DETECÇÃO DE DIVERSIDADE GENÉTICA EM POPULAÇÃO DE Euterpe edulis Mart. USANDO MARCADORES SSR

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1 DETECÇÃO DE DIVERSIDADE GENÉTICA EM POPULAÇÃO DE Euterpe edulis Mart. USANDO MARCADORES SSR DETECTION OF GENETIC DIVERSITY IN POPULATION OF Euterpe edulis Mart. USING SSR MARKERS Aléxia Gonçalves Pereira (1) Luara Lopes Sousa (1) Luziane Brandão Alves (1) José Henrique Soller Guilhen (2) Guilherme Bravim Canal (3) Marcia Flores da Silva Ferreira (4) Adésio Ferreira (4) Resumo Euterpe edulis é uma espécie da Floresta Atlântica conhecida como palmeira Juçara. É uma planta chave para o ecossistema por contribuir na sobrevivência de várias espécies de aves e roedores que se alimentam de seus frutos, além de se destacar na culinária pelo palmito que produz. A ocorrência do processo de extração ilegal resultou na redução e fragmentação de suas populações naturais. Utiliza-se os marcadores microssatélites para as análises de diversidade genética, visando a compreensão da influência dos processos evolutivos e antropológicos na dinâmica das populações. Nesse contexto, utilizou-se 6 marcadores SSRs para estimar a diversidade genética de 79 indivíduos de Euterpe edulis proveniente de uma população da RPPN Estação Veracel em Porto Seguro, Bahia. Os marcadores selecionados foram considerados informativos (PIC=0,5889) para análises genéticas. A população analisada não se encontra no equilíbrio de Hard-Weinberg (HO= 0,3706 e HE= 0,6229), o FIS médio foi considerado baixo (0,0386) e a riqueza alélica obtida foi de 5,0. Dessa forma, a população estudada ainda mantém diversidade genética e baixa endogamia. São necessários estudos com as plântulas do local para detectar o comportamento dos alelos e a diversidade genética ao longo das gerações. Palavras-chave: Floresta Atlântica. Palmito Juçara. PCR. SSR. Abstract Euterpe edulis is a species of the Atlantic Forest known as the palm heart. It is an essential plant that contributes to the survival of several species of birds and rodents in this ecosystem that feed on its fruits, besides being distinguished in the cuisine by the palm heart that produces. The occurrence of the illegal extraction process resulted in the reduction and fragmentation of its natural populations. Microsatellite markers are used for analyzes of genetic diversity, aiming at understanding the influence of evolutionary and anthropological processes on population dynamics. In this context, 6 SSR markers were used to estimate the genetic diversity of 79 Euterpe edulis individuals from a population of the RPPN Estação Veracel in Porto Seguro, Bahia. The selected markers were considered informative (PIC = ) for genetic analysis. The analyzed population was not found in the Hard-Weinberg equilibrium (HO = and HE = ), the mean FIS was considered low (0.0386) and the allelic richness obtained was 5.0. Therefore, the studied population still maintains genetic diversity and low endogamy. Hence, studies are needed with local seedlings to detect allele behavior and genetic diversity over generations. Keywords: Atlantic Forest. Palmito Juçara. PCR. SSR. 1.Mestranda em Genética e Melhoramento pela UFES/CCAE. alexiagp@gmail.com. 2. Doutorando em Genética e Melhoramento pela UFES/CCAE. 3. Mestrando em Produção Vegetal pela UFES/CCAE. 4. Professora Doutora em Genética e Melhoramento. Departamento de Agronomia, UFES/CCAE. 5. Professor Doutor em Genética e Melhoramento. Departamento de Agronomia, UFES/CCAE

2 1 Introdução Euterpe edulis Mart. é uma palmeira popularmente conhecida como palmito Juçara. A sua extensão vai desde o Rio Grande do Sul até o sul da Bahia, estando continuamente distribuída na Floresta Atlântica, além de registrada em parte do Cerrado (MARTINELLI, GUSTAVO; MORAES, 2013). Junto as bainhas das folhas no ápice do caule, encontra-se a parte meristemal comestível da planta, o palmito. Cada indivíduo pode produzir entre um a três cachos de frutos por ano, contribuindo com a sobrevivência de inúmeras espécies de aves e roedores que se alimentam de seus frutos (CARVALHO et al., 2016; RODRIGUES et al., 2017). Além da importância ecológica, E. edulis tem elevado valor econômico. O palmito extraído dessa palmeira é muito apreciado na culinária, e foi intensamente explorado para comercialização (SCHULZ et al., 2016). A extração ocorre unicamente com a derrubada dos indivíduos (MARTINELLI; MORAES, 2013). Por apresentar estipe único, é incapaz de rebrotar, fato que explica a perda da planta após o corte (BOURSCHEID, 2011). A exploração além de contribuir para a degradação do meio ambiente, tornou-se um fator preocupante para a preservação da espécie, pois na maioria dos casos ocorre a derrubada ilegal da grande maioria dos indivíduos adultos de uma área. Considerando-se que E. edulis é uma planta que necessita de um longo período (mais de 10 anos) para atingir a maturidade reprodutiva (LEITMAN et al., 2013), a ausência de adultos pode comprometer a capacidade de recuperação da população. Para se determinar quais as populações prioritárias para conservação, é necessária uma gama de informações a respeito da espécie, incluindo conhecimentos ecológicos e genéticos. Os marcadores microssatélites são sequências de repetição simples muito abundantes no genoma de procariotos e eucariotos. Esses marcadores possibilitam a constatação da diversidade genética e se destacam por serem hipervariáveis, multialélicos e com padrão codominante (FALEIRO, 2007, MÜLLER; MARCONDES; NAVARRO-SILVA, 2010). Por esses motivos, objetiva-se utilizar os marcadores SSRs para estimar a diversidade genética de 79 indivíduos de Euterpe edulis provenientes da RPPN Estação Veracel em Porto Seguro, Bahia. 2 Materiais e Métodos Foram coletadas lascas de estipe de indivíduos adultos de Euterpe edulis nativas da RPPN Estação de Veracel localizada nos municípios de Porto Seguro e Santa Cruz Cabrália, BA, sendo inserida no Corredor Central da Mata Atlântica (RPPN ESTAÇÃO VERACEL; 2016). As coletas foram realizadas nos blocos 1, 2 e 17 que demarcados pela empresa. Obteve-se as amostras o auxílio

3 de martelo e facão. No total, 79 amostras foram coletas e liofilizadas no laboratório de Genética e Melhoramento da Universidade Federal do Espírito Santo, localizado no município de Alegre. O material foi raspado para a obtenção de um pó fino e submetido a maceração mecânica em MagNA Lyser (Roche). O DNA total foi obtido através do protocolo CTAB descrito por Doyle & Doyle (1990) com modificações. Seis marcadores SSR desenvolvidos para Euterpe edulis publicados por Gaiotto (2001) foram utilizados no estudo. As reações em PCR para os primers EE9, EE23 e EE41 realizou-se com volume final de 20 L contendo 1X de tampão (PCR buffer), 40ng de DNA, 0,25 M de dntp, 1,5 M de MgCL2, 0,3 M de cada primer (F e R), 2,5 BSA e 1U de Taq polimerase. Os primers EE45, EE48 e EE52 foram amplificados em reações similares a anterior, com exceção da concentração de primer, utilizado 0,15 M para cada (F e R) e ausência de BSA. As reações foram conduzidas utilizando 94ºC por 4 minutos, 30 ciclos de 94ºC por 1:30 minutos, T C de anelamento por 1 minuto, 72º C por 1 minuto, e fase de extensão a 72º C por 7 minutos. Os fragmentos foram separados por eletroforese em gel de poliacrilamida 10% utilizando tampão TBE a 90 Volts por aproximadamente três horas e corados em solução de brometo de etídio 0,02 μl.ml-1. Para a condução das análises estatísticas, gerou-se uma matriz de valores numéricos codificados para cada loco. Utilizando o Programa GENES (CRUZ, 2013) obteve-se a heterozigosidade esperada (H E), heterozigosidade observada (H O), o conteúdo de informação dos polimorfismos (PIC), a riqueza alélica e o índice de fixação (FIS) por loco, A riqueza alélica (R A) foi obtida no programa R versão (R CORE TEAM ;2017) pelo pacote Hierfast. 3 Resultados e Discussão A diversidade genética dos 79 indivíduos adultos de E. edulis, provenientes da RPPN Estação de Veracel, com base nos seis 6 marcadores SSR foi avaliada. Os resultados para os fragmentos obtidos e o número de alelos são demonstrados na tabela 1. Tabela 1: Marcadores microssatélites selecionados para as análises de diversidade genética em Euterpe edulis Loci *Tamanho dos fragmentos Tamanho dos fragmentos N.A *TA TA EE º C 58 º C EE º C 58 º C EE º C 58 º C EE º C 56 º C EE º C 56 º C EE º C 56 º C * Tamanho de fragmentos - encontrados por Gaiotto (2001), A número de alelos encontrados para este trabalho, TA temperatura de anelamento utilizado neste trabalho, *TA temperatura de anelamento

4 descrito por Gaiotto (2001). O PIC avalia a informatividade dos marcadores microssatélites em análise de diversidade genética. A média apresentada para a população foi acima de 0,5 (Tabela 2), caracterizando aos marcadores serem informativos (BOTSTEIN, 1980; MCMANUS et al., 2011), sendo indicados para a realização das análises de diversidade genética. TABELA 2 - Parâmetros genéticos dos marcadores microssatélites de Euterpe edulis na população da RPPN Estação de Veracel, Bahia Loci PIC Ho HE RA FIS EE09 0,6508 0,08 0,7032 4,9599 0,8333 EE23 0,7154 0,5769 0,7525 5,9992-0,235 EE41 0,7499 0,8182 0,7827 5,9980-0,9292 EE45 0,6324 0,4082 0,6851 5,0000 0,1712 EE48 0,0159 0,0161 0,0160 1,7903-0,0081 EE52 0,7693 0,3239 0,7976 5,9999 0,2518 Média 0,5889 0,3706 0,6229 5,0 0,0386 *Ho=Heterozigosidade observada, HE= Heterozigosidade Esperada no Equilíbrio de Hardy-Weinberg, FIS= Coeficiente de Endogamia, PIC= Conteúdo Médio de Informação Polimórfica. O Equilíbrio de Hardy-Weinberg prevê que uma população está em equilíbrio quando o valor da HE coincide com a frequência de HO. A população estudada não pode ser considerada em equilíbrio, pois os valores de HO foram inferiores a HE, indicando um excesso de homozigotos na população. O mesmo resultado foi encontrado por Carvalho (2015), Conte (2008) e Novello et al. (2017). Mecanismos evolutivos podem estar atuando na população resultando em alterações das frequências genotípicas, como a deriva genética alterando as frequências de forma aleatória e rápida quando em populações pequenas, promovendo a perda de diversidade genética ao longo do tempo (TEMPLETON, 2011). A riqueza alélica da população obtida mediante o número de alelos e a sua distribuição nos indivíduos foi 5. Novello et al. (2017) detectou em seus estudos a riqueza alélica média de 7,57 para adultos de E. edulis. Esse valor pode ter influência da amostragem (172 indivíduos) e pelo maior número de loci analisados. O valor de FIS médio para a população foi de 0,0386, o qual demonstra que há fixação de alelos e presença de homozigotos em excesso. Estudos com a espécie detectaram FIS médio de 0,12 (GAIOTTO; 2003), 0,1 0,3 (NOVELLO et al; 2017) e 0,46 (CARVALHO ; 2015), sendo mais elevados que o detectado nesse estudo.

5 4 Conclusão A população de adultos de Euterpe edulis da RPPN Estação Veracel localizada na Bahia ainda mantêm a diversidade genética, mas foi detectada endogamia dentre os indivíduos analisados. Devido ao histórico de exploração e fragmentação das populações são necessários estudos com os juvenis do local para detectar o comportamento dos alelos e a diversidade genética da população ao longo do tempo. Referências BOURSCHEID, K. et al. Euterpe edulis -Palmito juçara. Espécies nativas da flora brasileira de valor econômico atual ou potencial: plantas para o futuro - Região Sul. Brasília: Ministério do Meio Ambiente. p CARVALHO, C. S. et al. Defaunation leads to microevolutionary changes in a tropical palm. Scientific Reports, v. 6, p. 1 9, CARVALHO, M.S. Diversidade e Estrutura Genética de Euterpe edulis Mart. Alegre. Dissertação (Mestrado) - Curso de Programa de Pós-graduação em Genética e Melhoramento, Universidade Federal do Espírito Santo, P.58. CONTE, R. et al. Genetic Structure and Mating System of Euterpe edulis Mart. Populations: A Comparative Analysis Using Microsatellite and Allozyme Markers. Journal of Heredity, [s.l.], v. 99, n. 5, p , CRUZ, C.D. GENES - A Software Package for Analysis In Experimental Statistics And Quantitative Genetics. Acta Scientiarum. v.35, n.3, p , DOYLE, J.J.; DOYLE, J.L. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus, v.12, p.13-15, FALEIRO, F.G. Marcadores genético-moleculares aplicados a programas de conservação e uso de recursos genéticos. Planaltina: Embrapa-Cerrados, GAIOTTO, F. A. Genetic Structure, Mating System, and Long-Distance Gene Flow in Heart of Palm (Euterpe edulis Mart.). Journal of Heredity, [s.l.], v. 94, n. 5, p , GAIOTTO, F. A.; BRONDANI, R. P. V.; GRATTAPAGLIA, D. Microsatellite markers for heart of palm Euterpe edulis and E. oleracea Mart.(Arecaceae). Molecular Ecology Resources, v. 1, n. 1 2, p , MARTINELLI, G; MORAES, M. A. Livro vermelho da flora do Brasil. Rio de Janeiro: Instituto de Pesquisas Jardim Botânico do Rio de Janeiro, 1110 p MCMANUS, Concepta et al. Estatísticas para descrever Genética de Populações. Brasília: Inct: Informação Genético-sanitária da Pecuária Brasileira, p. Disponível em: < Acesso em: 21 jun NOVELLO, M., et al. Genetic conservation of a threatened Neotropical palm through communitymanagement of fruits in agroforests and second-growth forests. Forest Ecol. Manage. (2017). R CORE TEAM. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria URL

6 RODRIGUES, A. et al. Frugivoria e Dispersão de Sementes de Euterpe edulis Mart. (Arecacea) por Mamíferos e Aves Silvestres na Mata Atlântica do Sul do Brasil. Revista Brasileira de Zoociências, v. 18, n. 3, p , RPPN ESTAÇÃO VERACEL. Plano de Manejo. Eunápolis: Veracel Celulose, Gerência de Sustentabilidade, e Conservação Internacional SCHULZ, M. et al. Juçara fruit (Euterpe edulis Mart.): Sustainable exploitation of a source of bioactive compounds. Food Research International, v. 89, p , 2016.