CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE POPULAÇÕES NATURAIS DE Annona crassiflora Mart. UTILIZANDO MARCADORES MICROSSATÉLITES

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1 CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE POPULAÇÕES NATURAIS DE Annona crassiflora Mart. UTILIZANDO MARCADORES MICROSSATÉLITES Marlei de Fátima Pereira 1, Ludmila Ferreira Bandeira 2, Angel José Vieira Blanco 2, Alexandre Siqueira Guedes Coelho 2, Ana Yamaguishi Ciampi 3 ( 1 Programa de Pós-Graduação da Escola de Agronomia da Universidade Federal de Goiás, Campus Samambaia, Caixa Postal 131, , Goiânia, GO. marleipereira@yahoo.com.br 2 Universidade Federal de Goiás, Instituto de Ciências Biológicas, Depto. de Biologia Geral, Campus Samambaia, , Goiânia, GO. 3 Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, PqEB W5 Norte, Caixa Postal 02372, , Brasília, DF) Termos para indexação: frutíferas nativas, diversidade genética, conservação genética, marcadores microssatélites. Introdução Dentre as espécies frutíferas que ocorrem no Cerrado e que apresentam um elevado potencial agronômico, destaca-se Annona crassiflora Mart. (Annonaceae), uma frutífera nativa que produz frutos muito apreciados pelas populações regionais, conhecida popularmente como araticum-do-cerrado, marolo, cabeça de negro, pinha-do-cerrado, araticum-panã, e araticum-de-bóia (Ribeiro et al., 2000). O araticunzeiro ocorre naturalmente no Cerrado do Planalto Central brasileiro em altitudes que variam de 800 a m, principalmente nos Estados do Distrito Federal, Bahia, Goiás, Maranhão, Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Minas Gerais, Pará, Piauí e Tocantins. Os frutos são de tamanho e peso variados, entre 1 kg e 2 kg, muito utilizados para consumo in natura e na industrialização de sorvetes, picolés, polpas, compotas, licores e outros. Como todas as outras espécies frutíferas do Cerrado que não são domesticadas, o araticum apresenta um período de frutificação muito curto, impossibilitando a sua comercialização em larga escala. Nesse contexto, estudos que permitam um melhor conhecimento da biologia da espécie, bem como viabilizem o estabelecimento de estratégias eficazes de sua conservação genética, são importantes para garantir sua utilização futura. No que se refere à estudos genéticos de populações naturais, os marcadores moleculares representam uma ferramenta eficiente na quantificação da diversidade genética.

2 Dentre os diversos marcadores moleculares, os microssatélites destacam-se nos estudos de caracterização da estrutura genética de populações naturais, por apresentam o maior conteúdo informativo por loco gênico entre todas as classes de marcadores moleculares atualmente utilizadas (Goldstein & Schlotterer 2001). Nos últimos anos, vários estudos vêm sendo realizados com o uso desta técnica em estudos de espécies nativas de Cerrado (Collevatti et al., 2001; Zucchi et al., 2003; Aguiar, 2004). O objetivo deste trabalho foi estudar e quantificar a estrutura genética de treze populações naturais de Annona crassiflora ocorrentes no Estado de Goiás, contribuindo assim para o programa de conservação e domesticação de espécies frutíferas do Cerrado que vem sendo desenvolvido pela Escola de Agronomia e Engenharia de Alimentos da UFG. Material e Métodos O material vegetal utilizado nesse trabalho foi coletado em 13 populações naturais de A. crassiflora distribuídas no Estado de Goiás (Tabela 1Tabela). Foram amostrados 32 indivíduos de cada população. O material de coleta constituiu-se de folhas jovens que foram acondicionadas em gelo e posteriormente estocadas em freezer à temperatura de 20 C, até o momento de extração de DNA para análise. O protocolo de extração foi adaptado a partir do protocolo descrito por Ferreira & Grattapaglia (1998). O DNA extraído de cada planta foi diluído à concentração de 2,5 ng/µl e mantido como solução de trabalho em freezer (-20 C) para as reações de PCR utilizando primers SSR.

3 Tabela 1. Localização das populações de A. crassiflora coletadas em áreas de Cerrado do Estado de Goiás. população localidade latitude (S) longitude (W) altitude (m) 1 Caraíba 16º º Lagoa 16º º Rio Verde 17º º Serranópolis 17º º Chapadão do Céu 18º º Itarumã 18º º Aragoiânia 16º º Vila Propício 15º º Água Fria 14º º Alto Paraíso 14º º Campos Belos 12º º Posse 14º º Cabeceira 15º º Os primers utilizados nesse estudo foram obtidos de uma biblioteca genômica enriquecida, construída para A. Crassiflora (Tabela 2). Tabela 2. Caracterização geral dos primers utilizados para amplificação dos 10 locos microssatélites de Annona crassiflora Mart. loco seqüência dos primers (forward e faixa de fluorocromo motivo reverse ) (5' 3') tamanho (pb) Ta (o C) 1 Acr_01 CGGCCTTCAAAAGGGAGATA CATGATTCTTCTGCTTCTGTGG 6FAM (azul) (AG) Acr_10 TGACGAAAACGAGAAAAGCA ATGTCCCCAACCCAATACAT 6FAM (azul) (AG) Acr_19 GAGAGCTGGGAGAAGAGCAA AAAGCTGGGAGAGACGACAC HEX (verde) (AG) Acr_20 AGAGCCAGAGCCAGTGAGAC TTGCCTCCATCTCTCAATCC 6FAM (azul) (AG) Acr_22 CTGACTCGCTGGCTCTCTCT CTACAGCCCACATGTGCAAC 6FAM (azul) (AG) Acr_26 CACGACCAAGGAGAGAGGAG GGCAACAATCCTGACTCACA HEX (verde) (AG) Acr_33 CAAACAGGCGATGAGACAGA TGGTTGGCTTTTCTCTTTCAA HEX (verde) (AG) Acr_34 GGAACAGAAGCTGTGGCATT CGCGCAATTCCACAATAAC NED (amarelo) (AG) Acr_37 GGCAACTTCTCCCCTTTACC CCGGTGCCTGCTGTATATG HEX (verde) (AG) Acr_44 CAATTGCAATGGGTAGAGAGAG CATCACCGCACAAAGAGAA NED (amarelo) (AG) A partir das amostras de DNA, foram feitas as reações de amplificação em termociclador modelo PTC-100 (MJ Research). Cada reação consistiu de 13 µl contendo: 4,5

4 ng de DNA, 0,25 µm de cada primer (forward e reverse), 0,25 mm de cada um dos dntps, tampão (1 mm Tris-HCl, ph 8,3; 5 mm KCl), 1,5 mm MgCl 2, 0,25mg/mL BSA (Bovine Serum Albumin), 1 U Taq DNA polimerase e água ultrapura. Os ciclos de temperatura foram estabelecidos da seguinte forma: 94 C por cinco minutos, trinta ciclos de 94 C por um minuto, temperatura específica de anelamento por um minuto (Tabela 2), 72 C por um minuto e extensão final a 72 C por sete minutos. As amostras submetidas à análise no analisador de fragmentos ABI-3100, consistiram de um volume final de 10 µl contendo: 2µL do produto da reação de amplificação, 0,5 µl de ROX, e 7,5 µl de formamida Hi-Di. Essa mistura foi submetida à desnaturação por cinco minutos a 95 C, seguida de resfriamento imediato a 0 C e submetida à análise pelo equipamento ABI A análise de estrutura genética populacional foi realizada pela obtenção de estatísticas análogas às estatísticas-f de Wright, conforme descrito em Weir (1996). Os parâmetros f, θ e F, bem como as estatísticas descritivas dos locos e populações foram estimados utilizando-se o programa GDA (Lewis & Zaykin, 2000). O dendrograma (UPGMA) foi gerado com o auxílio do programa NTSYS (Rohlf, 1989). Resultados e Discussão Os valores estimados para a heterozigosidade média esperada sob condições de equilíbrio de Hardy-Weinberg (H e =0,866) e heterozigosidade observada (H o =0,728) foram altos, indicando a presença de um alto nível de variabilidade genética nas populações naturais de araticum avaliadas (Tabela 3). O número de alelos foi alto, com uma média de dezessete alelos por loco.

5 Tabela 3. Estimativas de índices de diversidade genética para cada uma das 13 populações naturais de Annona crassiflora avaliadas. n: número de indivíduos; A: número de alelos por loco; H e : heterozigosidade esperada sob equilíbrio de Hardy-Weinberg; H o : heterozigosidade observada. população n A H e H o f pop ,90 0,884 0,836 0,055 pop ,70 0,831 0,795 0,044 pop ,30 0,907 0,806 0,113 pop ,00 0,913 0,754 0,176 pop ,00 0,904 0,780 0,140 pop ,00 0,901 0,775 0,142 pop ,11 0,889 0,671 0,249 pop ,00 0,895 0,698 0,223 pop ,33 0,860 0,743 0,137 pop ,11 0,829 0,639 0,232 pop ,88 0,779 0,533 0,319 pop ,55 0,835 0,722 0,137 pop ,88 0,833 0,718 0,140 média ,866 0,728 0,161 A heterozigosidade média esperada foi superior à observada, indicando excesso de homozigotos. As estimativas dos índices de fixação intrapopulacionais (f) foram correspondentemente altas, com média igual a 0,161, confirmando a existência de um nível razoável de endogamia e carência de heterozigotos. A taxa de fecundação cruzada aparente, conforme descrito em Weir (1996), foi igual a 0,723, compatível com a informação disponível na literatura de que o araticum é uma planta preferencialmente alógama, mas que exibe certo grau de autofecundação. Em relação à divergência genética entre as populações (Tabela 4), foi detectado um valor relativamente alto e significativo (θ=0,091), ou seja, 9,1% da variabilidade genética encontra-se entre as populações. A dispersão de sementes de A. crassiflora é realizada principalmente pelo lobo-guará. (Chrysocyon brachiurus), um animal de hábitos alimentares noturnos e que apresenta uma territorialidade de 25 a 30 km. Esse comportamento do dispersor pode justificar a baixa variabilidade genética entre as populações. O índice de fixação observado para o conjunto de populações como um todo (F=0,243) teve magnitude elevada. No caso do araticum é importante observar que, em termos relativos, o processo endogâmico decorre em maior proporção do efeito da deriva genética do que propriamente do sistema de cruzamento predominante nas populações. O

6 padrão de distâncias genéticas obtidas foi representado sob a forma de um dendrograma (Figura1). A correlação cofenética foi alta e significativa (r = 0,818, p<0,0001), indicando uma satisfatória representatividade do dendrograma. Tabela 4. Estimativa dos parâmetros indicadores do grau de estruturação genética de 10 locos SSR em 13 populações naturais de Annona crassiflora do Estado de Goiás. IC 95% - intervalo de confiança (consistência) obtido por bootstrap ao nível de 95% de probabilidade. loco f θ F Acr_01 0,355 0,029 0,374 Acr_10 0,276 0,206 0,426 Acr_19 0,091 0,142 0,220 Acr_20 0,043 0,120 0,082 Acr_22 0,208 0,085 0,276 Acr_34 0,002 0,124 0,126 Acr_37 0,136 0,052 0,181 Acr_44 0,076 0,022 0,097 Acr_26 0,314 0,103 0,385 Acr_33 0,245 0,038 0,274 média 0,167 0,091 0,243 IC 95% 0,089-0,246 0,059-0,126 0,172-0,315 Figura 1.. Dendrograma representativo do padrão de divergência genética observado entre 13 populações de araticunzeiro, expresso em termos de distâncias genéticas de Nei (1972), obtido pelo método de UPGMA. Valores de consistência dos nós obtidos por bootstrap. A análise de agrupamento mostra a formação de quatro grupos de populações: grupo 1 (pop. 5, 6 e 7), grupo 2 (pop. 8, 9 e 10), grupo 3 (pop. 12 e 13) e grupo 4 (pop. 1, 2 e 14). O dendrograma mostrou uma forte tendência das populações se agruparem de acordo

7 com sua localização geográfica, indicando uma forte estruturação da variabilidade genética das populações no espaço geográfico. A ocorrência destes pares sugere a presença de uma barreira geográfica que, a despeito da proximidade das populações, impede a ocorrência de fluxo gênico. Essa barreira pode ser um vale existente na região conhecida como Vão do Paranã. De fato, existe uma rota à esquerda (sentido sul-norte) do Vão do Paranã, e uma rota à direita deste acidente geográfico. É importante considerar que a hipótese de que o Vão do Paranã seja uma barreira geográfica é sustentada pela elevada magnitude da distância genética observada entre populações situadas em margens opostas, em contraposição à baixa distância geográfica entre elas, e ainda, pela reduzida magnitude das distâncias genéticas entre populações situadas em uma mesma margem. Conclusões Existe um elevado nível de variabilidade genética em populações naturais de A. crassiflora do Estado de Goiás e a divergência genética entre as populações está fortemente estruturada no espaço. Os resultados apontam para a ocorrência de dois gradientes de diversidade genética, dispostos no sentido sudoeste-nordeste, isolados em sua porção norte por uma barreira geográfica representada pelo Vão do Paranã. Como estratégia de conservação in situ, baseado na divergência genética entre as populações, os dados sugerem a definição de áreas de reserva que abranjam tanto populações do sudoeste Goiano como populações ao longo do gradiente de diversidade genética que acompanha o Vão do Paranã. Referências bibliográficas AGUIAR, A. V. Emprego de parâmetros moleculares e quantitativos na conservação e melhoramento de Eugenia dysenterica DC f. Tese (Doutorado em Agronomia: Genética e Melhoramento de Plantas) - Escola de Agronomia e Engenharia de Alimentos, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, COLLEVATTI, R. G; GRATTAPAGLIA, D.; HAY, J. D. High resolution microsatellite based analysis of the mating system allows the detection of significant biparental inbreeding in Caryocar brasiliense, and endangered tropical tree species. Heredity, v. 86, p , 2001.

8 FERREIRA, M. E. & GRATTAPAGLIA, D. Introdução ao uso de marcadores moleculares em análise genética. 2 a Ed. Brasília: Embrapa p. GOLDSTEIN, D. & SCHLOTTERER, C. Microsatellites: evolution and applications. Oxford: Oxford University Press, LEWIS, P. O.; ZAINK, D. Genetic Data Analysis: Computer Program for the Analysis of Allelic Data, Version 1.0 (d16c). Disonível em: http//lewis.eeb.uconn.edu/lewishome/software.html RIBEIRO, J. F.; BRITO, M. A.; SCALOPPI JUNIOR, E. J.; FONSECA, C. E. Araticum (Annona crassiflora Mart.). Jaboticabal: Funep, Série Frutas Nativas, n. 12, ZUCCHI, M. I.; BRONDANI, R. P. V.; PINHEIRO, J. B.; COELHO, A. S. G.; CHAVES, L. J.; VENCOVSKY, R. Genetic Structure And gene flow in Eugenia dysenterica DC. in the Brazilian Cerrado utilizing SSR markers. Genetics and Molecular Biology, v. 26, p , 2003.