS-1 gene Neutrality test Population Tajima sd Fu sf S Ramos-Onsins&RozasR 2 n D 95% CI F S 95% CI R 2 95% CI 01-AR ** (-1.627, 1.634) 6.094* (-2.531, 4.727) 0.315** (0.106, 0.254) 04-ED (-1.653, 1.900) ** (-2.608, 4.020) 0.068** (0.090, 0.248) 07-SO (-1.668, 1.830) (-2.481, 3.779) 0.112* (0.123, 0.300) 10-SB EC (-1.562, 1.641) (-1.430, 2.429) (0.146, 0.300) 16-BB (-1.747, 1.797) (-5.262, 5.604) 0.208* (0.075, 0.192) 19-PC * (-1.721, 1.617) 9.334** (-2.907, 5.050) 0.243* (0.097, 0.219) 22-PI * (-1.747, 1.816) (-2.897, 4.278) (0.108, 0.265) 25-SL SI ** (-1.778, 1.713) 9.321** (-3.679, 4.652) 0.287** (0.101, 0.232) 31-ST (-1.203, 1.583) (-0.365, 5.095) (0.102, 0.348) *P< 0.05 **P< 0.01(two-tailed test) Population LinkageDisequilibrium n Z ns 95% CI Wall s Q 95% CI 01-AR ** (0.190, 0.747) 0.910** (0.087, 0.72) 04-ED (0.004, 1) 0 (0, 1) 07-SO (0.012, 1) (0, 1) 10-SB EC 10 1** (0.012, 1) 1** (0, 1) 16-BB PC ** (0.157, 0.657) 0.898** (0.08, 0.612) 22-PI (0.018, 0.88) (0, 1) 25-SL SI 11 1** (0.121, 0.724) 1** (0, 0.706) 31-ST ** (0.281, 0.867) 0.933** (0.182, 0.851) *P< 0.05 **P< 0.01(two-tailed test) 8

9 Table S3A. D XY values between populations for the COI dataset 01-AR 04-ED SO SB EC BB PC PI SL SI ST AR 04-ED 07-SO 10-SB 13-EC 16-BB 19-PC 22-PI 25-SL 28-SI D a values between populations for the COI dataset 01-AR 04-ED SO SB EC BB PC PI SL SI ST AR 04-ED 07-SO 10-SB 13-EC 16-BB 19-PC 22-PI 25-SL 28-SI 9

10 Table S3B. D XY values between populations for the ITS-1 dataset 01-AR 04-ED SO SB EC BB PC PI SL SI ST AR 04-ED 07-SO 10-SB 13-EC 16-BB 19-PC 22-PI 25-SL 28-SI D a values between populations for the ITS-1 dataset 01-AR 04-ED SO SB EC BB PC PI SL SI ST AR 04-ED 07-SO 10-SB 13-EC 16-BB 19-PC 22-PI 25-SL 28-SI 10

11 Table S4. S nn values for the COI dataset Cb01 Cb04 1 (0***) Cb07 1 (0***) 1 (0***) Cb10 1 (0***) 1 (0***) 1 (0***) Cb13 1 (0***) 1 (0***) 1 (0***) 1 (0***) Cb16 1 (0***) 1 (0***) 1 (0***) 1 (0***) 1 (0***) Cb19 1 (0***) 1 (0***) 1 (0***) 1 (0***) 1 (0***) 1 (0***) Cb22 1 (0***) 1 (0***) 1 (0***) 1 (0***) 1 (0***) 1 (0***) 1 (0***) Cb25 1 (0***) 1 (0***) 1 (0***) 1 (0***) 1 (0***) 1 (0***) 1 (0***) 1 (0***) Cb28 1 (0***) 1 (0***) 1 (0***) 1 (0***) 1 (0***) 1 (0***) 1 (0***) 1 (0***) 0,91667 (0,0002***) Cb31 1 (0,0002***) 1 (0***) 1 (0***) 1 (0,0001***) 1 (0***) 1 (0***) 1 (0***) 1 (0***) 1 (0,0002***) 0,95652 (0***) Cb01 Cb04 Cb07 Cb10 Cb13 Cb16 Cb19 Cb22 Cb25 Cb28 S nn values for the ITS-1 dataset Cb01 Cb04 0,96552 (0***) Cb07 0,94444 (0***) 1 (0***) Cb10 0,94118 (0***) 1 (0***) 1 (0***) Cb13 0,94444 (0***) 1 (0***) 1 (0***) 1 (0,0002***) Cb16 0,96667 (0***) 1 (0***) 1 (0***) 1 (0***) 1 (0***) Cb19 0,94737 (0,0001***) 1 (0***) 1 (0***) 1 (0***) 1 (0***) 1 (0***) Cb22 0,95000 (0***) 1 (0***) 1 (0***) 1 (0***) 1 (0***) 1 (0***) 1 (0***) Cb25 0,90000 (0,0457*) 1 (0,0098**) 1 (0,0160*) 1 (0,0198*) 1 (0,0165*) 1 (0,0038**) 1 (0,0125*) 1 (0,0093**) Cb28 0,94737 (0***) 1 (0***) 1 (0***) 1 (0***) 1 (0,0001***) 1 (0***) 1 (0***) 0,82343 (0***) 1 (0,0123*) Cb31 0,92308 (0,0025**) 1 (0***) 1 (0,0003***) 1 (0,0006***) 1 (0,0004***) 1 (0***) 1 (0,0001***) 1 (0,0001***) 1 (0,0960 ns) 0,93750 (0,0005***) Cb01 Cb04 Cb07 Cb10 Cb13 Cb16 Cb19 Cb22 Cb25 Cb28 *** P<

12 Table S5. N st values for the COI dataset 01-AR 04-ED SO SB EC BB PC PI SL SI ST AR 04-ED 07-SO 10-SB 13-EC 16-BB 19-PC 22-PI 25-SL 28-SI N st values for the ITS-1 dataset 01-AR 04-ED SO SB EC BB PC PI SL SI ST AR 04-ED 07-SO 10-SB 13-EC 16-BB 19-PC 22-PI 25-SL 28-SI 12

13 Table S6. Isolation-by-distance results comparing D XY values and natural logarithms of geographical distances Localites COI ITS-1 Z r P-value (r<= 0) Z r P-value (r<=0) All localities ** ** **P<

14 Table S7. ABC results of the serial founder events models Model MD PP P-value Model x Model x Model x Model x MD, marginal density under the GLM PP, posterior probability P-value, Likelihood of the observed data under the GLM relative to that of the retained simulations (using 5 PLS components) Analysis based on 8 populations 14

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