Seleção de primers RAPD e caracterização molecular de melancia.

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1 Seleção de primers RAPD e caracterização molecular de melancia. Maria Luciene da Silva 1 ; Manoel A. Queiróz 2 ; Lindomar M. da Silveira 3 ; Maria Aldete J. da F. Ferreira 4 ; Gláucia S. C. Buso 4 ; Izaias da Silva Lima Neto 5 ; Gilmara M. Santos 6. 1 UFPE MSc Genética; 2 UNEB - DCTS, Juazeiro - BA; 3 Estagiário-UNEB - DCTS; 4 Embrapa Recursos Genético e Biotecnologia; 5 UNEB-DTCS, Juazeiro-BA; 6 Bolsista DCR/CNPq - Embrapa Semi-Árido. RESUMO A melancia é uma olerícola de importância no agronegócio do Brasil, onde é cultivada principalmente a variedade Crimson Sweet. Contudo, diferentes tipos são encontrados na agricultura tradicional, o que levou à formação do Banco Ativo de Germoplasma de Cucurbitáceas do Nordeste brasileiro. Esse banco apresenta variabilidade genética para ser utilizada em programas de melhoramento. Para tanto, os acessos precisam ser caracterizados, inclusive com marcadores moleculares. Este trabalho teve por objetivo selecionar primers RAPD informativos para caracterização molecular de acessos de melancia. Portanto, oito acessos de melancia, do referido banco, foram caracterizados com marcadores RAPD, utilizando-se 68 primers na Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia. Foram encontrados vinte quatro primers polimórficos, dos quais seis foram utilizados para caracterizar 42 acessos do Banco. A análise de variância molecular revelou 25% de variabilidade entre acessos, 29% dentro de acessos e 46% de variabilidade entre acessos dentro de grupos. O agrupamento pelo método de Tocher mostrou 28 grupos distintos. Palavras-chaves: Citrullus lanatus, germoplasma, marcadores moleculares. ABSTRACT - RAPD primers selection and molecular characterization of watermelon The watermelon is an important vegetable in Brazil, mainly grown as the cultivar Crimson Sweet. However, there are different populations in the traditional agriculture which led to the establishment of the Cucurbit Germplasm Bank for Northeast of Brazil that comprises genetic variability to be used in breeding programs. Therefore, the accessions need to be characterized, preferably, molecularly. This work aimed at selecting useful RAPD primers to be used in molecular characterization of watermelon accessions. Therefore, eight accessions from the Watermelon Bank were characterized using 68 RAPD markers, et the Embrapa Genetic Resources Unit, in Brasilia-DF. Twenty four polymorphic markers were

2 found, out of which six were used to characterize 42 accessions from the Bank. An analysis of molecular variance has shown 25% of genetic variability within accessions, 29% among accessions and 46% among accessions within the regions from where the accessions were collected. Twenty eight groups were formed using the Tocher s method of clustering. Key-words: Citrullus lanatus, germplasm, molecular markers. INTRODUÇÃO No Brasil, o plantio comercial da melancia concentra-se quase que exclusivamente na variedade Crimson Sweet que é suscetível a pragas e doenças, o que acarreta em uso de agrotóxicos e conseqüentemente em problemas ambientais, resíduos em frutos e elevação dos custos de produção. Entretanto, cultivares resistentes podem ser desenvolvidas, como por exemplo, para resistência ao oídio (Sphaerotheca fuliginea), ao cancro das hastes (Didymella bryoniae) (Dias et al., 1999) e às viroses (Silveira, 2004). Mesmo assim, existem outras doenças e pragas, para as quais ainda não foram identificadas fontes de resistência. O uso de técnicas moleculares vem adquirindo significativa importância na caracterização de germoplasmas, fornecendo informações sobre a variabilidade genética ao nível do DNA eliminando possíveis efeitos ambientais (Levi et al., 2000). Os marcadores RAPD podem ser usados para este fim, em virtude do menor custo, maior rapidez na obtenção dos resultados e a possibilidade de se avaliar maior número de acessos. No entanto, primers informativos devem ser previamente identificados. Sendo assim, este trabalho teve como objetivo selecionar primers RAPD para aplicação na caracterização molecular de acessos de germoplasma de melancia. MATERIAL E MÉTODO Os 42 acessos de melancia do Banco Ativo de Germoplasma de Cucurbitáceas do Nordeste Brasileiro, coletados em diferentes regiões da Bahia, foram semeados em bandejas de poliestireno em casa de vegetação na Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, com 20 repetições. Tanto a extração do DNA como as reações de amplificação do RAPD, foram realizadas com base no protocolo estabelecido por Ferreira & Grattapaglia (1998). Oito acessos foram selecionados ao acaso para análise preliminar de sessenta e oito primers RAPD (Operon Technologies), a fim de se identificar os mais polimórficos e reprodutíveis. Os perfis eletroforéticos foram avaliados após fotodocumentação dos géis de agarose 1,5% corados com brometo de etídio. Os primers que apresentaram locos polimórficos e com

3 repetibilidade foram selecionados para serem usados na caracterização molecular dos 42 acessos de melancia. RESULTADOS E DISCUSSÃO Dos 68 primers RAPD testados 44 foram monomórficos, ou seja, não apresentaram variação quanto à presença ou ausência de bandas, de mesmo comprimento em pares de base, entre os indivíduos avaliados (Figura 1). Assim, o polimorfismo dos marcadores RAPD é identificado pela presença ou ausência de um fragmento, sendo a ausência devida ao não pareamento complementar à seqüência de DNA alvo (Ferreira & Grattapaglia, 1998). Contudo, o monomorfismo pode ser questionado com relação à seqüência dos fragmentos amplificados, ou seja, pode ser monomórfico com relação ao comprimento da banda em questão, mas polimórfico com relação à seqüência amplificada. Os primers que apresentaram perfil monomórfico foram: OPF-03, OPF-04, OPF-13, OPY-16, OPY-06, OPY- 18, OPY-19, OPA-02, OPA-08, OPA-13, OPA-20, OPA-14, OPA-15, OPB-06, OPB-10, OPB- 07, OPB-17, OPB-02, OPB-15, OPC-01, OPC-06, OPC-19, OPC-05, OPC-15, OPC-20, OPB-03, OPB-05, OPB-16, OPV-12, OPV-13, OPB-11, OPT-13, OPJ-12, OPD-07, OPE-01, OPD-02, OPO-16, OPOX-19, OPT-18, OPV-20, OPF-06, OPF-09, OPC-02, OPA-10, não sendo, portanto recomendados para trabalhos moleculares em melancia, considerando o conjunto de acessos avaliados nesse experimento. Por outro lado, 24 primers foram polimórficos. O primer OPO-03 (Figura 1), por exemplo, apresentou cinco bandas polimórficas, sendo a primeira identificada pela ausência da banda, observada no acesso 30, e presentes nos demais indivíduos, sendo correspondente ao fragmento do padrão Ladder (1kb) de 1636 pares de base (bp). A segunda banda corresponde ao fragmento de 1632bp, presente em todos os acessos e ausente no acesso 30. A terceira e quarta bandas, da mesma forma, está presente em todos os acessos, mas ausente no acesso 30, com 1016 a 1015bp, respectivamente. A quinta banda (505pb) pode ser visualizada no acesso 30, sendo ausente nos demais indivíduos. As bandas presentes nos acesso 7 e 13 de 720 bp apresentam-se com intensidade duvidosa. Bandas como estas não devem ser consideradas como marcadores polimórficos, visando eliminar problemas de reprodutibilidade. Os primers polimórficos revelaram perfis com duas (OPY-01; OPAX-19; OPV-05; OPAA-19 e OPE-14), três (OPO-09; OPAX-14; OPS-18; OPY-08; OPOX-07 e OPJ-13), quatro (OPS-07; OPY-14; OPO-04; OPO-15; OPJ-16), cinco (OPO-02; OPO-03; OPF-02; OPO-07; OPO-10 e

4 OPO-06), seis (OPB-14) e com sete (OPF-16) bandas polimórficas, com média de 3,7 bandas por primer. Resultados similares foram encontrados por Levi et al. (2000) ao avaliar 140 primers RAPD dos quais 28 produziram marcadores polimórficos. O polimorfismo observado no presente estudo possibilitou a identificação e caracterização dos 42 acessos de melancia avaliados. Os acessos 3 e 5 foram identificados pelo primer OPO e os acessos 4 e 21 pelo primer OPF Os primers OPO-02, OPB-14, OPF- 16, e OPO-09 foram bastante informativos identificando de um a vinte e um acessos cada, variando no loco amplificado. A análise de agrupamento pelo método de Tocher revelou vinte e oito grupos de similaridade, sendo observado em um mesmo grupo acessos de diferentes procedências, o que pode indicar possíveis redundâncias no BAG de melancia. Contudo, a análise de variância molecular revelou variabilidade genética em percentuais de 25% entre acessos, 29% dentro de acessos e 46% entre acessos dentro de grupos. 1KB 1KB OPO-02 OPO-03 OPO pb 1032pb 1016pb 1015pb 505pb Figura 1. Perfil dos primers OPO-02, OPO-03 e OPO-04, nos acessos 01, 07,10 e 13 da Chapada Diamantina-BA, 26 de Irecê-BA, 30 e 32 de Vitória da Conquista-BA e 46 ( Crimson Sweet ). Embrapa, Brasília, LITERATURA CITADA DIAS, R.C.S.; QUEIROZ, M.A. de; MENEZES, M.; BORGES, R.M.E. Avaliação de resistência a Spherotheca fuliginea e a Didymella bryoniae em melancia. Horticultura Brasileira, Brasília, v. 17, suplemento, p.13-19, FERREIRA, M. E.; GRATTAPAGLIA, D. Introdução ao uso de marcadores moleculares em análise genética. 2ª ed., Brasília, Embrapa-CENARGEN, 1998, 220p.

5 LEVI, A.; THOMAS, C. E.; KEINATH, A. P.; WEHNER, T. C. Estimation of genetic diversity among Citrullus accessions using RAPD markers. Acta Horticulturae, 510, p SILVEIRA, L.M. Seleção de acessos e progênies de melancia para resistência a potyvírus f. (Tese mestrado)-esam, Mossoró.

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