Introdução. Izeni Pires Farias *

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1 Avaliação da variabilidade genética das populações de Arapaima Gigas (pirarucu) da bacia Amazonica atra vés de genes do DNA mitocondrial e marcadores moleculares de microssatélites Izeni Pires Farias

2 AVALIAÇÃO DA VARIABILIDADE GENÉTICA DAS POPULAÇÕES DE ARAPAIMA GIGAS (PIRARUCU) DA BACIA AMAZONICA ATRA VÉS DE GENES DO DNA MITOCONDRIAL E MARCADORES MOLECULARES DE MICROSSATÉLITES Izeni Pires Farias * Introdução O pirarucu (Arapaima gigas) há anos vem sendo explorado comercialmente, e a evidencia de uma sobre pesca já existe desde os anos de Arapaima é citado na Lista Vermelha das espécies ameaçadas (IUCN - Intemational Union for Conservation of Nature and Natural Resources) dentro da categoria de "Data Deficient", o que caracteriza uma espécie que necessita ser melhor estudada para que possa ser definida a sua apropriada posição. Tal categoria evidencia que apesar de ser explorado comercialmente há muito& anos, ainda existe urna grande falta de conhecimento sobre esta espécie. Urna vez que a variabilidade genética é um dos importantes critérios da biodiversidade que a IUCN recomenda para a conservação das espécies (McNeely et al., 1990), e necessário proteger a variabilidade genética das espécies ameaçadas, urna vez que a mesma é o material para as mudanças evolutivas, e permite as populações evoluírem resposta as mudanças ambientais. A perda da variabilidade genética (heterozigosidade) torna as populações susceptíveis a doenças, e a extinção. O primeiro Workshop sobre pirarucu (Workshop Pirarucu Belém, Pará), foi uma das primeiras tentativas de se organizar um grande grupo de trabalho interinstitucional para o estudo dos diferentes aspectos da biologia, manejo e piscicultura desta espécie. O que ficou claro durante este workshop foi a total falta de informação sobre a estrutura das populações, o nível de variabilidade genética das populações, e mesmo se Arapaima era composto por uma ou duas espécies. Desta forma o presente trabalho tem como objetivos principais: Caracterizar a variabilidade e a estrutura genética das populações Arapaima gigas (naturais e de cativeiro) através de marcadores moleculares do DNA mitocondrial e de microssatélites. Utilizar os marcadores moleculares de microssatélites para testes de paternidade. Desenvolver marcadores sexuais. Contribuir para as decis5es de conservação e manejo. Tal abordagem visa produzir instrumentos para a conservação e uso sustentado dos pirarucus na Bacia Amazónica, através do estabelecimento de marcadores moleculares para avaliação da variabilidade genética populacional de estoques naturais e de cativeiro. * Universidade Federal do Amazonas 149

3 Izeni Pires Farias Resultados Primeira Fase do Projeto Genética das populações de Arapaima obtidos através de genes do DNA mitocondrial A primeira fase do projeto incluiu amostras de Arapaima de 10 populações naturais provenientes dos rios da Bolívia, Peru, e da Amazónia (Figura 1). O sequencimento de genes do DNA mitocondrial resultou em aproximadamente 2000 pares de bases usadas para as análises genéticas. Foram observados um total de 21 haplótipos do DNA mitocondrial (mtdna) que podem ser visualizados na Figura 2. Figura 1. Locais de coleta das amostras de Arapaima gigas. Para esses primeiros resultados podemos confirmar que: (i) Arapaima é um gênero composto por apenas urna única espécie; (ii) não existe urna estrutura geográfica, sugerindo que estamos lidando com apenas urna única população panrnítica; (iii) não existe nenhuma associação entre a distancia genética e a distancia genética (Mantel test); (iv) a taxa de migração, ou seja, vagilidade dos indivíduos é grande; (v) a maior variabilidade genética é encontrada nas regiões longe dos grandes centros urbanos, corno a reserva biológica Mamirauá e a população do Rio Tocantins; e (vi) algumas populações apresentam-se geneticamente depauperadas (baixa variabilidade genética). Todos os resultados desta primeira fase poderão ser encontrados no artigo de Hrbek et al.,

4 AVALIAÇÃO DA VARIABILIDADE GENÉTICA DAS POPULAÇÕES DE ARAPAIMA GIGAS (PIRARUCU) DA BACIA AMAZONICA ATRA VÉS DE GENES DO DNA MITOCONDRIAL E MARCADORES MOLECULARES DE MICROSSATÉLITES Figura 2. Network dos haplótipos presentes nas amostras de A. gigas. O tamanho dos círculos é proporcional ao número de indivíduos que apresentam o haplótipo. Segunda Fase do Projeto Genética das populações de Arapaima obtidos através de marcadores moleculares de microssatélites A segunda etapa do projeto deu-se pelo desenvolvimento de marcadores moleculares de microssatélites (DNA nuclear) específicos para Arapaima gigas. Microssatélites são segmentos de DNA nuclear repetitivo, altamente polimórficos e principalmente codominantes, o que os torna especiais para estudos em nível populacional, individual, bem como na determinação de paternidade. Os microssatélites, conforme o tipo de repetição, podem ser de quatro tipos: Mononucleotídeos Dinucleotídeos Trinucleotídeos Tetranucleotídeos TGCATTGAAAAAAAAAAAAAAACTGGATC TGCATTGTATATATATATATATACTGGATC TGCATTGTGATGATGATGATGACTGGATC TGCATTGTGACTGACTGACTGACCTGGATC 151

5 Izeni Pires Farias Os microssatélites do tipo "dinucleotídeos" são os mais preferidos por serem caracterizados como os mais polimórficos. Um total de 14 microssatélites foram desenvolvidos para Arapaima gigas (Farias et al., 2003) e sua caracterização, bem como os principais parâmetros para a indicação dos níveis de variabilidade genética dentro das populações podem ser visualizados na Tabela 1 e 2, respectivamente. Tabela 1. Características dos 14 locos de microssatélites analizados para 127 indivíduos de A. gigas de todas as localidades amostradas. Loco Tipo de repetição Tamanho do fragmento em pares de bases No. de alelos Heterozigosidade Observada (Ho) Heterozigosidade Esperada (He) CTm1 (GT) 3 (CT) CTm3 (CT) CTm4 (CT) CTm5 (CT) CTm7 (CT) CTm8 (CT) 5 AT(CT) 5 AT(CT) 4 TA(CA) 13 (CT) CAm2 (CA) CAm4 (CA) CAm13 (GTA) 2 (CA) CAm15 (CA) CAm16 (CA) CAm18 (GA) 2 (CA) 9 CTCACT (CA) CAm20 (CA) CAm26 (CA) Comparando os resultados obtidos através dos Microssatélites com os obtidos pelo mtdna, podemos concluir que tais resultados confirmam os primeiros com muito mais evidencias, isso porque os microssatélites, por serem mais polimórficos, podem detectar uma maior variabilidade. Os principais resultados obtidos através dos microssatélites são: As populações não são totalmente homogêneas ao longo do Rio Amazonas, existindo uma estruturação geográfica causada pelo isolamento por distancia (Mantel teste); A taxa de indivíduos migrantes entre as populações é alta, com um gradiente de fluxo gênico entre as populações, por exemplo, as populações de Iquitos e Letícia são mais semelhante entre si do que as de Macapá e Marabá. Algumas populações estão geneticamente depauperadas (baixa variabilidade genética), como por exemplo as de Macapá (Tabela 2); Algumas populações sofreram recentemente uma redução no tamanho (efeito "gargalo-de-garrafa" - bottleneck) causada provavelmente pela sobrepesca nesta espécie que ocorre há mais de um século. 152

6 AVALIAÇÃO DA VARIABILIDADE GENÉTICA DAS POPULAÇÕES DE ARAPAIMA GIGAS (PIRARUCU) DA BACIA AMAZONICA ATRA VÉS DE GENES DO DNA MITOCONDRIAL E MARCADORES MOLECULARES DE MICROSSATÉLITES Tabela 2. Principais parâmetros genéticos obtidos pelas análises dos microssatélites. Áreas amostradas N Média da Diversidade Genica No. de Alelos Média da Ho He Locus Monomórficos Valor de M Valor de P Iquitos ± CTm Letícia ± CAm Mamirauá ± Manaus ± Santarém ± Macapá ± CAm4, CAmI6, CAm Marabá ± N= número de indivíduos; M = índice estatístico que indica se urna população sofreu recentemente urna redução no tamanho (bottleneck); P= probabilidade de que a população não sofreu urna redução no tamanho (P<0.05 significa que a população sofreu urna redução no tamanho). Nossos resultados são fortemente preocupantes com respeito a perda da variabilidade genética nas populações naturais de pirarucu. Estas populações naturais necessitam ser conservadas em tamanho suficiente para a manutenção da diversidade genética e assim minimizar o risco de extinção. Entretanto, vários aspectos nos mostram que Arapaima tem um grande potencial para recuperação: O alto fluxo gênico e também urna relativa alta vagilidade observada no presente estudo permite uma recolonizarão em áreas de sobrepesca, através de indivíduos migrantes; A Identificação futura de populações naturais com maior variabilidade genética, e o fácil manejo, em cativeiro e em reservas biológicas, permitirá a possibilidade da criação de um sistema de monitoramento e manejo das populações naturais. As estapas da utilização dos marcadores moleculares de microssatélites para testes de paternidade, bem como o desenvolvimento de marcadores sexuais para Arapaima gigas, encontram se em andamento. Esperamos, desta forma, que os presentes resultados possam servir como urna contribuição para um futuro plano de conservação e manejo dos pirarucus da Amazónia. Agradecimentos Tomas Hrbek (Washington University, EUA), Iracilda Sampaio (UFPA), Marcelo Crossa (IPAM), Axel Meyer (University of Konstanz, Alemanha), Jorge Porto (INPA), Leandro Castelo (Projeto Mamirauá) Juan Carlos Alonso, Liliana George, Diana Figueredo, e Dr. Elineide Marques. 153

7 Izeni Pires Farias Suporte Financeiro EMBRAP A (PRODETAB), CNPq (Brasil) Universidade Federal do Pará - UFP A - (Brasil), IPAM/World Wide Fund for Nature (WWF-UK) / Overseas Development Administration (ODA) Universidad e de Konstanz (Alemanha) Universidade Federal do Amazonas (Brasil) National Science Foundation (EUA) AECI - Espanha/CNPq Referências Farias IP, Hrbek T, Brinkmann H, Sampaio I, Meyer A (2003) Characterization and isolation of DNA microsatellite primers for Arapaima gigas, an economically important but severely over-exploited fish species of the Amazon basin. Molecular Ecology Notes 3, Hrbek T, Farias IP, Crossa M, et al. (2003) Population genetic structure of Arapaima gigas, world's biggest freshwater fish: implications for conservation. Conservation Genetics accepted. McNeely JA, Miller KR, Reid WV, Mittermeier RA, Wemer TB (1990) Conserving the world's biological diversity World Conservation Union, World Resources Institute, Conservation International, World Wildlife Fund-US and the World Bank, Washington, D.C. 154

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9 AVALIAÇÃO DA VARIABILIDADE GENÉTICA DAS POPULAÇÕES DE ARAPAIMA GIGAS (PIRARUCU) DA BACIA AMAZONICA ATRA VÉS DE GENES DO DNA MITOCONDRIAL E MARCADORES MOLECULARES DE MICROSSATÉLITES Primera edición digital Mayo, 2015 Lima - Perú Izeni Pires Farias ROYECTO LIBRO DIGITAL PLD 1830 Editor: Víctor López Guzmán guzlopster@gmail.com facebook.com/guzlop twitter.com/guzlopster Lima - Perú