UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO REITORIA DE PESQUISA PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA

Transcrição

1 1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO REITORIA DE PESQUISA PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA RELATÓRIO TÉCNICO CIENTÍFICO Período: agosto/2014 a julho/2015 ( ) PARCIAL (X) FINAL IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO PANMIXIA É CARACTERÍSTICA DE POPULAÇÕES DE PEIXES MIGRADORES?: O CASO DO MAPARÁ (Hypophthalmus marginatus, VALENCIENNES, PIMELODIDAE, SILURIFORMES) NA BACIA AMAZÔNICA. Nome do Orientador: SIMONI SANTOS DA SILVA Titulação do orientador: DOUTOR Departamento: FACULDADE DE ENGENHARIA DE PESCA Unidade: INSTITUTO DE ESTUDOS COSTEIROS - CAMPUS DE BRAGANÇA Laboratório: LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA DO PESCADO Título do Plano de Trabalho: FILOGENIA MOLECULAR DE Hypophthalmus DA BACIA AMAZÔNICA Nome do Bolsista: ANNA KAROLINA OLIVEIRA DE QUEIROZ Tipo de Bolsa: ( ) PIBIC/CNPq ( ) PIBIC/CNPq-AF (X) PIBIC/UFPA ( ) PIBIC/UFPA-AF ( ) PIBIC/INTERIOR ( ) PIBIC/FAPESPA ( ) PARD ( ) PARD renovação ( ) PADRC ( ) Bolsistas PIBIC do edital CNPq 001/2007

2 2 INTRODUÇÃO A Amazônia possui uma área geográfica de cerca de km 2, é uma região com elevada biodiversidade sendo que, somente para a ictiofauna, são registradas espécies de peixes, sendo endêmicas (Leveque et al., 2008). Porém, vários autores sugerem que a diversidade íctica desta região é subestimada e que o número de espécies pode variar de até espécies (Isaac & Barthem, 1995; Barthem & Fabré, 2004; Leveque et al., 2008). Neste contexto, a superordem Ostariophysi abriga 85% das espécies conhecidas sendo que a ordem Siluriformes contém 39% desta diversidade, os Characiformes 43%, e os Gymnotiformes 3%. As demais espécies de ocorrência na Amazônia são agrupadas em 14 famílias pertencentes a outras ordens (Lowe-McConnell, 1987). Dentro dos Siluriformes, a família Pimelodidae abriga o gênero Hypophthalmus, conhecido popularmente por mapará, o qual é constituído por quatro espécies válidas amplamente distribuídas na América do Sul: H. oremaculatus Nani & Fuster, 1947; H. marginatus Valenciennes, 1840; H. edentatus Spix & Agassiz, 1829; e H. fimbriatus Kner, 1857, sendo as três últimas de ocorrência ao longo da Bacia Amazônica, incluindo o estado do Pará, enquanto que H. oremaculatus é endêmica da bacia do rio Paraná (López-Fernández & Winemiller, 2000; Ambrósio et al., 2001; Lundberg & Littmann, 2003; Ferraris-Jr., 2007). Os maparás são peixes que apresentam expectativa de vida em torno de cinco anos, sendo espécies r-estrategistas, estritamente pelágicos e planctófagos (Cutrim & Batista, 2005). De acordo com Barthem & Fabré (2004) os maparás são peixes que realizam migrações para fins tróficos e reprodutivos, com tendência de alto fluxo genético entre grupos de diferentes sistemas fluviais, apresentam alta fecundidade e altas taxas de crescimento e mortalidade. Apesar da destacada importância econômica dos bagres na região amazônica e principalmente da sua importância como espécies migradoras e predadoras, o conhecimento e estudos sobre seus aspectos biológicos, ecológicos e genéticos, ainda são incipientes (Batista, 2010). Estudos genéticos realizados revelam que a diversidade do gênero Hypophthalmus é subestimada, pois, além das espécies já descritas para o gênero, é sugerido que existam pelo menos sete espécies ainda não descritas (López-Fernández & Winemiller, 2000; Ribeiro, 2009; Lundberg et al., 2011; Ferreira, 2012). Diante do

3 3 exposto, são necessários estudos sobre filogenia e genética de populações envolvendo estes táxons para que se avalie a real diversidade deste gênero na Amazônia. JUSTIFICATIVA A biodiversidade dentro de Hypophthalmus é subestimada, uma vez que foi proposta a existência de morfotipo H. cf. fimbriatus que é citogeneticamente distinto das três espécies já reconhecidas para a Amazônia (López-Fernández & Winemiller, 2000; Ribeiro, 2009). Lundberg et al. (2011) sugere, embora sem evidências concretas em seu artigo, que deve existir pelo menos três espécies dentro de H. marginatus e três de H. edentatus. Recentemente foram identificados, através do DNA mitocondrial, dois grupos altamente diferenciados dentro de H. marginatus, denominados grupo I e II, que sugerem processo de especiação no táxon (Ferreira, 2012). Recentes análises de DNA nuclear corroboraram a diferenciação dos grupos I e II de H. marginatus, apontando para um evento de especiação. Porém, um grupo de H. marginatus, foi mais proximamente relacionado a um exemplar de H. edentatus obtido do Genbank. Desta forma o presente trabalho visa comparar, com marcadores nucleares, as espécies de Hypophthalmus reconhecidas para a Amazônia (H. marginatus, H. edentatus e H. fimbriatus) e avaliar as relações de parentesco entre estas e os grupos de H. marginatus definidos pelo DNA mitocondrial. OBJETIVOS Objetivo geral Avaliar, com marcadores nucleares, as relações filogenéticas entre as espécies de Hypophthalmus reconhecidas para a Amazônia e os dois grupos de H. marginatus definidos pelo DNA mitocondrial. Objetivos específicos a) Avaliar a relação de parentesco evolutivo entre as espécies do gênero Hypophthalmus de ocorrência na Amazônia; b) Avaliar a divergência genética entre as espécies de Hypophthalmus avaliadas;

4 4 c) Verificar o posicionamento filogenético dos grupos de H. marginatus definidos pelo DNA mitocondrial; MATERIAIS E METÓDOS Amostragem Os indivíduos de H. marginatus utilizados na presente análise foram os mesmos avaliados por Ferreira (2012), onde foram avaliados nove indivíduos do tipo I e oito indivíduos do Tipo II de H. marginatus, os quais foram coletados nos rios Tapajós e Xingú onde os grupos distintos de maparás (H. marginatus) coexistem. Também foram incluídos nas análises espécimes de H. edentatus, onde foram analisadas 10 amostras sendo duas de Santarém, cinco de Prainha e três amostras de Juruti. Da mesma forma, foram analisados sete indivíduos de H. fimbriatus, da localidade de Santarém. Todos os indivíduos foram identificados com auxílio de literatura especializada (López- Fernández & Winemiller, 2000) e o tecido muscular de cada espécime foi conservado em etanol absoluto e/ou congelado até o momento da extração. Procedimentos laboratoriais O DNA total foi obtido por meio de extração com o kit Wizard Genomics DNA purification (Promega), seguindo o protocolo para extração de tecido muscular definido pelo fabricante. A qualidade do DNA foi determinada em transiluminador UV, por meio da visualização do DNA corado com GelRed, após eletroforese em gel de agarose (1%). Um fragmento das regiões RAG-2 (gene ativador da recombinação 2) Myh6 (cadeia pesada alfa da miosina), Glyt (glicosiltransferase) e Plagl2 (gene adenoma pleomórfico 2) do DNA nuclear foi amplificado por meio da reação em cadeia da polimerase (PCR) utilizando os iniciadores e programas de amplificação descritos na Tabela 1. As reações foram realizadas com volume final de 20 µl, contendo os seguintes reagentes para o RAG-2: 3,2 µl de DNTP, 2 µl de tampão de PCR (10x), 0,5 µl de MgCl 2 (50 mm), 1,0 µl de DNA total, 0,8 µl de cada iniciador, 0,2 µl de Taq DNA polimerase (5U/µl) e água purificada para completar o volume final. Para as regiões Myh6, Glyt e Plagl2, utilizou-se 3,2 µl de DNTP, 2 µl de tampão de PCR (10x), 0,8 µl

5 5 de MgCl 2, 2,5 µl de DNA, 0,9 µl de cada iniciador, 0,16 µl de Taq DNA polimerase (5U/µl) e água purificada para completar o volume final. As reações positivas foram purificadas com PEG-8000 seguindo o protocolo de Paithankar & Prasad (1991) e submetidas ao sequenciamento pelo método didesoxiterminal com o Kit BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Applied Biosystems). As eletroforeses foram realizadas no sequenciador ABI 3500 XL (Applied Biosystems). Tabela 1 - Iniciadores e protocolos de amplificação dos marcadores nucleares. Marcador Iniciadores Referência Protocolo de amplificação RAG-2 MHF1: TGYTATCTCCCACCTCTGCGYTACC MHR1: TCATCCTCCTCATCKTCCTCWTTGTA Hardman (2004) Desnaturação inicial a 94 C por 1, 35 ciclos a 94 C por 30 (desnaturação), 60 C por 30 (hibridização) e 72 C por 2, e extensão final a 72 C por 10 Myh6 myh6_f459:catmttytccatctcagataatgc myh6_r1322:ctcaccaccatccagttgaacat Li et al. (2007) Desnaturação inicial a 94 C por 3, 35 ciclos a 94 C por 40 (desnaturação), 60 C por 40 (hibridização) e 72 C por 1, e extensão final a 72 C por 5 Glyt Glyt_F559: GGACTGTCMAAGATGACCACMT Glyt_R1562: CCCAAGAGGTTCTTGTTRAAGAT Li et al. (2007) Desnaturação inicial a 94 C por 3, 35 ciclos a 94 C por 40 (desnaturação), 52 C por 40 (hibridização) e 72 C por 1, e extensão final a 72 C por 5 Plagl2 plagl2_f9: CCACACACTCYCCACAGAA plagl2_r930:ttctcaagcaggtatgaggtaga Li et al. (2007) Desnaturação inicial a 94 C por 3, 35 ciclos a 94 C por 40 (desnaturação), 60 C por 40 (hibridização) e 72 C por 1, e extensão final a 72 C por 5

6 6 Análises genéticas As sequências foram editadas e alinhadas no Bioedit versão (Hall, 1999), e os bancos de dados foram testados para saturação das transições e transversões em relação à distância genética no programa DAMBE (Xia & Xie, 2001). Foi realizada a análise de Máxima Verossimilhança (ML) no PhyML 3.0 utilizando o modelo evolutivo TVM+I selecionado pelo programa jmodeltest (Posada, 2008). Para a construção da árvore usando inferência Bayesiana, utilizou-se o portal CIPRES (Miller et al., 2010). As médias de divergência genética, dentro e entre as linhagens, foram estimadas no programa MEGA6 (Tamura et al., 2013). RESULTADOS E DISCUSSÃO Foram obtidos 3354 pares de bases (pb) de 34 indivíduos, dos quais 905 pb foram obtidos para o marcador RAG-2, 765 pb para o Myh6, 871 pb para o Glyt e 813 pb para o Plagl2. Destes, 17 pertencem a H. marginatus, sete a H. fimbriatus e 10 a H. edentatus. Também foram inseridas no banco sequências disponíveis no Genbank de H. edentatus (DQ492362) e H. cf. marginatus (JF898730). Quando o banco de dados foi submetido ao teste de saturação, não foi observada saturação das taxas de transição e transversão com relação à divergência genética (dados não mostrados). Tanto a árvore de máxima verossimilhança quanto a árvore Bayesiana, construídas a partir dos dados concatenados dos quatro marcadores, geraram topologias concordantes evidenciando a presença de dois grupos de H. marginatus apoiados por elevados valores de bootstrap (Figuras 1 e 2). Estes são concordantes com a classificação dos tipos I e II definidos por Ferreira (2012), apoiando a proposição do autor, com base em sequências do DNA mitocondrial, de que há especiação críptica em H. marginatus, uma vez que estes indivíduos não são distinguidos por caracteres morfológicos usualmente utilizados para a identificação da espécie. Quanto à relação de parentesco entre todos os táxons incluídos nas análises, a topologia das árvores filogenéticas apoia a estreita relação entre H. edentatus e o clado

7 7 composto pelos Tipos I e II de H. marginatus, enquanto H. fimbriatus se mostra mais basal, formando um clado irmão de H. edentatus/h. marginatus (Figuras 1 e 2). Estes resultados corroboram com aqueles observados nos estudos de Lundberg (2011), onde H. edentatus também é grupo irmão de H. marginatus e H. fimbriatus se encontra como o grupo mais basal. Um resultado que merece atenção é o posicionamento de um espécime de H. edentatus, dentro do clado com indivíduos do tipo II de H. marginatus (Figuras 1 e 2). Uma vez que os exemplares de H. edentatus identificados para o presente trabalho se comportam como táxon válido e distinto de H. marginatus, sugerimos que esta amostra de H. edentatus do Genbank pertence à H. marginatus e foi identificada erroneamente por Lundberg et al. (2011). Erros de identificação de espécimes submetidos ao Genbank são comuns e já foram registrados em outros trabalhos (Barbuto et al., 2010; Brito et al., 2015). Figura 1. Árvore de máxima verossimilhança gerada com sequências dos marcadores RAG-2, Myh6, Glyt e Plagl2 das espécies H. marginatus, H. edentatus e H. fimbriatus. Os espécimes H. cf. marginatus (JF898730) e H. edentatus (DQ492362) foram retirados do Genbank. Valores acima dos ramos equivalem ao suporte estatístico obtido para 1000 pseudoréplicas de bootstrap. A espécie Brachyplatystoma filamentosum (JF898747) foi utilizada como grupo externo.

8 8 Figura 2. Árvore Bayesiana gerada com sequências dos marcadores RAG-2, Myh6, Glyt e Plagl2 das espécies H. marginatus, H. edentatus e H. fimbriatus. Os espécimes H. cf. marginatus (JF898730) e H. edentatus (DQ492362) foram retirados do Genbank. Valores acima dos ramos equivalem ao suporte estatístico obtido para 1000 pseudoréplicas de bootstrap. A espécie Brachyplatystoma filamentosum (JF898747) foi utilizada como grupo externo. Quanto às médias de divergência genética, a distância p dentro dos grupos foi menor que 0,5%, exceto para H. edentatus no RAG-2, apresentando baixa diferença com os quatro marcadores (Tabela 2). As divergências entre H. marginatus dos tipos I e II variaram de 0,3% a 0,6%, onde o maior valor foi observado para o marcador Myh6. Os resultados de divergência entre os tipos I e II de H. marginatus e as espécies H. fimbriatus e H. edentatus variaram de 0,4% a 1,6% (Tabela 2) confirmando a separação das linhagens de H. marginatus. Os resultados das análises filogenéticas e de divergência genética evidenciam a existência de diferenciação entre as linhagens de H. marginatus, corroborando a hipótese proposta por Ferreira (2012) de que esta espécie é formada por pelo menos duas espécies crípticas.

9 9 Tabela 2. Média da divergência genética não corrigida p (%) dentro e entre os grupos. Dentro dos grupos Marcador RAG-2 myh6 Glyt plagl2 H. fimbriatus 0 0 0,2 0 H. edentatus 0,6 0,3 0,2 0,2 H. marginatus Tipo I 0 0,1 0,1 0 H. marginatus Tipo II 0, ,1 Entre os grupos Marcador RAG-2 myh6 Glyt plagl2 H. ma Tipo I X H. ma Tipo II 0,3 0,6 0,3 0,4 H. ma Tipo I X H. edentatus 1,3 0,7 0,8 0,7 H. ma Tipo I X H. fimbriatus 0,6 0,7 0,8 0,5 H. ma Tipo II X H. edentatus 1,6 0,6 0,7 0,6 H. ma Tipo II X H. fimbriatus 0,9 0,7 0,5 0,4 H. fimbriatus X H. edentatus 0,9 0,8 1,1 0,2 CONCLUSÕES H. marginatus contém pelo menos duas espécies crípticas. H. edentatus é grupo irmão de H. marginatus enquanto que H. fimbriatus é o grupo mais basal. Há necessidade de revisão taxonômica do gênero Hypophthalmus.

10 10 REFERÊNCIAS Ambrósio, A. M.; Agostinho, A. A.; Gomes, L. C.; Okada, E. K. (2001). The fishery and fishery yeld of Hypophthalmus edentatus (Spix, 1829), (Siluriformes, Hypophthalmidae), in the Itaipu reservoir, Paraná state, Brazil. Acta Limnol. Bras. 13(1): Barbuto, M.; Galimberti, A.; Ferri, E.; Labra, M.; Malandra, R.; Galli, P.; Casiraghi, M. (2010). DNA barcoding reveals fraudulent substitutions in shark seafood products: the Italian case of palombo (Mustelus spp.). Food Research International, 43, Barthem, R. B.; Fabré, N. N. (2004). Biologia e diversidade dos recursos pesqueiros da Amazônia. In: RUFFINO, M. L. (ed.) A pesca e os recursos pesqueiros na Amazônia brasileira. Manaus: IBAMA, PROVÁRZEA, p Batista, J. S. (2010). Caracterizacao genetica da dourada - Brachyplatystoma rousseauxii, Castelnau, 1855 (Siluriformes-Pimelodidae) na Amazonia por meio de marcadores moleculares mitocondriais e microssatelites: subsidios para conservacao e manejo/ Jacqueline da Silva Batista. Manaus: [s.n.], 2010.Tese de dotorado. INPA. Manaus. Brito, A. M.; Schneider, H.; Sampaio, I.; Santos, S. (2015). DNA barcoding revels high substitution rate and mislabeling in croaker fillets (Sciaenidae) marketed in Brazil: the case of pescada branca (Cynoscion leiarchus and Plagioscion squamosissimus). Food Research International. 70: Cutrim, L; Batista, V. S. (2005). Determinação de idade e crescimento do mapará (Hypophthalmus marginatus) na Amazônia Central. Acta amazonica. 35 (1): Ferraris-Jr., C. J. (2007). Checklist of catfishes, recent and fossil (Osteichthyes: Siluriformes), and catalogue of siluriform primary types. Zootaxa 1418: Ferreira, E. S. (2012). Variabilidade genética, estrutura populacional e filogeografia do mapará (Hypophthalmus marginatus Valenciennes, Pimelodidae, Siluriformes) no Estado do Pará, utilizando sequências de DNA mitocondrial. Dissertação de mestrado. UFOPA. Santarém: 65 p.

11 11 Hall, T. A. (1999).BioEdit: a user friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series 41: Hardman, M. (2004). The phylogenetic relationships among Noturus catfishes (Siluriformes: Ictaluridae) as inferred from mitochondrial gene cytochrome band nuclear recombination activating gene 2. Mol. Phylogenet. Evol. 30: Isaac, V. J.; Barthem, R. B. (1995). Os recursos pesqueiros da Amazônia brasileira.bol. Mus. Par. Emílio Goeldi, série antropologia. 11(2): Leveque, C.; Oberdorff, T.; Paugy, D.; Stiassny, M. L. J.; Tedesco, P. A. (2008). Global diversity of fish (Pisces) in freshwater. Hydrobiologia, Li, C.; Ortí, G.; Zhang, G.; Lu, G. (2007). A practical approach to phylogenomics: the phylogeny of ray-finned fish (Actinopterygii) as a case study. BMC Evolutionary Biology, 7(1): 44. López-Fernández, H.; Winemiller, K. O. (2000). A review of Venezuelan species of Hypophthalmus (Siluriformes: Pimelodidae). Ichthyological Exploration of Freshwaters, 11: Lowe-McConnell, R. H. (1987). Ecological studies in tropical fish communities. Cambridge: University Press, 382 p. Lundberg, J. G.; Littmann, M. W. (2003). Pimelodidae. In: REIS, R. E.; KULLANDER, S. O. & FERRARIS-JR, C. J. (Eds.), Check list of the Freshwater Fishes of South and Central America. Porto Alegre. Edipucrs. p Lundberg, J. G.; J.P. Sullivan; Hardman, M. (2011). Phylogenetics of the South American Catfish Family Pimelodidae (Teleostei: Siluriformes) using Nuclear and Mitochondrial Gene Sequences. Proceedings of the Academy of Natural Sciences of Philadelphia 161: Miller, M.; Pfeiffer, W.; Schwartz, T. (2010). Creating the CIPRES science gateway for inference of large phylogenetic trees. In Gateway Computing Environments Workshop (GCE), IEEE, 1-8. Posada, D. (2008). jmodeltest v0.1.1: Phylogenetic Model Averaging. Mol. Biol. Evol.

12 12 25: Ribeiro, L. B. (2009). Análise citogenética das espécies do gênero Hypophthalmus (Siluriformes, Pimelodidae) da região do Lago Catalão, Amazonas, Brasil. Dissertação de mestrado. Manaus: GCBEV/INPA. 72 p. Tamura, K.; Peterson, D.; Peterson, N.; Stecher, G.; Nei, M.; Kumar, S. (2013). MEGA6: Molecular Evotutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods. Xia, X.; Xie, Z. (2001). DAMBE: data analysis in molecular biology and evolution. Journal of Heredity, 92: DIFICULDADES Devido às dificuldades em amplificar o marcador S7, previamente proposto no plano, foi necessário utilizar os marcadores aqui descritos. PARECER DO ORIENTADOR: Manifestação do orientador sobre o desenvolvimento das atividades do aluno e justificativa do pedido de renovação, se for o caso. A aluna Anna Karolina Oliveira de Queiroz é aplicada em suas atividades e desenvolveu todas as etapas do seu trabalho de forma independente. Além das habilidades na prática laboratorial demonstra interesse pelo assunto tema do projeto e tem iniciativa própria na busca de novas informações que venham a aumentar seu conhecimento teórico sobre o tema. DATA: 10/08/2015 ASSINATURA DO ORIENTADOR